一例孔雀大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)分析

李佳璇 王洪利 亓愛杰 孫圣福 藺曉月 邢林林 王苗利 陳靜

摘? 要：2018年12月份，濱州市某孔雀養(yǎng)殖場(chǎng)的部分孔雀出現(xiàn)了咳嗽、腫臉、糞便發(fā)綠發(fā)黑等情況，場(chǎng)主給發(fā)病孔雀用了多種抗生素，療效均不明顯，且該場(chǎng)孔雀自首例發(fā)病已兩個(gè)月，累計(jì)死亡20多只，還有100只正在發(fā)病，基本都是小孔雀。實(shí)驗(yàn)室接到病例后立即采樣，進(jìn)行病毒PCR檢測(cè)、細(xì)菌分離純化培養(yǎng)、生化鑒定和藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示禽流感、新城疫、傳染性支氣管炎均為陰性，僅分離到大腸桿菌，藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示該大腸桿菌敏感的藥物為頭孢類藥物，根據(jù)此結(jié)果指導(dǎo)該場(chǎng)臨床科學(xué)用藥，取得了良好的治療效果。

關(guān)鍵詞：孔雀;大腸桿菌;細(xì)菌分離鑒定;藥敏分析;耐藥性;臨床用藥

中圖分類號(hào)：S858.39???? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：C???? 文章編號(hào)：1673-1085（2020）3-0043-04

大腸桿菌（Escherichia coli），又稱大腸埃希菌，為兩端鈍圓的短桿菌，是革蘭氏陰性菌，無芽孢，大多數(shù)大腸桿菌菌株有莢膜或微莢膜結(jié)構(gòu)，多數(shù)有菌毛[1]。大腸桿菌正常寄居于動(dòng)物腸道中，但其中小部分可在一定條件下致病，如在動(dòng)物體免疫力下降時(shí)，主要是由特定的菌毛抗原等感染引起人或動(dòng)物胃腸道疾病，此外，還可引起尿道感染、關(guān)節(jié)炎等[2]。

當(dāng)禽類機(jī)體防御能力下降時(shí)，常引起繼發(fā)性局部或全身感染。禽致病性大腸桿菌是危害養(yǎng)禽業(yè)的重要病原。該病原能夠引起禽類多種腸道和體外疾病，還能夠引起雞與鴨的敗血癥、氣囊炎和腹膜炎，以及鵝的生殖器官感染等，造成肉禽質(zhì)量降低，蛋禽產(chǎn)蛋下降，給養(yǎng)禽業(yè)帶來嚴(yán)重的損失[3]。

1? 臨床調(diào)查情況

2018年12月份，濱州市某孔雀養(yǎng)殖場(chǎng)部分孔雀出現(xiàn)了咳嗽、腫臉、糞便發(fā)綠發(fā)黑的情況，畜主給病禽使用過泰樂菌素、泰妙菌素、氟苯尼考、替米考星等抗生素，效果均不明顯。該孔雀養(yǎng)殖場(chǎng)已發(fā)病2個(gè)月，死亡了20多只，還有100只孔雀正在發(fā)病，但是種孔雀基本正常，發(fā)病死亡的均為小孔雀。經(jīng)過進(jìn)一步了解，該場(chǎng)孔雀平均年產(chǎn)蛋為30枚/只，孵化需28d，孵化率為70%，孔雀每天吃100g飼料。實(shí)驗(yàn)室接到孔雀場(chǎng)主送來的死孔雀樣本后，立即采樣，用肝臟和肺臟作為樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

2? 試驗(yàn)材料與方法

2.1? 主要材料

2.1.1? 主要儀器設(shè)備? 羅氏熒光定量PCR儀，科馬嘉顯色培養(yǎng)基，奧林巴斯顯微鏡，移液器（0～300μl），梅里埃生化及藥敏儀VITECⅡcompact60，生物安全柜。

2.1.2? 試劑盒? 禽傳染性支氣管炎病毒（AIBV）核酸檢測(cè)試劑盒（熒光-PCR法），購自廣州維伯鑫生物科技有限公司;禽流感病毒病原熒光PCR檢測(cè)試劑盒，購自北京森康生物技術(shù)開發(fā)有限公司;雞新城疫病毒熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒，購自哈爾濱國生生物科技股份有限公司。

2.1.3? 主要試劑? 梅里埃生化鑒定卡片，梅里埃藥敏鑒定卡片，營養(yǎng)瓊脂，革蘭氏染色液，酒精，碘酊，0.45%氯化鈉溶液。

2.2? 試驗(yàn)方法

2.2.1? 病毒檢測(cè)? 將病料剪下一小塊，研磨，加入PBS緩沖液，放于離心管內(nèi)，在離心機(jī)內(nèi)轉(zhuǎn)速8000r/s離心2min。在生物安全柜內(nèi)操作，取上清液加入到深孔板中，用羅氏自動(dòng)核酸提取儀提取核酸。根據(jù)試劑盒使用說明配置反應(yīng)液，將核酸與反應(yīng)液混合，放入羅氏熒光定量PCR儀，根據(jù)試劑盒說明書設(shè)定PCR循環(huán)參數(shù)，1h后讀取結(jié)果。

2.2.2? 病料接種與培養(yǎng)? 點(diǎn)燃酒精燈，無菌環(huán)境操作，取病變較為嚴(yán)重的肝臟作為接種病料，選取病變部位和健康部位交界處，表面用酒精棉球和碘酊棉球消毒三遍，取小剪刀，先于酒精燈上燒烙，然后在病料表面按壓，使剪刀降溫。接著在選定好的區(qū)域內(nèi)剪開一個(gè)小口，用無菌棉棒伸到小口中蘸取病料，使用三劃線法，于顯色培養(yǎng)基上劃線接種，注意每劃一次線就要更換一次無菌棉棒。接種完成后，將培養(yǎng)基倒置，放于志賀氏厭氧培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24h。

2.2.3? 細(xì)菌的染色及鏡檢? 在潔凈的載玻片上滴一滴清水，用接種環(huán)挑取顯色培養(yǎng)基上的菌落溶解于載玻片上的清水中，置于酒精燈上進(jìn)行加熱固定，此步驟注意溫度不可過熱，固定好后進(jìn)行革蘭氏染色，染色步驟為：初染用草酸銨結(jié)晶紫溶液染色1.5min，用溫和的水流沖洗;媒染用革蘭氏碘液染色1.5min，用溫和的水流沖洗;脫色用95%的乙醇溶液脫色45s，用溫和的水流沖洗;復(fù)染用復(fù)紅溶液染色20s，用溫和的水流沖洗。將載玻片自然晾干或置于酒精燈上微微加熱烤干，將松柏油滴加在染色區(qū)域內(nèi)，置于100倍油鏡下觀察。

2.2.4? 細(xì)菌的分離及純化培養(yǎng)? 根據(jù)顯色培養(yǎng)結(jié)果及鏡檢結(jié)果，用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落，在營養(yǎng)瓊脂平板上劃線接種，將平板倒置，放于志賀氏厭氧培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24h。

2.2.5? 生化鑒定及藥敏分析? 觀察純化結(jié)果，營養(yǎng)瓊脂平板放入生物安全柜，根據(jù)革蘭氏染色結(jié)果選擇合適的生化鑒定卡片和藥敏分析卡片，準(zhǔn)備無菌棉棒若干，配好的0.45%氯化鈉溶液一瓶，小試管兩支置于生物安全柜中。開始制備菌懸液，在卡架上放上兩支小試管，各加入無菌0.45%氯化鈉溶液3ml，用無菌棉棒挑取純化培養(yǎng)的單菌落于氯化鈉溶液中接種，使其濃度保持在0.56～0.83Mc，插入生化鑒定卡片。用移液器吸取接種好的菌懸液145μl，接種到新的裝有0.45%氯化鈉的小試管中，抽吸均勻，并插入藥敏分析卡片，上機(jī)，待18h后讀取結(jié)果。

3? 結(jié)果與分析

3.1? 病毒檢測(cè)結(jié)果? 根據(jù)羅氏熒光定量PCR儀給出的圖像以及ct值結(jié)果，我們可以得知，雞傳染性支氣管炎、禽流感和新城疫檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

3.1? 病料接種及培養(yǎng)結(jié)果? 將顯色平板從志賀氏厭氧培養(yǎng)箱中取出，可以觀察到平板上有一種粉紫色菌落生長(zhǎng)。

3.2? 細(xì)菌的染色及鏡檢結(jié)果? 通過100倍油鏡觀察革蘭氏染色結(jié)果，觀察到紅色、兩端鈍圓的短桿菌，為革蘭氏陰性桿菌。

3.3? 細(xì)菌生化鑒定及藥敏分析結(jié)果? 根據(jù)以上結(jié)果，選擇GN生化鑒定卡片和GN13藥敏分析卡片，將卡片裝備在已經(jīng)接種好的菌懸液中，放入生化及藥敏儀，經(jīng)過18h的生化鑒定及藥敏分析，得出生化鑒定結(jié)果及敏感藥物，其生化鑒定結(jié)果見表1，藥敏分析結(jié)果見表2。

根據(jù)表1可得出，該生化鑒定結(jié)果符合大腸桿菌生化圖譜，鑒定結(jié)果為大腸桿菌，是置信度好的鑒定結(jié)果，其符合率是91%。

根據(jù)表2中MIC血藥濃度及其解釋可得出，該孔雀養(yǎng)殖場(chǎng)的大腸桿菌的敏感藥物為厄他培南和頭孢類藥物，首選藥物是頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟，可以交替或混合使用，避免產(chǎn)生耐藥性。

4? 討論

病毒檢測(cè)和細(xì)菌分開鑒定結(jié)果顯示：該孔雀養(yǎng)殖場(chǎng)是單一大腸桿菌感染引起的疾病。結(jié)合藥敏試驗(yàn)以及MIC血藥濃度值可以得出頭孢類藥物是治療此孔雀場(chǎng)大腸桿菌病的首選藥物，并且要控制血藥濃度，防止抗生素濫用?？紤]到細(xì)菌可能會(huì)出現(xiàn)耐藥性，建議該孔雀場(chǎng)場(chǎng)主將頭孢他啶等藥物混合或交替使用。大腸桿菌可以在機(jī)體抵抗力下降時(shí)引起動(dòng)物體發(fā)病[2]，還與養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)環(huán)境密切相關(guān)，因此建議該養(yǎng)殖場(chǎng)場(chǎng)主注意養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)衛(wèi)生，及時(shí)清理糞便及病死孔雀的尸體，進(jìn)行無害化處理，舍內(nèi)、外定期消毒，注意通風(fēng)，注意孔雀飼料及飲水健康，強(qiáng)化孔雀場(chǎng)的科學(xué)管理，嚴(yán)格管控場(chǎng)內(nèi)飼養(yǎng)人員及外來人員流動(dòng)，防止外部人員將病菌帶入場(chǎng)內(nèi)。近年來，大腸桿菌的耐藥圖譜不斷擴(kuò)大，呈現(xiàn)多重耐藥趨勢(shì)[4]，因此，對(duì)于大腸桿菌病

最好的防控措施為預(yù)防，科學(xué)合理地管理養(yǎng)殖場(chǎng)，改善飼養(yǎng)環(huán)境，從而減少大腸桿菌感染。若出現(xiàn)大腸桿菌感染，要及時(shí)送檢，在實(shí)驗(yàn)室診斷和藥敏分析結(jié)果的指導(dǎo)下，科學(xué)地、合理地臨床用藥。

參考文獻(xiàn)：

[1]? 陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué)[M].第5版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2016：94-95.

[2]? 殷澤祿，萬虎.大腸桿菌的研究綜述[J].甘肅畜牧獸醫(yī)，2019（5）：33-35.

[3]? 王怡平，孫暢，趙麗麗，陳洪巖.鑒別禽致病性大腸桿菌與禽非致病性大腸桿菌的多重PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2018，48（11）：1358-1364.

[4]? 王影，李欣南.大腸桿菌耐藥性產(chǎn)生與傳播機(jī)制研究現(xiàn)狀[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2016，（1）：32-36.

基金項(xiàng)目：山東省家禽產(chǎn)業(yè)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)：SDAIT-11-13。

通訊作者：王苗利，（1987.07-），中級(jí)獸醫(yī)師，主要從事動(dòng)物疫病檢測(cè)、流行病學(xué)、環(huán)境微生物方向的工作，E-mail：wangmiaoli1987711@163.com;并列通訊作者：陳靜（1968-），研究員，山東省家禽產(chǎn)業(yè)體系省綜合試驗(yàn)站站長(zhǎng)，主要從事動(dòng)物疫病快速診斷、疑難病癥確診、疫情監(jiān)測(cè)和疫病普查、動(dòng)物流行病學(xué)調(diào)查、實(shí)驗(yàn)室管理、獸醫(yī)新技術(shù)培訓(xùn)與推廣及實(shí)用防治技術(shù)研究等工作，E-mail：1752058646@qq.com。