電針對神經(jīng)病理性疼痛伴發(fā)焦慮大鼠行為學及韁核HCN1表達的影響

浙江中醫(yī)藥大學第三臨床醫(yī)學院 杭州 310053

慢性疼痛復雜難治，而神經(jīng)病理性疼痛是其中最常見的一類，它由神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或炎癥引起[1]。臨床研究提示，慢性疼痛可導致焦慮，而焦慮能增強痛覺，長期慢性疼痛伴發(fā)焦慮、抑郁的人群比例可高達 57.4%[2]。目前，電針（electro-acupuncture，EA）對神經(jīng)病理性慢性疼痛的療效已經(jīng)得到廣泛認可[3]。臨床研究證實，EA還能緩解由慢性疼痛伴發(fā)的焦慮情緒，但對相關(guān)機制的研究較少。韁核是中樞神經(jīng)系統(tǒng)單胺類神經(jīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)的負調(diào)控中心，在精神類疾病如焦慮癥與抑郁癥的發(fā)病中起著重要作用[4]。以往研究證實韁核是針刺鎮(zhèn)痛的重要環(huán)節(jié)[5]，但其在針刺調(diào)控精神障礙中的作用尚不清楚。超極化激活環(huán)核苷酸門控通道蛋白（hyperpolarization-activated cyclicnucleotide-gated channels，HCN）屬于孔隙環(huán)離子通道超家族的環(huán)核苷酸門控通道離子通道亞組，該通道有4種亞型，其中HCN1廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)[6]。研究報道，神經(jīng)病理性疼痛患者神經(jīng)損傷后，表達HCN的軸突在損傷處聚集，而敲除HCN1后大鼠焦慮抑郁情緒能夠得到明顯改善[7-8]。由此可見，HCN通道在神經(jīng)病理性疼痛及其誘發(fā)的精神情緒變化中發(fā)揮了重要作用，是疼痛和情緒變化可能的“交叉點”。

由此，本研究擬通過坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷（sciatic nerve branch selective injury，SNI） 法制備神經(jīng)病理性疼痛模型，觀察大鼠雙側(cè)機械性痛閾（mechanical paw withdrawal thresholds,MPWTs）及焦慮情緒的變化，并觀察EA干預對雙側(cè)韁核HCN1與cfos表達的影響，初步探討EA調(diào)控神經(jīng)病理性疼痛伴發(fā)精神障礙的可能機制。

1 材料和方法

1.1 動物 清潔級健康雄性SD大鼠32只，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司 [實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2017-0005]，體質(zhì)量（220±20）g，委托浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心飼養(yǎng) [實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2018-0012]，飼養(yǎng)期間給予嚙齒類動物標準顆粒飼料以及自由飲水，12h明暗循環(huán)，室溫（23±2）℃。

1.2 主要試劑與儀器 HCN1抗體、驢抗小鼠IgG H&L（Alexa Fluor 488）預吸附二抗、c-fos抗體、驢抗兔IgG H&L（Alexa Fluor 647）預吸附二抗均購于美國 Abcam 公司（批號：ab84816、ab150109、ab190289、150063）。NC12775型 Von-Frey觸痛儀購于美國stoelting公司；HM550型冰凍切片機購于美國Thermo Scientific公司；VS120-S6-W型數(shù)字病理切片（熒光）掃描分析儀購于日本Olympus公司；SMART V 3.0型動物視頻跟蹤系統(tǒng)為深圳市瑞沃德生命科技有限公司產(chǎn)品；HANS-200A型韓氏穴位神經(jīng)刺激儀購于聯(lián)創(chuàng)科技南京濟生醫(yī)療科技有限公司。

1.3 動物分組和SNI模型的建立 采用完全隨機法將大鼠分為空白對照組、假手術(shù)組、SNI組和EA組，每組8只。SNI組和EA組大鼠以10%戊巴比妥鈉45mg/kg腹腔注射麻醉，于左側(cè)大腿與股骨平行靠后1cm左右剪開皮膚，分離肌肉組織，暴露出坐骨神經(jīng)，并小心向下分離至神經(jīng)分叉。小心分離周圍粘連組織和坐骨神經(jīng)的3條分支脛神經(jīng)、腓總神經(jīng)和腓腸神經(jīng)，以絲線結(jié)扎脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)，同時在神經(jīng)干結(jié)扎的遠側(cè)端用眼科剪剪去大約2～4mm神經(jīng)干，保留腓腸神經(jīng)，之后逐層縫合組織和表皮[9]。假手術(shù)組僅僅暴露與分離左側(cè)脛神經(jīng)、腓總神經(jīng)和腓腸神經(jīng)，不予結(jié)扎與離斷?？瞻讓φ战M不予任何處理。

1.4 EA干預 EA組大鼠從造模后第8天采用電針刺激雙側(cè)“足三里”“昆侖”[10]，刺激頻率 2Hz，起始強度 1mA、15min，而后調(diào)整為 2mA、15min，30min/次，1次/d，共治療3次。

1.5 大鼠MPWTs測定 將大鼠置于測痛架上，適應環(huán)境15min后，觀察并調(diào)整使大鼠左后足部可通過鐵絲網(wǎng)眼，使用Up and Down法測定MPWTs。分別選用力度為0.4、0.6、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、15.0 和 26.0g 的Von Frey纖維絲，首先從4.0g開始，將Von Frey纖維絲置于大鼠左后足腓腸神經(jīng)支配的足底外側(cè)1/3區(qū)域（避開足墊），輕微垂直用力至Von Frey纖維絲彎曲成S形，刺激時間每次持續(xù)5s，間隔大于2min，若大鼠出現(xiàn)縮足/逃逸行為則為陽性反應，記為“X”，換小一級力度的Von Frey纖維絲繼續(xù)刺激；反之以“O”表示，更換為大一級力度的Von Frey纖維絲繼續(xù)刺激，直到出現(xiàn)第一對前兩個有效符號不相同（即“XO”或“OX”）的記錄，再連續(xù)重復測量4次，如可得到“OOOXXOOX”的序列，以依據(jù)公式 MPWTs（g）=（10[Xf＋κδ]）/10 000 計算痛閾。其中κ值由序列組合查表獲得，序列中最后一根刺激絲的對數(shù)值記為Xf值，選取的各個刺激絲力度取對數(shù)后差值的平均值記為δ，本實驗中約為0.231[11]。若連續(xù)5次測量均為陰性反應，則痛閾值為26.0g；反之若均為陽性反應，則痛閾值為0.4g。于造模前，造模后l、3、5、7、8、9及10d 分別檢測大鼠雙足MPWTs的變化。

1.6 曠場實驗 具體操作參考文獻[12]進行。將大鼠放入一個100cm×100cm×50cm的黑色敞箱中，敞箱底面平均劃分為16個小方格，中間4個為中央?yún)^(qū)，其他12格為周圍區(qū)。每只大鼠實驗前將箱體用酒精棉球擦拭，以防大鼠留下的尿液和糞便影響觀察。實驗前1d所有大鼠置于實驗室1h以適應環(huán)境。第2天分別將每只大鼠按照頭部背對實驗者的方向放置在箱體的中央?yún)^(qū)中，以動物視頻跟蹤系統(tǒng)記錄大鼠5min內(nèi)的探索情況，計算大鼠進入中央?yún)^(qū)次數(shù)、中央?yún)^(qū)停留時間、中央?yún)^(qū)運動距離和曠場內(nèi)運動總距離。

1.7 免疫熒光檢測大鼠韁核c-fos和HCN1表達水平 實驗結(jié)束后斷頭處死大鼠，以0.9%氯化鈉150mL心臟灌注，然后4%多聚甲醛300mL滴注，分離大腦后以4%多聚甲醛固定24h，蔗糖溶液梯度脫水，過液氮后保存于-80℃冰箱備用。采用貼片法，37℃回溫孵育1h，磷酸鹽緩沖液 （phosphate buffer saline,PBS）漂洗3次后以PBS稀釋的10%驢血清封閉孵育 1h，分別滴加 c-fos抗體（稀釋比例 1：700）與HCN1 抗體（稀釋比例 1：400），4℃過夜。次日 37℃復溫45min后，以PBS漂洗3次，分別滴加驢抗兔IgG（稀釋比例 1：800）與驢抗小鼠 IgG（稀釋比例 1：400）二抗，37℃孵育1h，漂洗后室溫避光晾干，滴加抗熒光淬滅封片液封片。采用不含一抗的稀釋液替代一抗，作為陰性對照，其余條件不變。采用數(shù)字病理切片（熒光）掃描分析儀觀察并拍片。以陰性對照為參考，使用Image Pro Plus 6.0軟件進行分析，分別計算大鼠患側(cè)與健側(cè)內(nèi)側(cè)韁核 （medial habenular nucleus，MHb）、外側(cè)韁核外側(cè)部分 （lateral habenular nucleus lateral part，LHbL）和外側(cè)韁核內(nèi)側(cè)部分（lateral habenular nucleus medial part，LHbM）的平均光密度（integrated optical density，IOD）。

1.8 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析；組間兩兩比較，滿足方差齊性時采用LSD-t檢驗，方差不齊時采用Dunett’s T3檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠 MPWTs比較 與空白對照組比較，假手術(shù)組患側(cè)MPWTs在造模后第1、3天降低，第5天開始升高，直至第10天，但差異均無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05）。與假手術(shù)組比較，造模后第1天至第10天，SNI組大鼠患側(cè)MPWTs均降低（P＜0.01）。與SNI組比較，造模第1天至第7天，EA組MPWTs差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），EA干預后EA組MPWTs升高（P＜0.01），一直維持到造模后第10天。各組大鼠健側(cè)MPWTs所有時點差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠不同時點MPWTs比較Fig.1 Comparison of MPWTs at different time points in each group

2.2 各組大鼠曠場實驗結(jié)果比較 與空白對照組比較，造模后第10天假手術(shù)組運動總距離、進入中央?yún)^(qū)次數(shù)、中央?yún)^(qū)停留時間以及中央?yún)^(qū)運動距離差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），表明假手術(shù)組沒有產(chǎn)生焦慮樣情緒變化。與假手術(shù)組比較，SNI組運動總距離和中央?yún)^(qū)運動距離縮短（P＜0.01，P＜0.05），進入中央?yún)^(qū)次數(shù)減少（P＜0.01），中央?yún)^(qū)停留時間減少，但差異無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05）；與空白對照組比較，SNI組中央?yún)^(qū)停留時間減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與SNI組比較，EA組大鼠運動總距離、進入中央?yún)^(qū)次數(shù)、中央?yún)^(qū)停留時間均增加 （P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01），但中央?yún)^(qū)運動距離差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖 2。

圖2 各組大鼠曠場實驗結(jié)果比較Fig.2 Comparison of the open field experimental results in each group

2.3 各組大鼠韁核HCN1表達水平比較 大鼠的韁核分為MHb、LHbL和LHbM[13]。見圖3。與空白對照組比較，造模后第10天假手術(shù)組和SNI組大鼠健側(cè)MHb、LHbM和LHbL的HCN1表達水平均升高，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與空白對照組比較，假手術(shù)組患側(cè) MHb、LHbL的HCN1僅少量表達，LHbM表達較多，但差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與假手術(shù)組比較，SNI組患側(cè)各部分HCN1表達水平均明顯增高（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01）；與 SNI組比較，EA 組患側(cè)各部分 HCN1 表達水平均降低（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01）。見圖 4、5。

圖3 大鼠韁核示意圖（Bregma 3.36mm）Fig.3 Schematic diagram of rat habenuclar nucleus(Bregma 3.36mm)

2.4 各組大鼠韁核c-fos表達水平比較 造模第10天，各組大鼠健側(cè)MHb和LHbL的c-fos表達水平差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與空白對照組比較，假手術(shù)組健側(cè)LHbM的c-fos表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；但與假手術(shù)組比較，SNI組 c-fos表達水平升高明顯（P＜0.01）；而與 SNI組比較，EA組 cfos表達水平明顯降低（P＜0.01）。

與空白對照組比較，假手術(shù)組患側(cè)MHb和LH-bL的c-fos表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而患側(cè)LHbM的c-fos表達水平升高（P＜0.01）；與假手術(shù)組比較，SNI組患側(cè)MHb和LHbL的c-fos表達水平均升高（P＜0.05，P＜0.01）；SNI組患側(cè) LHbM 的 cfos表達水平雖進一步升高，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與 SNI組比較，EA 組患側(cè) MHb、LHbL 和LHbM 的 c-fos表達水平均下降 （P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01）。見圖 6、7。

圖4 各組大鼠韁核HCN1表達（100×）Fig.4 HCN1 expression of habenuclar nucleus in each group(100×)

3 討論

神經(jīng)病理性疼痛由神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或炎癥引起，以痛閾過敏、異常痛覺和自發(fā)疼痛為特征[14]，其發(fā)病機制尚不明確。目前較理想的神經(jīng)病理性疼痛動物模型主要有4種：SNI模型、坐骨神經(jīng)慢性壓榨模型、坐骨神經(jīng)部分結(jié)扎模型和脊神經(jīng)選擇結(jié)扎模型[15]。SNI模型方法簡單、重復性高、運用廣泛，且疼痛僅累及患側(cè)[9]。本研究中SNI大鼠模型在造模后第1天患側(cè)MPWTs顯著下降，一直持續(xù)到實驗結(jié)束，而對健側(cè)痛閾幾乎無影響，且造模成功率為100%，與文獻報道一致。

圖7 各組大鼠韁核c-fos表達比較Fig.7 Comparison of c-fos expression of habenuclar nucleus in each group

臨床與實驗研究均發(fā)現(xiàn)，慢性疼痛可導致焦慮，而焦慮能增強痛覺，一般疼痛4～8周后才會出現(xiàn)焦慮樣行為或抑郁樣行為[15]，而神經(jīng)病理性疼痛能夠更早地誘發(fā)情緒變化[16]。同時有研究證實，左側(cè)疼痛比右側(cè)疼痛更容易誘發(fā)焦慮樣情緒[17]。本實驗制備左側(cè)SNI模型，觀察發(fā)現(xiàn)SNI大鼠在造模后第7天已經(jīng)產(chǎn)生焦慮情緒，由此選擇在該時間點行EA干預。以往研究證實，低頻EA對神經(jīng)病理性疼痛包括糖尿病神經(jīng)痛、坐骨神經(jīng)痛等誘導產(chǎn)生的痛覺過敏具有良好的抑制作用[3]。低頻EA刺激“足三里”穴能較好地抑制脊髓神經(jīng)結(jié)扎模型大鼠的機械痛覺過敏，這種效應可以一直持續(xù)到造模后2周，但是大多數(shù)研究僅僅觀察導致這種疼痛敏化以及EA干預的背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）或者脊髓機制[3,18]，低頻 EA 對神經(jīng)病理性疼痛引發(fā)的焦慮抑郁的調(diào)控作用則少見于報道。

經(jīng)典的曠場實驗通過觀察大鼠在方形敞箱等開闊環(huán)境中的自主行為與探究行為，以了解大鼠的焦慮心理。正常動物的探究特性使其在周邊活動并使其產(chǎn)生進入中央?yún)^(qū)域活動的動機，而焦慮動物因?qū)Νh(huán)境恐懼會減少其運動總量，且主要在周邊區(qū)域活動，在中央?yún)^(qū)域活動較少[12]。EA干預3次即可以觀察到大鼠患側(cè)MPWTs升高的同時，其運動總距離增加，進入中央?yún)^(qū)的時間和次數(shù)也增加了，中央?yún)^(qū)運動距離也有增加的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義，推測原因可能與本研究樣本量較少有關(guān)。本研究顯示，EA在干預疼痛的同時能夠早期干預疼痛伴發(fā)的焦慮樣精神障礙。文獻報道，在EA治療慢性壓力引起的抑郁模型中可以觀察到EA快速起效，僅7d就可以產(chǎn)生抗抑郁效應[19]。本實驗室其他研究小組也發(fā)現(xiàn)高頻EA能夠快速干預痛-抑郁二聯(lián)征大鼠的痛閾和抑郁情緒[20]。然而以往探討EA對抗焦慮抑郁等精神障礙的作用時，往往僅探討其與單胺類神經(jīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)的關(guān)系[20-21]。臨床治療焦慮抑郁等精神障礙時，用藥早期中樞5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）等單胺類物質(zhì)水平即發(fā)生顯著改變，但焦慮癥狀的改善往往較慢，常常需要幾周時間[22]，因此筆者推測EA快速干預神經(jīng)病理性疼痛伴發(fā)的焦慮情緒可能還有其他關(guān)鍵機制。

韓濟生[5]提出“中腦邊緣鎮(zhèn)痛回路的假說”，發(fā)現(xiàn)在包括導水管周圍灰質(zhì)、伏核、杏仁核和韁核的任何一個核團中微量注射納洛酮，能夠降低75%以上的針刺鎮(zhèn)痛效應，證實了韁核在針刺鎮(zhèn)痛中的重要作用。而近年的研究發(fā)現(xiàn)，韁核尤其外側(cè)韁核是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中單胺類神經(jīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)的負調(diào)控中心，在焦慮抑郁等精神障礙調(diào)控中起到重要作用[4]。c-fos被認為是神經(jīng)元活動的標志物，它在正常大鼠神經(jīng)元內(nèi)極少被激活，其表達正是中樞對各種傷害性刺激的應答反應，且其表達的水平與所受到的刺激強度呈正相關(guān)[23]。本研究觀察到，SNI組大鼠患側(cè) MHb、LHbM和LHbL的c-fos表達均顯著升高，這表明韁核神經(jīng)元在SNI模型中被強烈激活，產(chǎn)生了積極的應答，而EA可能通過調(diào)控其表達，實現(xiàn)其干預作用。值得注意的是，假手術(shù)組患側(cè)和SNI組健側(cè)的LHbM的c-fos也高度表達，其原因是否與假手術(shù)組早期MPWTs降低，以及與其他痛閾或者情緒障礙相關(guān)，尚需要更多實驗進一步進行探討。

HCN在神經(jīng)病理性疼痛中扮演了重要的開關(guān)角色，為疼痛和情緒變化可能的“交叉點”[24]。該通道有4種亞型，即HCN1～4[6]，在細胞膜超極化達到-60mV至-90mV時可以產(chǎn)生一種超極化內(nèi)向電流（hyperpolarization activated inware current，Ih）[25]。在神經(jīng)病理性疼痛中，神經(jīng)損傷后Ih電流產(chǎn)生密度增加，表達HCN的軸突在損傷處聚集，HCN1敲除小鼠對冷刺激的閾值下降了一半[26]。另有研究發(fā)現(xiàn)，HCN1以及HCN通道的輔助亞基三角形四肽（tetratricopeptide，TPR）結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白敲除的小鼠在動物行為學檢測中都表現(xiàn)出了抗焦慮、抗抑郁的結(jié)果[27]。

文獻顯示HCN1廣泛分布，但其在正常大鼠韁核中僅少量表達[28]。本實驗發(fā)現(xiàn)SNI模型中患側(cè)韁核的3個部分MHb、LHbM與LHbL中HCN1均高表達，健側(cè)改變不明顯，顯示疼痛或者情緒變化均可能影響韁核HCN1的表達，而EA能夠起到很好的抑制作用，這表明EA的鎮(zhèn)痛與抗焦慮作用與韁核HCN1表達密切相關(guān)，其機制值得進一步探討。