西黃丸對(duì)大鼠乳腺上皮細(xì)胞凋亡及ER、PR表達(dá)的影響

劉景楠，趙 敏，吳平安，韓 宇，韓 濤

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥學(xué)教研室，甘肅 蘭州 730000；2.華中科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430074)

乳腺增生是一種臨床常見(jiàn)的乳腺良性病變，作為女性乳腺疾病的高發(fā)疾病，近年來(lái)發(fā)病齡逐漸年輕化，發(fā)病率逐年升高[1]。該病發(fā)展過(guò)程遵循“正常組織-單純性增生(輕、中、重度)-非典型性增生-原位癌-浸潤(rùn)性癌”的規(guī)律[2]。且研究發(fā)現(xiàn)，乳腺增生癥與乳腺癌的發(fā)生具有相關(guān)性[3]。在乳腺癌發(fā)病每年近百萬(wàn)患者的情形下[4]，對(duì)乳腺增生患者進(jìn)行及時(shí)、有效的診斷與治療具有重要臨床意義。

西黃丸又名犀黃丸，出自清代名醫(yī)王洪緒所著《外科證治全生集·卷四》[5],作為現(xiàn)代臨床治療乳腺癌的常用藥之一。課題組前期基于下丘腦-垂體-卵巢軸對(duì)西黃丸進(jìn)行了在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)西黃丸具有抗乳腺增生作用[6]。通過(guò)對(duì)軸上FSH、LH等激素及GPR54、GnRHR等受體的調(diào)節(jié)作用來(lái)實(shí)現(xiàn)，但并未說(shuō)明西黃丸對(duì)乳腺組織是否有直接干預(yù)作用。葉媚娜等[7]研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的原代正常人乳腺上皮細(xì)胞仍具有體內(nèi)細(xì)胞的二倍體遺傳特性，在體外聯(lián)合應(yīng)用雌二醇和孕酮可以促進(jìn)其增殖。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)聯(lián)合應(yīng)用E2和P促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞增殖，擬構(gòu)建體內(nèi)乳腺組織良性增生模型，于體外進(jìn)行西黃丸抗乳腺增生研究，為西黃丸治療乳腺增生提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞

1.1.1動(dòng)物 SD大鼠，♀，未孕50只(SPF級(jí))，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(甘)2015-0002。

1.1.2細(xì)胞 大鼠乳腺上皮細(xì)胞，購(gòu)自賽佰康生物技術(shù)有限公司，并進(jìn)行免疫熒光鑒定。將細(xì)胞接種于DMEM培養(yǎng)基上，于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.3藥品與試劑 西黃丸，批號(hào)：11020073，北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，規(guī)格：每20丸重1 g；枸櫞酸他莫昔芬片，批號(hào)：31021545，揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，規(guī)格：每片10 mg；黃體酮注射液，批號(hào)：131003，浙江仙琚制藥股份有限公司，規(guī)格1 mL含黃體酮20 mg;苯甲酸雌二醇注射液，批號(hào)：090801，上海通用藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：每1mL含雌二醇2 mg。 Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒，購(gòu)于BD公司，批號(hào)：556547；SP檢測(cè)試劑盒，購(gòu)于索萊寶公司，批號(hào)：SP0041。

1.1.4儀器 CO2培養(yǎng)箱，Thermo公司，型號(hào)：311；電子顯微鏡，日立公司，型號(hào)：HT7700；IMS圖像分析系統(tǒng)，凝膠成像儀，Azure biosystems公司，型號(hào)：C300；電泳儀，北京六一生物科技有限公司，型號(hào)：DYCZ-24DN；Benchmark Plus酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物分組及給藥 按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為5組，即空白組、對(duì)照組(他莫昔芬)、西黃丸高、中、低劑量組，每組10只。空白組灌胃等體積蒸餾水，對(duì)照組給予每日1.8 mg·kg-1他莫昔芬灌胃，西黃丸高、中、低劑量組分別給予每日2.16，1.08，0.54 g·kg-1西黃丸灌胃，連續(xù)7 d[8]。

1.2.2西黃丸含藥血清制備 末次灌胃后1h(灌胃前禁食12 h)，10%水合氯醛(0.3 mL/100g)腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈采血，4 ℃離心，無(wú)菌分離血清，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

《意見(jiàn)》提出了實(shí)行最嚴(yán)格水資源管理制度“五個(gè)堅(jiān)持”的基本原則。一是堅(jiān)持以人為本，著力解決人民群眾最關(guān)心最直接最現(xiàn)實(shí)的水資源問(wèn)題，保障飲水安全、供水安全和生態(tài)安全。二是堅(jiān)持人水和諧，尊重自然規(guī)律和經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展規(guī)律，處理好水資源開(kāi)發(fā)與保護(hù)關(guān)系，以水定需，量水而行，因水制宜。三是堅(jiān)持統(tǒng)籌兼顧，協(xié)調(diào)好生活、生產(chǎn)和生態(tài)用水，協(xié)調(diào)好上下游、左右岸、干支流、地表水和地下水關(guān)系。四是堅(jiān)持改革創(chuàng)新，完善水資源管理體制和機(jī)制，改進(jìn)管理方式和方法。五是堅(jiān)持因地制宜，實(shí)行分類指導(dǎo)，注重制度實(shí)施的可行性和有效性。

1.2.3細(xì)胞分組及給藥 大鼠乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法：取大鼠乳腺組織，物理剪碎法結(jié)合胰蛋白酶消化法處理組織，待消化后，加入混合培養(yǎng)液，培養(yǎng)液為89%DMEM培養(yǎng)基+1%青鏈霉素混合液+10%大鼠血清，前兩天每24 h換液一次，之后每隔1 d換液1次[7]。

將大鼠乳腺上皮細(xì)胞分為①空白組：乳腺上皮細(xì)胞+10%空白組血清；② 增殖組：乳腺上皮細(xì)胞+E2、P干預(yù)+10%空白組血清；③ 西黃丸高劑量組：乳腺上皮細(xì)胞+ E2、P干預(yù)+10%西黃丸高劑量組血清； ④ 西黃丸中劑量組：乳腺上皮細(xì)胞+ E2、P干預(yù)+10%西黃丸中劑量組血清；⑤ 西黃丸低劑量組：乳腺上皮細(xì)胞+ E2、P干預(yù)+10%西黃丸低劑量組血清；⑥ 他莫昔芬組：乳腺上皮細(xì)胞+ E2、P干預(yù)+10%對(duì)照組血清。

1.2.4免疫熒光鑒定原代培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞 細(xì)胞爬片，固定，封閉，一抗孵育，二抗孵育，滴加一滴Fluoromount-G熒光封片劑，包埋。

1.2.5CCK-8法檢測(cè)大鼠乳腺上皮細(xì)胞增殖最佳培養(yǎng)濃度 用無(wú)水乙醇將E2、P、E2+P配制成1 g·L-1的母液，之后用生長(zhǎng)培養(yǎng)基分別稀釋成0.1、10-2、10-3、10-4、10-5g·L-15種濃度[6]。以無(wú)水乙醇與生長(zhǎng)培養(yǎng)基作為空白組，以加入等量無(wú)水乙醇與生長(zhǎng)培養(yǎng)基的大鼠乳腺上皮細(xì)胞為對(duì)照組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，采用CCK-8法檢測(cè)各濃度藥物培養(yǎng)液下各組乳腺上皮細(xì)胞增殖情況，得到其增殖最佳濃度藥物培養(yǎng)液為E2+P混合培養(yǎng)液(濃度為0.1 g·L-1)。

1.2.6CCK-8法檢測(cè)給予西黃丸后大鼠乳腺上皮細(xì)胞的存活率 采用CCK-8法檢測(cè)給予西黃丸后各組乳腺上皮細(xì)胞于第24 h、48 h、72 h的存活率。細(xì)胞存活率/%=(實(shí)驗(yàn)組/增殖組-1)×100%

1.2.7Giemsa染色法進(jìn)行西黃丸干預(yù)后大鼠乳腺上皮形態(tài)學(xué)觀察 取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，細(xì)胞爬片，滴加瑞式-吉姆薩染液2～3滴覆蓋整個(gè)標(biāo)本，2 min后滴加等量pH 6.4的磷酸緩沖液，充分混勻，水洗、吸干、鏡檢。

1.2.8流式細(xì)胞儀檢測(cè)給予西黃丸后大鼠乳腺上皮凋亡率 收集大鼠乳腺上皮細(xì)胞，PBS洗滌，冰預(yù)冷的70%乙醇固定，將細(xì)胞重懸于200 μL binging buffer，400目篩網(wǎng)過(guò)濾離心，染色，按照Annexin V-FITC/PI試劑盒嚴(yán)格操作，于流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)，使用CYEXPERT分析軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

1.2.9免疫組化法檢測(cè)給予西黃丸后大鼠乳腺上皮細(xì)胞凋亡因子表達(dá) 采用SP試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，細(xì)胞爬片固定后，PBS漂洗兩次，加入0.5%Triton X-100室溫孵育20 min，PBS漂洗兩次，加入3%H2O2處理15 min，PBS漂洗。吸去上清液，血清室溫封閉20 min，一抗、二抗孵育，DAB顯色，蒸餾水洗滌終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染，封片，顯微鏡觀察[8]。

1.2.10蛋白免疫印跡技術(shù)測(cè)定蛋白表達(dá) Western blot法測(cè)定乳腺上皮細(xì)胞雌二醇受體α(estradiol receptorα，ER-α)、雌二醇受體β(estradiol receptor β，ER-β)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)蛋白表達(dá)水平。待細(xì)胞密度生長(zhǎng)至80%，提取細(xì)胞蛋白，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行蛋白定量。制膠，室溫下電泳，將蛋白分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉進(jìn)行膜的封閉，抗體孵育，ECL顯色，拍照，ImageJ軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 原代培養(yǎng)正常大鼠乳腺上皮細(xì)胞的鑒定結(jié)果如下圖所示，均為陰性表達(dá)，經(jīng)免疫熒光鑒定，細(xì)胞為原代大鼠乳腺上皮細(xì)胞，純度達(dá)到90%以上。

Tab 1 Effect of estradiol and progesterone on inhibition of normal rat mammary epithelialcells in primary

*P<0.05vsmultiple comparisons

2.2 E2、P干預(yù)下原代培養(yǎng)正常大鼠乳腺上皮細(xì)胞最佳增殖濃度結(jié)果如Tab 1所示，原代培養(yǎng)的正常大鼠乳腺上皮細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果為E2+P混合培養(yǎng)液組(E2、P濃度為10-1g·L-1)時(shí)OD值最大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 西黃丸對(duì)大鼠乳腺上皮細(xì)胞存活率影響結(jié)果如Tab 2所示，與增殖組比較，對(duì)照組，西黃丸高、中、低劑量組OD值均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。西黃丸高、中、低劑量組及他莫昔芬組均對(duì)E2、P誘導(dǎo)的大鼠乳腺上皮細(xì)胞有明顯抑制作用，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)，抑制率逐漸升高，西黃丸高劑量組于72 h抑制率達(dá)到最高。

Tab 2 Effect of Xihuang pills on proliferation of normal rat mammary epithelialcells in primary

**P<0.01vsproliferation

2.4 西黃丸干預(yù)下大鼠乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果如Fig 2所示，活細(xì)胞為淡紫色，凋亡細(xì)胞為深藍(lán)色，結(jié)果可見(jiàn)空白組及增殖組多為淡紫色，可見(jiàn)淡紫色細(xì)胞核，而西黃丸高劑量組及對(duì)照組多為深藍(lán)色染色，且未能觀察到細(xì)胞核，即凋亡細(xì)胞。

2.5 西黃丸對(duì)大鼠乳腺上皮細(xì)胞凋亡率影響結(jié)果如Fig 3所示，經(jīng)PI染色后，乳腺上皮細(xì)胞細(xì)胞核為紅色，正常細(xì)胞分布于B3下左區(qū)，B2與B4區(qū)主要為凋亡細(xì)胞，由圖可以得出，西黃丸高、中、低劑量組及對(duì)照組均會(huì)促進(jìn)E2、P干預(yù)的大鼠乳腺上皮細(xì)胞凋亡，且主要影響乳腺上皮細(xì)胞的晚期凋亡，以西黃丸高劑量組影響最明顯，凋亡率為43.79%。

2.6 西黃丸對(duì)大鼠乳腺上皮細(xì)胞凋亡因子表達(dá)的影響結(jié)果如Fig 4、5及Tab 4所示，正常生長(zhǎng)的大鼠乳腺上皮細(xì)胞為藍(lán)紫色，凋亡細(xì)胞在光學(xué)顯微鏡下陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色，結(jié)合光密度值來(lái)看，F(xiàn)ig 4中西黃丸高、中劑量組陽(yáng)性表達(dá)最為顯著(P<0.01)，即西黃丸可促進(jìn)Bax的表達(dá)；Fig 5中西黃丸高、中劑量組及對(duì)照組多為藍(lán)紫色，即抑制Bcl-2的表達(dá)(P<0.01)。故西黃丸可通過(guò)改變Bax/ Bcl-2來(lái)促進(jìn)大鼠乳腺上皮細(xì)胞凋亡。

Fig 2 Morphological observation of rat mammary epithelial cells treated with Xihuang pills(×200)Rat mammary epithelial cells stained with Giemsa:A:Blank group,B:Proliferation group,C:Control group,D:Experimental-H group, E:Experimental-M group, F:Experimental-L group,in which dark blue indicates apoptotic cells.

Tab 3 Effect of Xihuang pills onapoptotic rate of normal rat mammary epithelial cells in primary

**P<0.01vsproliferation

Fig 3 Effect of Xihuang pills on apoptotic rate of rat mammary epithelial cellsRepresentative images of flow cytometry, B1 quadrant:dead cell,B2 quadrant:late apoptotic cell,B3 quadrant: normal cell, B4 quadrant:early apoptotic cell.A:Blank group,B:Proliferation group,C:Control group,D:Experimental-H group, E:Experimental-M group, F:Experimental-L group.

Fig 4 Effect of Xihuang pills containing serumon Bax expression in proliferating mammary epithelial cells(×400)Expression of Bax protein under immunohistochemistry: A:Blank group,B:Proliferation group,C:Control group,D:Experimental-H group, E:Experimental-M group, F:Experimental-L group, in which the positive expression was brownish yellow.

Tab 4 Effect of Xihuang pills on Bax and Bcl-2 expression in primarily cultured rat mammary epithelial

2.7 西黃丸對(duì)大鼠乳腺上皮細(xì)胞ERα、ERβ、PR蛋白表達(dá)的影響結(jié)果如Fig 6所示，與空白組比較，增殖組灰度值差異具有顯著性(P<0.01)，說(shuō)明E2、P可增加正常乳腺上皮細(xì)胞ERα、ERβ、PR表達(dá)；而增殖組與西黃丸高、中、低劑量組及對(duì)照組比較，差異均有顯著性(P<0.01)，說(shuō)明西黃丸含藥血清各劑量組及他莫昔芬組均對(duì)ERα、ERβ、PR表達(dá)有抑制作用。以ERα、ERβ灰度值看，對(duì)照組的抑制作用優(yōu)于西黃丸高劑量組，即可有效抑制乳腺組織增生，以PR看，抑制作用亦高于西黃丸高劑量組，即不利于乳腺組織的復(fù)舊。

3 討論

細(xì)胞凋亡是指為維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡，對(duì)機(jī)體正常發(fā)育、維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)有重要的作用[9]。乳腺增生的發(fā)病、加重、甚至癌變的過(guò)程就是乳腺上皮細(xì)胞增殖過(guò)度及凋亡減弱的結(jié)果。而乳腺細(xì)胞凋亡和增殖過(guò)程是由生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)激素相互調(diào)節(jié)的。研究表明，乳腺增生的發(fā)病與E2/P直接相關(guān)，ER過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致乳腺上皮細(xì)胞及間質(zhì)纖維出現(xiàn)增生，使乳腺上皮細(xì)胞的修復(fù)能力減弱。PR的過(guò)度表達(dá)可誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變，可激活特異性生長(zhǎng)因子，使乳腺上皮細(xì)胞對(duì)P的應(yīng)答出現(xiàn)異常，進(jìn)而影響乳腺組織的復(fù)舊[10]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，西黃丸可有效抑制ER、PR的表達(dá)，改變ER/PR，從而改變?nèi)橄俳M織的增生與復(fù)舊。

Fig 5 Effect of Xihuang pills containing serum on Bcl-2 expressionin proliferating mammary epithelial cells(×400)Expression of Bcl-2 protein under immunohistochemistry: A:Blank group,B:Proliferation group,C:Control group,D:Experimental-H group, E:Experimental-M group, F:Experimental-L group, in which the positive expression was brownish yellow.

線粒體作為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的核心。 Behera等[11]研究發(fā)現(xiàn)，孕激素能通過(guò)Fas L途徑激活誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Simpkins等[12]研究表明，雌激素對(duì)線粒體功能有顯著影響，并將雌激素受體ER定位于線粒體內(nèi)。有研究認(rèn)為，E2通過(guò)膜受體ER或線粒體受體ER在乳腺細(xì)胞中通過(guò)與線粒體呼吸復(fù)合物(MRC)的直接相互作用產(chǎn)生ROS導(dǎo)致蛋白激酶活化而改變線粒體，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[13]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)調(diào)節(jié)線粒體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的Bcl-2家族成員進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)西黃丸通過(guò)上調(diào)抗細(xì)胞凋亡蛋白Bax/促細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2的轉(zhuǎn)錄來(lái)促進(jìn)乳腺細(xì)胞凋亡，其結(jié)果可能與E2直接調(diào)節(jié)Bcl-2家族有關(guān)。

Fig 6 Effect of Xihuang pills on expression of ER-α,ER-β and PR protein in rat mammary epithelial cellsGray value strip chart of ER-α,ER-β and PR by Western blot;Gray value histogram of ER-α,ER-β and PR.**P<0.01 vs proliferation

綜上所述，西黃丸能通過(guò)抑制ER、PR的表達(dá),從線粒體途徑誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞凋亡，抑制其增殖，對(duì)乳腺增生有顯著的療效。而B(niǎo)cl-2、Bax作為促凋亡因子，能誘導(dǎo)細(xì)胞色素C釋放和凋亡小體的形成。因而本課題組下一階段將針對(duì)線粒體、mtDNA、雌激素、ER在乳腺增生中的關(guān)系，從細(xì)胞色素C入手進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。