雷酚內(nèi)酯對(duì)IgA腎病大鼠腎間質(zhì)纖維化和Th1/Th2漂移的調(diào)控①

宋獻(xiàn)美 吳曉東 楊 亮 李寧寧

(河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校微生物與免疫學(xué)教研室，鄭州 451191)

IgA腎病(IgA nephropathy，IgAN)是臨床上常見的一種自身免疫性疾病，其病理特點(diǎn)為腎小球系膜區(qū)IgA或以IgA為主的免疫球蛋白顆粒樣或團(tuán)塊狀沉積[1]。研究表明，IgA腎病患者體內(nèi)Th1/Th2細(xì)胞的平衡紊亂與IgA腎病的發(fā)生密切相關(guān)，并會(huì)進(jìn)一步加重腎臟損傷[2]。以往認(rèn)為該病預(yù)后良好，但近年發(fā)現(xiàn)兒童在確診后的5～25年內(nèi)9%～50%進(jìn)行性發(fā)展為終末期腎病，成人患者每10年約有20%進(jìn)展至終末期腎病[3,4]。IgA腎病進(jìn)展至終末期腎病的危險(xiǎn)因素包括血尿、蛋白尿、腎功能不全、腎小球硬化、腎小管纖維化等[5,6]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)致纖維化細(xì)胞因子，在IgA腎病患者腎組織中，TGF-β1的表達(dá)與腎小管損傷及間質(zhì)纖維化程度呈正相關(guān)[7]。雷公藤及其制劑是確有療效的免疫抑制劑，其抗炎和免疫抑制作用已通過大量實(shí)驗(yàn)被確證，用于治療關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎病等[8,9]。雷酚內(nèi)酯(化學(xué)式結(jié)構(gòu)式見圖1)是從雷公藤分離得到的二萜類有效成分，具有較強(qiáng)的免疫抑制活性[10]，但其對(duì)腎病的作用尚不清楚。本研究主要目的是通過IgA腎病大鼠模型，探索雷酚內(nèi)酯對(duì)IgA腎病腎功能、腎間質(zhì)纖維化和Th1/Th2漂移的影響，明確雷酚內(nèi)酯對(duì)IgA腎病的作用。

1 材料與方法

1.1材料 45只SPF級(jí)6周齡雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。雷酚內(nèi)酯購(gòu)自南京道斯夫生物科技有限公司。牛血清白蛋白(albumin bovine serum，BSA)、脂多糖(lipopolysacch-arides，LPS)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。四氯化碳購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠。肌酐(creatinine，Cr)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)購(gòu)自南京建成生物工程研究所。ELISA試劑盒(IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。FITC熒光標(biāo)記兔抗大鼠IgA抗體購(gòu)自美國(guó)Dako公司。TGF-β1、單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemot-actic protein-1，MCP-1)抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組及處理 45只大鼠隨機(jī)分為3組，每組15只：正常對(duì)照(Control，Ctrl)組、模型(IgA nephropathy，IgAN)組、雷酚內(nèi)酯(triptophenolide，TN)組。模型組和雷酚內(nèi)酯組大鼠以10% BSA隔日灌胃(400 mg/kg)共6周；于第6周和第8周末尾靜脈注射LPS(0.05 mg/只)； 每周1次皮下注射四氯化碳0.1 ml+蓖麻油0.3 ml，共9周。正常組大鼠于相應(yīng)時(shí)間給予生理鹽水皮下和尾靜脈注射，等體積蒸餾水灌胃。從第10周開始，雷酚內(nèi)酯組大鼠灌胃雷酚內(nèi)酯(3 mg/kg)，正常組和模型組灌胃蒸餾水，每日1次，連續(xù)8周。

圖1 雷酚內(nèi)酯化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of Triptophenolide

1.2.2尿蛋白和腎功能指標(biāo)檢測(cè) 末次給藥后代謝籠收集各組大鼠24 h尿液，考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)尿蛋白；收集待測(cè)大鼠血液，離心分離血清，肌氨酸氧化酶法檢測(cè)血清肌酐，二乙酰肟比色法檢測(cè)血清尿素氮。

1.2.3血清中炎癥因子水平的測(cè)定 末次給藥24 h后，采集大鼠血液，離心分離血清，按試劑盒說(shuō)明書，采用ELISA法檢測(cè)血清中IL-2、IFN-γ、IL-4及IL-10的含量，并計(jì)算IL-4/IFN-γ比值。

1.2.4免疫熒光觀察IgA的沉淀 末次給藥24 h采血后取出大鼠腎臟，用OCT包埋后，放入液氮速凍，制成4 μm厚的冰凍切片，晾干，PBS緩沖液漂洗3次，每次3 min，滴加FITC標(biāo)記的IgA抗體(1∶50)，37℃ 孵育30 min，PBS漂洗3次，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察IgA在腎組織中的沉淀情況。

1.2.5腎組織病理觀察 腎臟組織經(jīng)中性甲醛固定，石蠟包埋，切片，常規(guī)HE染色，于顯微鏡下觀察腎組織病理學(xué)形態(tài)。Masson三色染色后，觀察腎組織的纖維化程度，膠原纖維呈藍(lán)色，采用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行半定量分析，以膠原纖維在腎組織的面積百分比表示腎臟組織的纖維化程度。

1.2.6腎組織TGF-β1和MCP-1表達(dá)檢測(cè) 用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取腎組織總蛋白，BCA法定量蛋白濃度。變性后等量蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，隨后加入5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h，棄去封閉液，漂洗后加入相應(yīng)一抗，4℃過夜，第二天滴加二抗室溫封閉1 h，洗膜后加入ECL顯色液置于暗夾內(nèi)曝光顯影。用Image J對(duì)蛋白條帶進(jìn)行半定量分析，以β-actin為內(nèi)參。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，多組之間的比較采用單因素方差分析(One-way analysis of variance，One-way ANOVA)，兩組間比較采用LSD檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1雷酚內(nèi)酯對(duì)IgAN大鼠腎組織IgA沉淀的影響 利用免疫熒光檢測(cè)大鼠腎組織中IgA的沉積，如圖2所示。正常組大鼠腎組織未見IgA免疫熒光反應(yīng)；模型組大鼠腎小球系膜區(qū)呈較強(qiáng)的團(tuán)塊狀或顆粒狀綠色強(qiáng)IgA熒光，說(shuō)明IgA腎病大鼠模型建立成功；雷酚內(nèi)酯干預(yù)后，IgA沉淀綠色熒光顯著減弱。由此可見，雷酚內(nèi)酯可減少IgA在大鼠腎組織的沉積。

2.2雷酚內(nèi)酯對(duì)IgAN大鼠腎組織形態(tài)學(xué)和纖維化的影響 HE染色顯示，正常組大鼠腎臟腎小球、腎小管、腎間質(zhì)未見明顯異常，系膜區(qū)無(wú)明顯增生；模型組大鼠部分腎小球增大，腎小囊腔擴(kuò)大，系膜組織增生，系膜基質(zhì)增多，腎小管上皮細(xì)胞腫脹、腎小球內(nèi)細(xì)胞增多；雷酚內(nèi)酯組病變程度較模型組明顯減輕，見圖3。Masson染色顯示，正常組大鼠腎小球、腎小管及間質(zhì)組織病理形態(tài)未見異常，系膜區(qū)基質(zhì)及細(xì)胞未見增加，腎組織鮮有藍(lán)色膠原纖維著色區(qū)域；模型組可見中到重度不同程度細(xì)胞及基質(zhì)增生，部分腎小球基底膜、系膜區(qū)見藍(lán)色線條狀區(qū)域，在腎間質(zhì)小管處可見斑塊條狀藍(lán)色區(qū)域散在分布，血管膠原纖維也呈藍(lán)色著色；雷酚內(nèi)酯組病變程度較模型組明顯改善；模型組膠原纖維面積百分比高于正常組，雷酚內(nèi)酯組膠原纖維面積百分比低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

2.3雷酚內(nèi)酯對(duì)IgAN大鼠腎功能的影響 正常組、模型組、雷酚內(nèi)酯組大鼠血清中肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，模型組和雷酚內(nèi)酯組大鼠血清中肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白含量高于正常組，雷酚內(nèi)酯組大鼠血清中肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白水平低于模型組(P<0.05)。見圖5。上述數(shù)據(jù)表明，雷酚內(nèi)酯可改善IgAN大鼠的腎功能。

圖2 雷酚內(nèi)酯對(duì)IgA在大鼠腎組織沉積的影響(免疫熒光，×400)Fig.2 Effect of TN on IgA deposition of renal tissue in IgAN rats(Immunofluorescence,×400)

圖3 雷酚內(nèi)酯對(duì)IgA大鼠腎組織形態(tài)學(xué)的影響(HE，×200)Fig.3 Effect of TN on morphology of renal tissue in IgAN rats(HE,×200)

2.4雷酚內(nèi)酯對(duì)IgAN大鼠血清Th1/Th2漂移狀態(tài)的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清中IL-2和IFN-γ水平明顯下降(P<0.05)， 而IL-4和IL-10水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，雷酚內(nèi)酯組大鼠血清中IL-2和IFN-γ水平明顯升高(P<0.05)，IL-4、IL-10水平及IL-4/IFN-γ比值明顯降低(P<0.05)。結(jié)果見圖6。上述結(jié)果說(shuō)明，雷酚內(nèi)酯可提高Th1型、降低Th2型細(xì)胞因子水平，從而糾正IgA腎病大鼠Th1/Th2漂移現(xiàn)象。

圖4 雷酚內(nèi)酯對(duì)IgAN大鼠腎纖維化的影響(Masson，×200)Fig.4 Effect of TN on renal interstitial fibrosis in IgAN rats(Masson,×200)Note:Compared with control group,*.P<0.05;compared with IgAN group,#.P<0.05.

圖5 各組大鼠肌酐、尿素氮和尿蛋白的比較Fig.5 Comparison of Cr,BUN and urine protein in ratsNote:Compared with control group,*.P<0.05;compared with IgAN group,#.P<0.05.

圖6 TN對(duì)IgAN大鼠血清IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10水平及IFN-γ/IL-4比值的影響Fig.6 Effects of TN on levels of IL-2,IFN-γ,IL-4,IL-10 and IFN-γ/IL-4 in serum of IgAN ratsNote:Compared with control group,*.P<0.05;compared with IgAN group,#.P<0.05.

圖7 雷酚內(nèi)酯對(duì)IgAN大鼠腎組織TGF-β1和MCP-1表達(dá)的影響Fig.7 Effect of TN on expression of TGF-β1 and MCP-1 in renal tissues of IgAN ratsNote:Compared with control group,*.P<0.05;compared with IgAN group,#.P<0.05.

2.5雷酚內(nèi)酯對(duì)IgAN大鼠腎組織TGF-β1和MCP-1表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠血清中腎組織TGF-β1和MCP-1表達(dá)明顯增加(P<0.05)，與模型組比較，大鼠血清中腎組織TGF-β1和MCP-1表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，結(jié)果見圖7。上述結(jié)果表明，雷酚內(nèi)酯可減少IgAN大鼠腎組織TGF-β1和MCP-1的表達(dá)。

3 討論

IgA腎病的重要發(fā)病機(jī)制是以IgA為主并常伴有C3、IgG等免疫復(fù)合物在腎系膜區(qū)的沉積，研究發(fā)現(xiàn)系膜區(qū)沉積的IgA或血清中升高的IgA均為多聚型IgA1[11]。大量證據(jù)表明由于鉸鏈區(qū)的α-糖基化異常使得IgA1易于自我聚集，或與針對(duì)IgA1鉸鏈區(qū)的IgG抗體形成抗原抗體復(fù)合物，并與纖維連接蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)的親和力增加，形成的含免疫球蛋白的大分子復(fù)合物沉積于系膜區(qū)[12]。蛋白尿是IgA腎病患者最常出現(xiàn)的臨床癥狀，同時(shí)也是引起腎小管間質(zhì)損害、導(dǎo)致腎功能異常的因素之一[13]。本實(shí)驗(yàn)采用聯(lián)合牛血清白蛋白+脂多糖+四氯化碳的方法建立模型，免疫熒光顯示模型大鼠腎小球系膜區(qū)出現(xiàn)彌漫性顆粒狀沉淀，呈強(qiáng)綠色熒光，符合IgA腎病的病理特征。尿蛋白、血清肌酐、尿素氮檢測(cè)結(jié)果顯示模型大鼠上述指標(biāo)較正常大鼠均明顯升高，表明IgA腎病模型建立成功。雷酚內(nèi)酯干預(yù)后，IgA在大鼠腎組織的沉積明顯減少，尿蛋白、血清肌酐、尿素氮水平明顯下降。

機(jī)體的Th0輔助細(xì)胞可分化為Thl細(xì)胞和Th2細(xì)胞亞群，其中Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ、IL-2、IL-12等因子介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，而Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等因子介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。Th1和Th2細(xì)胞因子分別誘導(dǎo)Th0細(xì)胞向各自細(xì)胞亞群分化并促進(jìn)其細(xì)胞激活，正常情況下Th1/Th2處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，亦稱為促炎/抗炎平衡。但當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)病變或者免疫系統(tǒng)異常時(shí)，Th1/Th2平衡遭到破壞，發(fā)生Th1/Th2平衡失調(diào)，使Th1/Th2漂移。

臨床研究顯示IgA腎病患者體內(nèi)Th2細(xì)胞免疫應(yīng)答增強(qiáng)，而Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答減弱，發(fā)生Th2漂移[14]，Th2細(xì)胞及Th2型細(xì)胞因子的增加，一方面誘導(dǎo)B細(xì)胞活化成熟產(chǎn)生異常糖基化的IgA，對(duì)IgA糖基化的形式產(chǎn)生影響，另一方面抑制Th1細(xì)胞及Th1型細(xì)胞因子分泌，從而抑制Tc細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及免疫應(yīng)答，影響抗原的清除[1,15]。Th2型細(xì)胞因子的增高還可降低單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的清除能力使IgA腎病患者的IgA及其免疫復(fù)合物不能被及時(shí)清除，增加在腎小球系膜區(qū)的沉積，引起系膜細(xì)胞與基質(zhì)增生，加重腎損傷[16]。MCP-1屬于趨化因子CC亞家族，其主要功能是趨化和激活單核細(xì)胞至炎癥部位。正常腎組織僅含有少量的MCP-1，當(dāng)腎臟受到刺激時(shí)，MCP-1表達(dá)增加，其趨化巨噬細(xì)胞在腎小管間質(zhì)聚集，并激活巨噬細(xì)胞產(chǎn)生多種促炎因子及促纖維因子，是IgA腎病的危險(xiǎn)因素[7,17]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IgA腎病大鼠血清中IL-2 和IFN-γ水平明顯降低，而IL-4、IL-10水平和IL-4/IFN-γ比值明顯升高，MCP-1表達(dá)增加，說(shuō)明IgAN模型組大鼠體內(nèi)Th細(xì)胞向著Th2細(xì)胞方向極化，體液免疫增強(qiáng)，Th1/Th2發(fā)生漂移；雷酚內(nèi)酯干預(yù)后大鼠血清中IL-2和IFN-γ水平升高，IL-4、IL-10水平及IL-4/IFN-γ比值降低，MCP-1表達(dá)減少，結(jié)果表明雷酚內(nèi)酯可提高Th1類、降低Th2類細(xì)胞因子水平，抑制MCP-1的表達(dá)，從而糾正IgA腎病大鼠的Th1/Th2漂移。

IgA在腎小球系膜的沉積促使系膜細(xì)胞分泌MCP-1、IL-2、IL-6等多種細(xì)胞因子，并促發(fā)一系列瀑布式級(jí)聯(lián)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化。腎間質(zhì)纖維化是多種腎臟疾病的共同且不可逆的病理改變，是腎臟疾病進(jìn)展至終末期腎病的共同通路，因此延緩腎纖維化的發(fā)生是慢性腎病治療的關(guān)鍵[18,19]。研究表明IgA腎病患者的TGF-β1表達(dá)量明顯上調(diào)，且與腎小球硬化程度呈顯著正相關(guān)[20]。TGF-β1不但參與抗體IgA的產(chǎn)生，而且被公認(rèn)為最重要的促纖維化因子，是治療腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵靶點(diǎn)。TGF-β1主要通過TGF-β1/Smad信號(hào)通路發(fā)揮作用，Smad2是激活型Smad蛋白，為TGF-β1下游調(diào)節(jié)因子，與TGF-β1受體形成復(fù)合物，磷酸化后釋放并與Smad4結(jié)合，激活細(xì)胞外基質(zhì)成分等啟動(dòng)子的活性，促使細(xì)胞外基質(zhì)合成增加。Smad7則起負(fù)反饋調(diào)節(jié)的因子，Smad7表達(dá)量減少，Smad通路的活性增強(qiáng)，腎臟呈進(jìn)展性纖維化[21,22]。因此，抑制TGF-β1的產(chǎn)生可通過TGF-β1/Smad信號(hào)通路減緩腎纖維化的進(jìn)展過程。本實(shí)驗(yàn)顯示IgA腎病大鼠腎間質(zhì)可見膠原纖維分布，膠原纖維面積百分比明顯升高，TGF-β1表達(dá)增加；雷酚內(nèi)酯處理后大鼠腎間質(zhì)膠原纖維分布減少，膠原纖維面積百分比和TGF-β1表達(dá)降低。

綜上所述，雷酚內(nèi)酯可減少IgA在大鼠腎系膜區(qū)的沉積，改善腎功能和腎組織病理，抑制腎間質(zhì)纖維化，糾正Th1/Th2平衡的漂移。因?yàn)門GF-β1/Smad信號(hào)通路是調(diào)控組織纖維化的經(jīng)典通路，因此，在后期實(shí)驗(yàn)中我們將繼續(xù)探討雷酚內(nèi)酯通過TGF-β1/Smad通路對(duì)IgA腎病腎間質(zhì)纖維化的影響。