木犀草素抗骨性關(guān)節(jié)炎潛在靶點的篩選與鑒定

徐強 李海燕 金剛

1.臺州恩澤醫(yī)療中心（集團）恩澤醫(yī)院 浙江,臺州 318053 2.臺州恩澤醫(yī)療中心（集團）路橋醫(yī)院

骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是最常見的關(guān)節(jié)病，隨著年齡的增長，發(fā)病率越來越高，65歲以上中老年人群50%以上有OA的X線表現(xiàn)[1]。OA也是造成中老年人群骨關(guān)節(jié)疼痛和致殘的主要原因，其影響整個關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)，包括關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨、韌帶、滑膜、關(guān)節(jié)囊及關(guān)節(jié)外肌肉，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退變，最終發(fā)生關(guān)節(jié)畸形和功能喪失，嚴重降低了中老年人的生活質(zhì)量，因而備受臨床重視[2-4]。目前，OA尚缺乏特效藥物，主要通過藥物干預(yù)、飲食調(diào)控和運動療法控制癥狀，因此尋找有效防治OA的藥物具有重要的臨床意義。中藥化學(xué)成分多樣，藥物活性物質(zhì)豐富，從中藥中開發(fā)OA新藥具有廣闊的發(fā)展前景。

既往研究表明，骨碎補對OA具有良好的治療作用[5]。從骨碎補中分離出來的木犀草素（結(jié)構(gòu)式見圖1）能夠抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的巨噬細胞激活，并能拮抗炎癥因子，從而發(fā)揮抗OA的作用[6]。木犀草素還具有良好的抗炎、抗氧化、抗腫瘤以及抗菌活性，除了OA外，臨床還用于治療重癥急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）、肝炎、心血管疾病等[7-9]。駱帝等[10]對骨碎補治療OA進行了系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，提示木犀草素是治療OA的有效成分之一，但是對于木犀草素治療OA的相關(guān)機制尚未深入研究，因此木犀草素的作用機制和治療靶點仍不清楚。計算釣靶法是采用計算方法將化合物、生物活性和疾病靶點信息聯(lián)系起來，通過識別生物活性小分子與疾病之間的相互作用蛋白，探索小分子對于疾病的作用機制，加快新藥開發(fā)的一種方法[11-13]。計算釣靶法能顯著改善藥物研發(fā)成本高、速度慢、效率低以及所需樣品量大等問題，有利于縮短新藥開發(fā)周期，因此本研究采用計算釣靶法對木犀草素抗OA的潛在靶點進行了篩選與分析，現(xiàn)報道如下。

圖1 木犀草素化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of luteolin

1 材料和方法

1.1 材料 所用的數(shù)據(jù)庫包括PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫及分析平臺 （Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）、人類孟德爾遺傳 （Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）數(shù)據(jù)庫（http：//www.omim.org/）、比較毒物遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫 （The Comparative Toxicogenomics Database，CTD）（https：//ctdbase.org/） 和藥物靶標數(shù)據(jù)庫 （Therapeutic Target Database，TTD） （http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）。所用服務(wù)器包括：Swiss TargetPrediction服務(wù)器（http：//www.swisstargetprediction.ch）、藥物再定位和藥物不良反應(yīng)預(yù)測 （predict drug repositioning and adverse drug reaction，DRAR-CPI）服務(wù)器 （https：//cpi.bio-x.cn/drar）及分子對接服務(wù)器（http：//www.dockingserver.com/web/docking）。

1.2 方法

1.2.1 藥理參數(shù)和分子特性評價 首先通過TCMSP數(shù)據(jù)庫對木犀草素體內(nèi)代謝的吸收 （absorption）、分布（distribution）、代謝（metabolism）及排泄（excretion）過程（縮寫為ADME）以及分子特性進行評價。

1.2.2 DRAR-CPI靶向蛋白預(yù)測 DRAR-CPI服務(wù)器可以通過分析蛋白質(zhì)的相互作用來預(yù)測化學(xué)成分的靶向蛋白。從PubChem數(shù)據(jù)庫下載木犀草素（Pub-Chem CID：5280445）的sdf文件，將其上傳到DRARCPI服務(wù)器，參數(shù)為默認值，篩選Z'值（Z'-score）＜-0.5的靶向蛋白。

1.2.3 Swiss TargetPrediction靶點預(yù)測 登陸Swiss TargetPrediction服務(wù)器，采用Marvin for JavaScript Version 6.1繪制木犀草素結(jié)構(gòu)，對其進行靶點篩選。

1.2.4 木犀草素抗OA靶點預(yù)測 將DRAR-CPI及Swiss TargetPrediction服務(wù)器共同預(yù)測到的木犀草素靶向蛋白作為潛在靶點信息，并與OMIM、CTD和TTD數(shù)據(jù)庫中已報道的與OA相關(guān)的疾病靶點進行匹配，選擇既是木犀草素靶向蛋白又是OA靶點者進行后續(xù)分析。

1.2.5 分子對接 首先將1.2.1和1.2.2涉及到的相關(guān)蛋白的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（Protein Data Bank，PDB）ID輸入到分子對接服務(wù)器（https：//www.dockingserver.com/web/docking），再將木犀草素的sdf文件上傳到服務(wù)器，點擊開始對接，并對結(jié)果進行分析。

2 結(jié)果

2.1 藥理參數(shù)和分子特性評價 掌握化合物的藥理參數(shù)與特性有助于深入了解該化合物的成藥性能，明確合適的劑型，能夠減少藥物研發(fā)前期的篩選操作。木犀草素口服生物利用度（oral bioavailability，OB）為36.16%，大于30%；藥物相似度（drug-likeness，DL）為0.25，大于0.18；可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù) （number of rotation bonds，RBN）為1，小于10，表明木犀草素口服吸收較好，具有較好的成藥性[14]。而半衰期（half-life，HL）為15.94h，半衰期較長，能維持長時間的療效，可以考慮制成一般口服制劑。木犀草素的分子量（molecular weight，MW）為286.25Da，小于500Da；油水分配系數(shù)（ACD oil water partition coefficient,AlogP）為2.07，小于5；氫鍵供體（hydrogen bonding donor，Hdon）為4，氫鍵受體（hydrogen bonding acceptor，Hacc）為6，均接近5，符合Lipinski五規(guī)則[15]，成藥可能性較高。

2.2 靶點預(yù)測 從Swiss TargetPrediction服務(wù)器篩選得到木犀草素的相關(guān)靶點15個；通過DRAR-CPI共篩選出389個靶向蛋白，其中Z'值＜-0.5的靶向蛋白共有273個，Z'值＜-0.5表明具有良好的靶向性；通過上述從Swiss TargetPrediction服務(wù)器和DRAR-CPI篩選到共有靶點6個。見表1。

將“osteoarthritis”分別輸入到CTD、OMIM以及TTD數(shù)據(jù)庫中，從CTD篩選到118個靶點蛋白，OMIM篩選到65個靶點蛋白，TTD篩選到21個蛋白，其中共有疾病靶點183個，將表1中的6個靶點蛋白與疾病靶點進行匹配，發(fā)現(xiàn)既是分子靶點又是疾病靶點的蛋白有2個，分別為MMP1和MMP3，具體篩選流程見圖2。

表1 Swiss TargetPrediction和DRAR-CPI篩選的木犀草素共有靶點Tab.1 Optimization of targets of luteolin by Swiss TargetPrediction and DRAR-CPI

圖2 木犀草素靶標鑒定流程圖Fig.2 Flow chart of target identification of luteolin

2.3 分子對接 采用dockingserver分子對接服務(wù)器對木犀草素和相關(guān)靶點蛋白進行分子對接。木犀草素與MMP1對接過程中抑制常數(shù)（inhibitory constant，Ki）=53.79μmol·L-1，自由結(jié)合能為-5.82kcal/mol；與MMP3對接過程中Ki=1.68μmol·L-1，自由結(jié)合能為-7.88kcal/mol。見表2。自由結(jié)合能小于-5kcal/mol，證明化合物與靶點具有較好的結(jié)合能力[16]，計算結(jié)果表明木犀草素具有結(jié)合MMP1和MMP3的能力。

木犀草素與MMP1的疏水相互作用殘基包括His218、Glu219、Asa180和Tyr210； 木犀草素與MMP3的疏水相互作用殘基包括Leu164、His224、Tyr220、His201、Phe232、Glu202、Tyr223、Ala200、Val198、Leu218和Leu197。見圖3。表明木犀草素可能通過這些關(guān)鍵殘基與MMP1和MMP3產(chǎn)生交互作用，從而發(fā)揮相應(yīng)的藥效。

3 討論

OA是一種以關(guān)節(jié)軟骨退化為特征的關(guān)節(jié)疾病?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一種鋅依賴性蛋白酶，它不僅在細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）分解過程中起著關(guān)鍵作用，而且對于關(guān)節(jié)炎和腫瘤侵襲等病理過程也具有重要意義[17]。炎癥過程中滑膜細胞釋放的多種炎癥介質(zhì)，如細胞因子、趨化因子、生長因子及MMPs等，均可能與OA疼痛有關(guān)；促炎細胞因子白細胞介素-1和腫瘤壞死因子-α通過釋放MMPs和細胞因子等下游炎癥介質(zhì)，在介導(dǎo)疼痛中發(fā)揮關(guān)鍵作用[18]。MMP1是一種分泌型金屬蛋白酶，能催化OA中基質(zhì)膠原的裂解，并能作用于白細胞介素-1β等細胞因子，其表達水平與OA軟骨病變的嚴重程度一致；由MMP1作用產(chǎn)生的尿膠原降解產(chǎn)物也與OA疼痛有關(guān)，它可以提高滑膜周圍神經(jīng)的敏感度，從而加重患者軟骨損傷的疼痛癥狀[19]。MMP3是MMP家族的一員，是ECM聯(lián)合調(diào)節(jié)劑，參與疾病發(fā)生、傷口愈合、組織修復(fù)和重塑[20]。研究發(fā)現(xiàn)，類風濕關(guān)節(jié)類患者關(guān)節(jié)滑膜細胞和滑膜組織中MMP3過表達，且其表達水平與病情嚴重程度呈正相關(guān)，抑制MMP-3的mRNA和蛋白表達，能夠起到保護軟骨、治療類風濕關(guān)節(jié)類的作用[21]。木犀草素與MMP1和MMP3能夠較好地結(jié)合，故筆者推測其能下調(diào)MMP1和MMP3表達，防止軟骨降解，促進新合成的ECM的積累，并抑制滑膜成纖維細胞增殖，最終緩解OA的炎癥反應(yīng)。

表2 木犀草素與MMP1和MMP3相互作用的分子對接數(shù)據(jù)Tab.2 Docking data of luteolin interacting with MMP1 and MMP3

圖3 木犀草素與MMP1和MMP3的分子相互作用Fig.3 Molecular interacting of luteolin with MMP1 and MMP3

綜上所述，本研究通過計算釣靶法證實MMP1和MMP3是木犀草素抗OA的潛在靶點。但本研究還存在以下不足：計算釣靶法作為一種系統(tǒng)研究藥物機制的新工具，雖然可以節(jié)約資源，減少篩選實驗，有利于快速、有效地找到藥物靶點，但是靶點預(yù)測主要依賴于現(xiàn)有的大數(shù)據(jù)，由于算法的不足，故還無法確定木犀草素抗OA的潛在劑量效應(yīng)結(jié)果；而且預(yù)測的靶點尚缺乏體內(nèi)和體外實驗的依據(jù)，因此下一步將針對以上靶點進行深入研究。