用高內(nèi)涵分析技術(shù)初探絨毛訶子肝毒性物質(zhì)基礎(chǔ)

王晨曉,王志斌,馬貝貝,婁天宇,王子健

(北京中醫(yī)藥大學(xué) 1. 中藥藥理系，北京 100102， 2. 北京中醫(yī)藥研究院，北京 100029)

訶子為使君子科植物訶子(TerminaliachebulaRetz.)或絨毛訶子(TerminaliachebulaRetz. var.tomentellaKurt.)的干燥成熟果實(shí)[1]，是蒙藥、藏藥等民族藥的常用藥，在藏藥中的地位，類似于甘草在中藥中地位，其在藏藥中有“藏藥之王”的美稱。訶子藥性溫和，屬收澀藥，有澀腸止瀉、斂肺止咳、降火利咽的功效，臨床上用于治療脫肛、肺虛咳喘、咽喉腫痛，也是治療失音之要藥；現(xiàn)代研究對(duì)訶子的藥理學(xué)作用多有涉及，但毒性學(xué)研究卻鮮有報(bào)道。課題組前期通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，確定絨毛訶子的肝毒性，通過小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)得出，絨毛訶子水煎液的半數(shù)致死量(median lethal dose，LD50)LD50為18.926 g生藥·kg-1BW，絨毛訶子水煎液的LD50是70 kg人最大日用量的147.8倍。綜合分析血清生化與病理等指標(biāo)，絨毛訶子的急性毒性與蓄積毒性的作用靶器官為肝臟。為了保障中藥的臨床安全用藥，迫切需要明確訶子致肝毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此，采用一種高效、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)的體外細(xì)胞毒性檢測(cè)方法對(duì)于藥物早期篩選及上市后藥物安全性再評(píng)價(jià)都具有重要意義。

高內(nèi)涵分析技術(shù)(high content screening，HCS)擁有自動(dòng)定量細(xì)胞成像系統(tǒng)(thermo scientific toxInsight IVT平臺(tái))，熒光試劑標(biāo)記特定的靶點(diǎn)，優(yōu)化的分析和成像方案被廣泛應(yīng)用于中藥復(fù)雜的毒性成分和活性成分篩選及藥物潛在毒性篩選。利用熒光染液對(duì)相應(yīng)靶點(diǎn)的特異性染色，用高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析平臺(tái)和藥物性肝傷分析平臺(tái)聯(lián)合考察4種單體成分對(duì)人源肝癌細(xì)胞HepG2的毒性作用，可以篩選出絨毛訶子中的單體對(duì)細(xì)胞形態(tài)、復(fù)制、周期、轉(zhuǎn)錄、翻譯、凋亡等方面的影響[2]。本實(shí)驗(yàn)通過用人源肝癌細(xì)胞HepG2進(jìn)行高內(nèi)涵肝毒性篩選試驗(yàn)，因?yàn)镠epG2細(xì)胞背景清晰，表型、性狀穩(wěn)定，來源于人肝胚細(xì)胞瘤，分化程度較高，其所含的生物轉(zhuǎn)化代謝酶活性穩(wěn)定且與人體尋常肝細(xì)胞同根同源。肖珠[3]用HepG2細(xì)胞和人正常肝細(xì)胞L02細(xì)胞進(jìn)行高內(nèi)涵肝毒性的方法學(xué)考察，對(duì)其結(jié)果進(jìn)行綜合統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)HepG2細(xì)胞數(shù)量是2×105個(gè)/mL，是較合適的肝臟毒性篩選模型。

高內(nèi)涵分析技術(shù)主要通過分析圖像中各個(gè)指標(biāo)的熒光強(qiáng)度，從而檢測(cè)細(xì)胞核的形態(tài)和數(shù)目、核酸是否有損傷、DNA含量的變化、谷胱甘肽(glutathione，GSH)水平降低的變化、細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度、活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)含量、線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)指標(biāo)等有關(guān)指標(biāo)，并且根據(jù)陰性藥阿司匹林的反應(yīng)值確定毒性閾值。通過比對(duì)受試藥反應(yīng)值與毒性閾值的關(guān)系，確定其肝毒性風(fēng)險(xiǎn)[2-5]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞人肝癌細(xì)胞系 HepG2細(xì)胞，置于北京藥檢所藥理室實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫(kù)(-196 ℃)保存,購(gòu)自中國(guó)細(xì)胞庫(kù)(上海)。

1.1.2藥物與試劑 沒食子酸(批號(hào):PRF9012344)；苯甲酸(批號(hào):PRF9112842)；莽草酸(批號(hào):PRF9112843)；1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖(批號(hào):PRF9101104)；噻氯吡啶(ticlopidine，批號(hào):101296953，Sigma公司)，陰性對(duì)照阿司匹林(aspirin，批號(hào):00209，Dr. Ehrenstorfer GmbH公司)；Ⅰ型膠原蛋白包被的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板 (BD BioCoatTMPlate Product N0.354407，批號(hào)34217010)；DMEM(dulbecco′s modified eagle media)培養(yǎng)基(批號(hào):1719980，Gibco公司)；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(批號(hào):1739464，Gibco公司)；青鏈霉素(批號(hào):1780186，Gibco公司)；胰蛋白酶(批號(hào):1742078，Amresco公司)；DMSO(批號(hào):19947100813，默克股份有限公司)； PBS緩沖液(批號(hào)：20190629)；0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液(批號(hào):1189952，Invitrogen公司)；95%乙醇試劑(山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司)。MitoTrackerTMOrange CMTMRos-Special Packaging Reduced rosamine MitoTraacher probes(批號(hào)：1985376)；CellROXTMGreen Reagent，for oxidative stress detection(批號(hào)：2018177)；Hoechst 33342 Trihydrochloride(批號(hào)：2048155)；Thiol-Reactive Probes Reactive dye(lyophilized solids)(批號(hào)：211582)。

1.1.3主要儀器 Thermso Scientific Cellomics，(美國(guó))；NSF-1389-A2生物安全柜；Olympus 1 X71生物顯微鏡；Thermo 311 CO2培養(yǎng)箱；Invitrogen全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀；SN510C立式壓力蒸汽滅菌器。

1.1.4對(duì)照品溶液及工作曲線的制備 在無菌環(huán)境中配制，根據(jù)Thermo Scientific Toxlnsight Drug Induced Liver Injury Assay 的指導(dǎo)手冊(cè)中推薦的對(duì)照品加樣濃度，陰性對(duì)照阿司匹林的最大血藥濃度(Cmax)為0.995 mg·L-1，陽(yáng)性對(duì)照品噻氯吡啶的Cmax為2.13 mg·L-1，用不含血清的DMEM培養(yǎng)基將對(duì)照品配成200、100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56Cmax共8個(gè)濃度。

1.1.5供試品的配制 取沒食子酸(t1)，苯甲酸(t2)，莽草酸(t3)，1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖(t4)，在無菌EP管內(nèi)，用不含血清的DMEM培養(yǎng)基配制成500、125、62.5、31.25、15.62、7.81、3.91 mg·L-1共8個(gè)濃度的待測(cè)物溶液。

1.2 方法

1.2.1HepG2細(xì)胞的復(fù)蘇與傳代培養(yǎng) 將儲(chǔ)存在實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫(kù)(-196 ℃)的HepG2細(xì)胞，迅速取出，放入提前保溫的37 ℃水浴鍋中，注意水位線，避免液面污染。將融化的細(xì)胞凍存液將其移入15 mL滅菌離心管中，加入37 ℃ 10 mL的DMEM完全培養(yǎng)基(15%的胎牛血清 (FBS，V/V)，100 U·mL-1的青鏈霉素)，700 r·min-1離心9 min，吸出上清，加入5 mL完全培養(yǎng)基，吹打均勻，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。細(xì)胞每隔3 d進(jìn)行一次1 ∶3的傳代，傳代時(shí)，棄掉原培養(yǎng)液，再用PBS緩沖溶液沖洗2次后，加入0.25%胰酶2 mL消化約30 s，棄去胰酶，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)消化約3 min，觀察細(xì)胞是否脫離培養(yǎng)瓶壁，之后加入2～3 mL的DMEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行吹打，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞相互分散，吹打均勻。再將細(xì)胞混懸液分裝至若干個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入5～8 mL的DMEM完全培養(yǎng)基，輕輕吹打均勻，在37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞鋪板與加樣 在倒置顯微鏡下觀察，將處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，棄去原培養(yǎng)液，用PBS洗2～3次，吸取殘留的PBS，加入0.25%胰酶2 mL消化30 s，棄去胰酶，放在37 ℃，5% CO2的環(huán)境中繼續(xù)讓胰酶反應(yīng)約3 min。加入2～3 mL的DMEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行吹打，使細(xì)胞均勻分散開。取吹打均勻的10 μL細(xì)胞混懸液，加入10 μL 0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液混勻，取混合均勻的混合液10 μL加入到計(jì)數(shù)板中，經(jīng)全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)后。用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL,以100 μL/孔接種到I型膠原蛋白包被的96孔板中，在37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。24 h后，將I型膠原蛋白包被的96孔板棄去原培養(yǎng)液，每孔分別加入含有不同濃度的不同藥物(沒食子酸，苯甲酸，莽草酸，1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖)。橫向設(shè)置3個(gè)平行孔為同一濃度，每個(gè)藥物的最大濃度為500 mg·L-1，依次倍比稀釋，最低給藥濃度為3.91 mg·L-1。實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性對(duì)照阿司匹林、陽(yáng)性對(duì)照噻氯吡啶和溶媒對(duì)照，設(shè)置8個(gè)濃度。加樣結(jié)束后，將96孔板在37 ℃，5% CO2條件下，培養(yǎng)24 h。

1.2.3染色 按試劑盒說明書的要求，藥物加入細(xì)胞24 h后，取出I型膠原蛋白包被的96孔板，棄去原藥液，之后將避光放置的染液，以100 μL/孔避光加入到培養(yǎng)板內(nèi)，37 ℃條件下孵育45 min。45 min后，將I型膠原蛋白包被的96孔板內(nèi)染液小心吸去(不要接觸板孔內(nèi)壁)，再加入放置室溫的PBS緩沖溶液，吸出，最后每孔中加入100 μL PBS，即可上機(jī)檢測(cè)。

1.2.4ToxInsight IVT平臺(tái)成像與分析與預(yù)測(cè) 在ToxInsight IVT平臺(tái)上自動(dòng)獲取熒光標(biāo)記的細(xì)胞的圖像，以檢測(cè)不同的熒光標(biāo)記的細(xì)胞靶點(diǎn)，然后通過Cellomics Compartmental Analysis BioApplication進(jìn)行存儲(chǔ)和自動(dòng)分析。采用ToxInsight IVT平臺(tái)的采集圖像。

第一通道通過測(cè)量圖像中的細(xì)胞數(shù)量來計(jì)算細(xì)胞密度和細(xì)胞損失。通過用DNA染色測(cè)量每個(gè)細(xì)胞核區(qū)域中DNA探針(Hoechst 33342)的總整合熒光強(qiáng)度來監(jiān)測(cè)核DNA含量。第二通道GSH水平的降低是通過利用細(xì)胞可滲透的還原型熒光谷胱甘肽指示劑對(duì)細(xì)胞質(zhì)區(qū)域中的總熒光強(qiáng)度進(jìn)行積分測(cè)定。第三通道通過對(duì)每個(gè)細(xì)胞核區(qū)域中由熒光ROS染料染色產(chǎn)生的總熒光強(qiáng)度進(jìn)行積分，可以對(duì)ROS水平進(jìn)行定量。 第四通道用對(duì)線粒體膜電位變化敏感的探針，并通過測(cè)量該探針在核和細(xì)胞質(zhì)區(qū)域之間的積分熒光強(qiáng)度差異，檢測(cè)MMP變化。

對(duì)采集的圖像進(jìn)行分析，將獲得的定量多參數(shù)細(xì)胞靶數(shù)據(jù)導(dǎo)入到ToxInsight DILI檢測(cè)分析模板，以確定目標(biāo)化合物是否具有肝毒性，并根據(jù)其多參數(shù)反應(yīng)的強(qiáng)度對(duì)其進(jìn)行排名，通過檢測(cè)樣品對(duì)結(jié)構(gòu)和功能完整細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡、形態(tài)及代謝的影響，從而確定化合物的潛在毒性及相關(guān)藥物的生物活性[5]。

2 結(jié)果

2.1 陰性對(duì)照閾值的確定如Fig 1和Fig 2所示，陽(yáng)性藥噻氯吡啶5個(gè)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，隨著濃度的一系列變化，5個(gè)指標(biāo)都超出其安全閾值范圍。結(jié)果表明陽(yáng)性藥噻氯吡啶對(duì)HepG2細(xì)胞增殖有抑制作用，具有明顯的肝毒性風(fēng)險(xiǎn)。如Fig 1所示，陰性藥阿司匹林隨著濃度變化，5個(gè)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果均為陰性。表明阿司匹林對(duì)HepG2細(xì)胞在細(xì)胞數(shù)目、DNA含量、GSH降低水平、ROS含量及MMP改變5個(gè)指標(biāo)均在安全閾值范圍內(nèi)，阿司匹林對(duì)HepG2細(xì)胞無毒性作用，無肝毒性風(fēng)險(xiǎn)。這兩個(gè)藥物的結(jié)果與其前期文獻(xiàn)報(bào)道相一致，因此表明本實(shí)驗(yàn)所采用的方法及操作準(zhǔn)確。

2.2 樣品高內(nèi)涵分析結(jié)果如Fig 3所示，沒食子酸有4個(gè)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，在Fig 4中，① 第一通道細(xì)胞核內(nèi)的熒光數(shù)目反映了HepG2細(xì)胞數(shù)目的變化，細(xì)胞數(shù)目只有下限閾值。② 第一通道細(xì)胞核內(nèi)的熒光強(qiáng)度反映了HepG2細(xì)胞核中DNA含量的變化，沒食子酸和噻氯吡啶與陰性對(duì)照阿司匹林相比，數(shù)量有明顯差異，細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞出現(xiàn)皺縮，發(fā)生細(xì)胞凋亡。③ 第二通道細(xì)胞質(zhì)中的熒光強(qiáng)度反映了GSH降低水平, 1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖與陰性對(duì)照阿司匹林相比，可以看到熒光強(qiáng)度減弱，GSH含量降低明顯。④ 第三通道細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度反映了ROS含量的變化，ROS只有上限閾值，沒食子酸的第三通道熒光強(qiáng)度與阿司匹林相比，明顯變?nèi)酢＂?第四通道細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中的熒光強(qiáng)度的差值反映了線粒體膜電位的變化[6]。

Fig 1 Results of liver toxicity analysis of aspirin and ticlopidine(n=3)

2.2.1沒食子酸高內(nèi)涵分析結(jié)果 如Fig 5和Fig 6所示，沒食子酸在30 mg·L-1的給藥濃度下，DNA含量和細(xì)胞數(shù)量在安全閾值范圍內(nèi)，當(dāng)給藥濃度超過30 mg·L-1時(shí)，DNA含量下降，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，數(shù)量明顯減少，當(dāng)濃度達(dá)到30 mg·L-1時(shí)，細(xì)胞數(shù)量減少至安全閾值以下。當(dāng)沒食子酸的給藥濃度62.5 mg·L-1以上，對(duì)GSH降低水平、ROS含量的影響較大，偏離其安全閾值。如Fig 7和Fig 8所示。

Fig 2 Influence of aspirin and ticlopidine on cell number, DNA number, GSH levels, ROS content, and MMP of HepG2 cells(n=3)

Fig 3 Sample high-content hepatotoxicity risk assessment(n=3)

2.2.2苯甲酸高內(nèi)涵分析結(jié)果 苯甲酸隨著給藥濃度的增加，對(duì)HepG2細(xì)胞在細(xì)胞數(shù)目、DNA含量和MMP變化等指標(biāo)上，均未超出安全閾值范圍，隨著給藥劑量濃度增加到100 mg·L-1時(shí)， GSH降低水平觸及閾值，隨著劑量增加，GSH含量保持平穩(wěn)接近下限閾值。隨著劑量增加至500 mg·L-1，ROS呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，超出其安全閾值。

Fig 4 Representative images of drugs obtained at different wave length by HCS assay(×20)

Fig 5 Dose-effect curve of different concentrations of shikimic acid(t1), benzoic acid(t2),gallic acid(t3), 1,2,3,4,6-o-pentagalloglucose(t4) on number of cells(n=3)

Fig 6 Dose-effect curve of different concentrations of shikimic acid(t1), benzoic acid(t2), gallic acid(t3), 1,2,3,4,6-o-pentagalloglucose(t4)on DNA content(n=3)

Fig 7 Dose-effect curve of different concentrations of shikimic acid(t1), benzoic acid(t2), gallic acid(t3), 1,2,3,4,6-o-pentagalloglucose(t4)on GSH level(n=3)

2.2.31,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖高內(nèi)涵分析結(jié)果 1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖在10 mg·L-1的給藥濃度下，細(xì)胞數(shù)量呈上升趨勢(shì)，隨著給藥濃度增加，DNA含量急劇變化，對(duì)細(xì)胞數(shù)量影響較大，細(xì)胞呈快速下降趨勢(shì)。1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖在10～500 mg·L-1的給藥濃度下，隨著劑量增加，DNA含量、GSH含量和ROS含量如Fig 6、Fig 7和Fig 8所示，成折線變化。

2.2.4莽草酸高內(nèi)涵分析結(jié)果 在一系列濃度的變化下，莽草酸在MMP變化、細(xì)胞數(shù)目、DNA含量、GSH降低水平和ROS含量均呈陰性，表明對(duì)HepG2細(xì)胞無毒性作用，如Fig 5～9所示。

Fig 8 Dose-effect curve of different concentrations of shikimic acid(t1), benzoic acid(t2), gallic acid(t3), 1,2,3,4,6-o-pentagalloglucose(t4) on ROS content(n=3)

Fig 9 Dose-effect curve of different concentrations of shikimic acid(t1), benzoic acid(t2), gallic acid(t3), 1,2,3,4, 6-o-pentagalloglucose(t4) on MMP(n=3)

3 討論

通過高內(nèi)涵篩選技術(shù)分析絨毛訶子中單體成分對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性作用，結(jié)果顯示，沒食子酸致肝毒風(fēng)險(xiǎn)最高，而后由高到低依次為1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖、苯甲酸、莽草酸，莽草酸顯示無肝毒性風(fēng)險(xiǎn)。沒食子酸的MMP指標(biāo)呈現(xiàn)陰性結(jié)果，其他指標(biāo)都偏離安全閾值呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，且其肝毒性風(fēng)險(xiǎn)超過了陽(yáng)性對(duì)照藥物噻氯吡啶。鞣質(zhì)作為一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多元酚類化合物，可對(duì)肝臟造成嚴(yán)重的毒性損害，而訶子中鞣質(zhì)的含量約為32%～34%，由此推測(cè)歸于鞣質(zhì)的沒食子酸是絨毛訶子致肝毒的主要成分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明30 mg·L-1為沒食子酸致肝損傷的臨界濃度，在30 mg·L-1的濃度以下無致肝毒風(fēng)險(xiǎn)。通過HCS分析結(jié)果可得，給藥濃度在10 mg·L-1以下，各單體的各個(gè)指標(biāo)的量效曲線都在安全閾值內(nèi)。

當(dāng)沒食子酸的給藥濃度達(dá)到100 mg·L-1時(shí)，其GSH含量成折線急劇變化，GSH是由甘氨酸、谷氨酸以及半胱氨酸組成的三肽類化合物，發(fā)揮抗氧化和解毒的作用，在應(yīng)激狀態(tài)下保護(hù)肝臟避免氧化損害，隨著GSH含量的變化，ROS含量也隨著變化，當(dāng)ROS過量時(shí)，易攻擊線粒體，當(dāng)線粒體受損時(shí)，引發(fā)ROS過量生成，造成惡性循環(huán)[7,8]。

查閱相關(guān)文獻(xiàn)及古籍，絨毛訶子并無毒性記載。在實(shí)驗(yàn)過程中，課題組發(fā)現(xiàn)訶子的毒性，并對(duì)其毒性靶器官及毒性特點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步研究。通過用HCS分析技術(shù)來預(yù)測(cè)受試物的肝毒性已經(jīng)非常成熟，無論是成分復(fù)雜，多靶點(diǎn)多效應(yīng)的中藥注射液還是新藥的研發(fā)階段，HCS分析技術(shù)用于不僅可以預(yù)測(cè)其受試物的肝毒性，還可以闡明與多個(gè)指標(biāo)(細(xì)胞數(shù)目，DNA含量，降低GSH水平，誘導(dǎo)ROS過度產(chǎn)生及改變MMP)之間的聯(lián)系，從而確定化合物的潛在毒性及相關(guān)藥物的生物活性，可用于大規(guī)模藥物篩選[8-10]。

(致謝:本實(shí)驗(yàn)在北京市藥品檢驗(yàn)所藥理毒理科室實(shí)驗(yàn)室完成，感謝藥理毒理室各位老師和同學(xué)對(duì)實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)和幫助)