響應(yīng)面法優(yōu)化野生火棘果保健果酒發(fā)酵工藝

時(shí) 偉，付格紅，張 凱，吳德光*

（1.茅臺(tái)學(xué)院 釀酒工程系，貴州 仁懷 564500；2.陜西海升果業(yè)發(fā)展股份有限公司，陜西 西安 710100；3.陜西盤(pán)龍藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，陜西 西安 711400）

火棘果（Pyracantha fortuneana）又名火把果等，蘋(píng)果亞科火棘屬，據(jù)報(bào)道含有7種人體必需氨基酸和2種嬰幼兒必需氨基酸[1-2]，此外，還含有豐富的黃酮類(lèi)物質(zhì)、多酚、槲皮素等，具有提高免疫力、清除自由基、抗疲勞、抗腫瘤等功效[3-4]，主要分布于我國(guó)東南、西南和西北部地區(qū)，其中貴州省在黔南獨(dú)山縣、銅仁、畢節(jié)地區(qū)有大量分布[5]。枸杞（Lycium chinensis）又名枸杞子等，茄科枸杞屬，富含枸杞多糖、維生素C（vitamin C，VC）、亞油酸等多種活性成分[6-7]，是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食同源佳品。藥用種類(lèi)主要為寧夏枸杞[8]，具有良好的生理功效，可增強(qiáng)人體免疫能力，緩解腰肌酸痛和頭昏耳鳴等，主要分布于我國(guó)西北地區(qū)[9]。杜琨[10]利用單一酵母菌株發(fā)酵研究了金櫻子與火棘果復(fù)合制作保健果酒，產(chǎn)品具有獨(dú)特的金櫻子火棘果香；蔣春蘭等[11]的研究表明，火棘果酒的抗氧化作用非常強(qiáng)，對(duì)2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二胺鹽（2,2-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）自由基的清除作用明顯；聶中良等[12]研究了昆明地區(qū)野生火棘果釀酒工藝，其最佳發(fā)酵條件為初始糖度16%，初始pH值為7.0，發(fā)酵溫度27 ℃，酵母添加量0.7%，酒體呈亮紅色，具有火棘果果酒的獨(dú)特風(fēng)格；李秀秀等[13]研究了枸杞與石榴發(fā)酵釀酒工藝，其最佳發(fā)酵條件為石榴枸杞果汁體積比2∶1，酵母接種量3%，發(fā)酵時(shí)間6 d，發(fā)酵溫度28 ℃，酒體香純厚，透明度高；王玉良等[14]研究了黃精枸杞酒的成分，結(jié)果顯示黃精枸杞酒中富含大量的總皂苷、多糖和微量的黃酮類(lèi)化合物。目前主要使用單一菌株和單一原料進(jìn)行發(fā)酵釀造，利用枸杞復(fù)合其他原料釀酒已有報(bào)道，其釀酒工藝研究也越來(lái)越深入。

本試驗(yàn)以產(chǎn)自貴州畢節(jié)地區(qū)的野生火棘鮮果和寧夏枸杞干果為原料，利用本實(shí)驗(yàn)室保藏的兩株性能良好的酵母菌株，采用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵工藝條件，研發(fā)了一款具有良好保健功效的果酒產(chǎn)品，旨在探索貴州地區(qū)野生火棘果資源的深加工技術(shù)，以期帶動(dòng)當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)升級(jí)，助力國(guó)家精準(zhǔn)扶貧工程。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生火棘果：采自貴州畢節(jié)地區(qū)，選用飽滿(mǎn)完整無(wú)缺的新鮮火棘果，置于低溫冰箱中備用；枸杞干果：選購(gòu)自寧夏產(chǎn)區(qū)；產(chǎn)酯酵母菌株T6-1和耐酸酵母菌株Y2-1：本實(shí)驗(yàn)室篩選保藏；偏重亞硫酸（分析純）：天津化學(xué)試劑三廠；檸檬酸（分析純）：河南萬(wàn)恒生物科技有限公司；果膠酶（酶活3.0×104U/g）：河南樂(lè)泰食品有限公司；白砂糖：市售。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：酵母浸膏10g/L、葡萄糖20g/L、蛋白胨10 g/L，pH6.0，121 ℃條件下滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2104N電子分析天平：上海雙旭電子有限公司；HWS-12型電熱恒溫水浴鍋：常州市金壇華偉儀器廠；PLZ-1.5型榨汁機(jī)：江蘇海鷗食品機(jī)械制造公司；BKQ-B100II高壓蒸汽滅菌鍋：濟(jì)南來(lái)寶醫(yī)療器械有限公司；PAL-1糖度儀：河北潤(rùn)聯(lián)科技有限公司；LRH-500F生化培養(yǎng)箱：北京佳源興業(yè)科技有限公司；SW-CJ-2FD雙人單面垂直凈化工作臺(tái)：濟(jì)南東儀實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；PHS-3C pH計(jì)：杭州奧利龍儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程及操作要點(diǎn)[15-17]

將新采摘的火棘果進(jìn)行流水沖洗，破碎壓榨過(guò)程中注意避免果籽破碎，加入適量偏重亞硫酸鉀防止果汁發(fā)生氧化褐變。將枸杞干果以1∶5（g∶g）的比例加入90～95 ℃熱水中浸泡4 h，待充分吸水泡開(kāi)后進(jìn)行打漿處理，后與火棘果果汁混合。

果膠酶酶解：火棘果和枸杞中均含有果膠，前處理使用果膠酶酶解，可以加速出汁和促進(jìn)澄清，同時(shí)減少原酒中因果膠發(fā)酵分解而帶來(lái)的雜味?；旌瞎刑砑?5 mg/L果膠酶，并在25 ℃條件下酶解1.5 h。

硫處理：果酒發(fā)酵在預(yù)處理階段，通常要添加偏重亞硫酸鉀溶液，果汁中含有一定濃度的SO2，可以達(dá)到殺菌、抗氧化、增酸、單寧物質(zhì)溶出、使果酒整體風(fēng)味向好的作用?；旌瞎蠸O2添加量為70 mg/L。

成分調(diào)整：由于混合汁的糖度相對(duì)較低，為保證發(fā)酵成品果酒酒精度，通常要用白砂糖調(diào)整混合汁的糖度使其達(dá)到21%，同時(shí)用檸檬酸調(diào)整初始發(fā)酵pH值，保證發(fā)酵過(guò)程較好啟動(dòng)。

菌株活化：將實(shí)驗(yàn)室斜面保藏的兩株菌分別經(jīng)過(guò)在YEPD培養(yǎng)基和YPD培養(yǎng)基上逐級(jí)接種，同時(shí)都在28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h進(jìn)行逐級(jí)傳代培養(yǎng)。

主發(fā)酵：將兩株酵母菌按比例混合培養(yǎng)后接種至混合汁中，控制初始發(fā)酵糖度為21%，注意保持恒溫發(fā)酵，攪拌頻率為1 次/d。

后發(fā)酵：由于果渣及酵母發(fā)生沉淀，這時(shí)候可以進(jìn)行倒罐發(fā)酵30 d。

陳釀：新酒一般比較粗糙，將其放在陰涼避光處，通過(guò)一定時(shí)間貯存可以使酒體變得協(xié)調(diào)。

膜分離：灌裝前使用過(guò)濾膜處理酒體，可以使酒體更加澄清，穩(wěn)定性更好。

消毒、灌裝：灌裝后使用巴氏消毒得野生火棘果保健酒。

1.3.2 野生火棘果保健果酒工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

接種量的確定：以混合果汁體積的5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%分別進(jìn)行接種，于24 ℃恒溫發(fā)酵至殘?zhí)菫?.1%以下，以感官評(píng)分為考察指標(biāo)，分析接種量對(duì)野生火棘果保健果酒品質(zhì)的影響。

接種比例的確定：以產(chǎn)酯酵母∶耐酸酵母接種比例為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7（V/V）分別進(jìn)行接種，于24 ℃恒溫發(fā)酵至殘?zhí)菫?.1%以下，以感官評(píng)分為考察指標(biāo)，分析接種比例對(duì)野生火棘果保健果酒品質(zhì)的影響。

初始pH值的確定：用檸檬酸將發(fā)酵液初始pH值分別調(diào)為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，于24 ℃恒溫發(fā)酵至殘?zhí)菫?.1%以下，以感官評(píng)分為考察指標(biāo)，分析初始pH值對(duì)野生火棘果保健果酒品質(zhì)的影響。

發(fā)酵溫度的確定：分別于發(fā)酵溫度為18 ℃、20 ℃、22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃的條件下恒溫發(fā)酵至殘?zhí)菫?.1%以下，以感官評(píng)分為考察指標(biāo)，分析發(fā)酵溫度對(duì)野生火棘果保健果酒品質(zhì)的影響。

發(fā)酵時(shí)間的確定：分別將主發(fā)酵時(shí)間設(shè)為6 d、7 d、8 d、9 d、10 d、11 d、12 d，保持恒溫發(fā)酵，以感官評(píng)分為考察指標(biāo)，分析發(fā)酵時(shí)間對(duì)野生火棘果保健果酒品質(zhì)的影響。

1.3.3 野生火棘果保健果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取接種量（A）、初始pH值（B）、發(fā)酵溫度（C）、發(fā)酵時(shí)間（D）4 個(gè)因素為自變量，以野生火棘果保健果酒的感官評(píng)分（Y）為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法對(duì)野生火棘果保健果酒的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，最后對(duì)優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for wine fermentation technology optimization

1.3.4 分析檢測(cè)

（1）感官評(píng)定

邀請(qǐng)6位果酒品評(píng)師，從酒體外觀、香氣、沉淀、口感四個(gè)方面對(duì)野生火棘果保健果酒進(jìn)行感官評(píng)定，取平均值為每款酒最終感官評(píng)分[18]，滿(mǎn)分100分。野生火棘果保健酒的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 野生火棘果保健果酒感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standard of wild Pyracantha fortuneana health wine

（2）理化指標(biāo)

酒精度測(cè)定采用酒精計(jì)法；殘?zhí)橇繀⒄諊?guó)標(biāo)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測(cè)定[18]。

（3）微生物指標(biāo)

參照GB 4789.2—2016《菌落總數(shù)測(cè)定》[19]、GB 4789.3—2016《大腸菌數(shù)測(cè)定》[20]、GB 4789.4—2016《沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)》[21]及GB 4789.10—2016《金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生火棘果保健果酒發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 接種量對(duì)野生火棘果保健果酒品質(zhì)的影響

由圖1可知，酵母菌接種量在5%～11%時(shí)，野生火棘果保健果酒的感官評(píng)分隨著接種量的增加呈現(xiàn)先快速上升后緩慢下降的趨勢(shì)。當(dāng)接種量為9%時(shí)感官評(píng)分達(dá)到最高，為92分。原因可能是酵母菌接種量的變化，可以影響發(fā)酵的啟動(dòng)速率，從而影響酵母菌代謝產(chǎn)物和自身消解體在酒體中的含量。當(dāng)接種過(guò)量時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致酒體產(chǎn)生不良的酵母味；當(dāng)接種量不足時(shí)，又會(huì)使得酒體單薄、香氣不足而影響感官評(píng)分；接種量適宜時(shí)可以使得芳香類(lèi)物質(zhì)增多、酒體飽滿(mǎn)平衡，從而提高酒體品質(zhì)。因此，選擇最佳酵母菌接種量為9%。

圖1 接種量對(duì)野生火棘果保健果酒品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of inoculum on wild Pyracantha fortuneana health wine quality

2.1.2 酵母菌接種比例對(duì)野生火棘果保健果酒品質(zhì)的影響

由圖2可知，隨著兩株酵母菌接種比例的變化，野生火棘果保健果酒的感官評(píng)分呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)產(chǎn)酯酵母∶耐酸酵母為1∶4（V/V）時(shí)，感官評(píng)分最高，為87分。出現(xiàn)上述現(xiàn)象的原因可能是混菌比例不同導(dǎo)致發(fā)酵過(guò)程中兩株菌在發(fā)酵液中的數(shù)量也不盡相同，從而影響酒體中代謝產(chǎn)物積累，最終影響酒體的感官評(píng)分。因此，選擇最佳接種比例為產(chǎn)酯酵母∶耐酸酵母=1∶4（V/V）。

圖2 酵母菌接種比例對(duì)野生火棘果保健果酒品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of yeast inoculum ratio on wild Pyracantha fortuneana health wine quality

2.1.3 初始pH值對(duì)野生火棘果保健果酒品質(zhì)的影響

由圖3可知，隨著初始pH值增大，野生火棘果保健果酒的感官評(píng)分呈現(xiàn)出先快速升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)pH值為5.5時(shí)，感官評(píng)分最高，為88分。這可能是酵母菌生長(zhǎng)對(duì)pH值的變化比較敏感，極端pH值條件下，酵母菌產(chǎn)香能力和酒精代謝能力會(huì)受到抑制，使得酒體單薄味寡，只有在最適生長(zhǎng)pH值下，酵母菌生長(zhǎng)代謝活躍，向著更有利于產(chǎn)酒精和香氣的方向發(fā)展。因此，選擇最佳初始pH值為5.5。

圖3 初始pH值對(duì)野生火棘果保健果酒品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of initial pH on wild Pyracantha fortuneana health wine quality

2.1.4 發(fā)酵溫度對(duì)野生火棘果保健果酒品質(zhì)的影響

由圖4可知，隨著發(fā)酵溫度升高，野生火棘果保健果酒感官評(píng)分呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，發(fā)酵溫度為22 ℃時(shí)，感官評(píng)分最高，為93分。感官評(píng)分最高時(shí)的發(fā)酵溫度卻不是酵母菌的最適生長(zhǎng)溫度，原因是當(dāng)進(jìn)行低溫發(fā)酵時(shí)，可以有效將酵母菌代謝的香氣成分保留在酒體中，使得酒體宜人也不粗糙，低溫發(fā)酵已經(jīng)是一種趨勢(shì)。因此，選擇最佳發(fā)酵溫度為22 ℃。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)野生火棘果保健果酒品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on wild Pyracantha fortuneana health wine quality

2.1.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)野生火棘果保健果酒品質(zhì)的影響

由圖5可知，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，野生火棘果保健果酒感官評(píng)分呈現(xiàn)先快速增大再緩慢下降的趨勢(shì)。第8天時(shí)，野生火棘果保健果酒的感官評(píng)分最高，為93分。這是由于當(dāng)發(fā)酵時(shí)間較短時(shí)，發(fā)酵進(jìn)行不充分，殘?zhí)呛枯^高，酒精度和香氣成分還積累不夠，從而影響感官評(píng)分；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，發(fā)酵液環(huán)境惡化，不利于酵母菌生長(zhǎng)繁殖，這時(shí)候酵母菌可能會(huì)大量自溶或者代謝不良產(chǎn)物，從而影響酒體感官評(píng)分。因此，選擇最佳發(fā)酵時(shí)間為8 d。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)野生火棘果保健果酒品質(zhì)的影響Fig.5 Effect of fermentation time on wild Pyracantha fortuneana health wine quality

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

鑒于單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取接種量（A）、初始pH值（B）、發(fā)酵溫度（C）、發(fā)酵時(shí)間（D）等4個(gè)因素為自變量，以野生火棘果保健果酒感官評(píng)分（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 野生火棘果保健果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiments for wild Pyracantha fortuneana health wine fermentation technology optimization

續(xù)表

2.2.2 回歸模型的建立與方差分析

根據(jù)Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以感官評(píng)分為響應(yīng)值，利用Design-Expert.V8.06對(duì)表3試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，得回歸方程：Y=94.00+2.00A+0.17B-3.42C+3.92D+0.75AB-2.50AC-2.25AD+0.50BC+1.75BD-2.75CD-4.92A2-3.67B2-11.54C2-6.04D2

由表4可知，模型極為顯著（P＜0.001）。決定系數(shù)R2=0.972 7，校正決定系數(shù)R2Adj=0.945 3，失擬項(xiàng)P=0.214 3＞0.05，不顯著，綜上說(shuō)明回歸方程擬合度較好，自變量與響應(yīng)面之間線(xiàn)性關(guān)系顯著，可有效對(duì)野生火棘果保健果酒感官評(píng)分進(jìn)行理論預(yù)測(cè)。本模型中A、C、D、A2、B2、C2、D2對(duì)結(jié)果影響差異極顯著（P＜0.01），AC、AD、CD對(duì)結(jié)果影響差異顯著（P＜0.05），其余項(xiàng)差異為不顯著（P＞0.05）。根據(jù)表4的方差分析對(duì)野生火棘果保健果酒感官評(píng)分影響程度依次為：D＞C＞A＞B，即發(fā)酵時(shí)間＞發(fā)酵溫度＞接種量＞初始pH值。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of response surface experiments

圖6 各因素交互作用對(duì)野生火棘果保健果酒感官評(píng)分影響的響應(yīng)面和等高線(xiàn)Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on sensory evaluation score of wild Pyracantha fortuneana health wine

在其他試驗(yàn)自變量因素固定不變的條件下，考察兩兩因素的交互作用對(duì)野生火棘果保健果酒品質(zhì)的影響，用Box-Behnken試驗(yàn)得到的多元二次回歸模型制作響應(yīng)面圖，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，響應(yīng)面坡度越陡峭，表明響應(yīng)值對(duì)操作條件的改變?cè)矫舾校撘蛩貙?duì)野生火棘果保健果酒品質(zhì)的影響越大；反之則表明因素對(duì)野生火棘果保健果酒品質(zhì)影響越小。接種量與發(fā)酵溫度、接種量與發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵時(shí)間與發(fā)酵溫度之間的交互作用明顯，其他因素之間交互作用不是很顯著，這與表3中的方差分析結(jié)果是一致的。

2.2.3 最佳發(fā)酵工藝確定與驗(yàn)證試驗(yàn)

利用Design-Expert.V.8.06軟件進(jìn)行發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化組合，預(yù)測(cè)最佳工藝條件為：接種量9.18%、初始pH值5.56、發(fā)酵溫度21.58 ℃、發(fā)酵時(shí)間8.35 d，在此條件下野生火棘果保健果酒感官評(píng)分預(yù)測(cè)值為95.24分?？紤]到實(shí)際情況，將最佳工藝條件參數(shù)調(diào)整為接種量為9%、初始pH值為5.5、發(fā)酵溫度為22 ℃、發(fā)酵時(shí)間為8 d。在此工藝條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)取平均值實(shí)際感官評(píng)分為94.61分，與預(yù)測(cè)值偏差不大，說(shuō)明回歸模型能較好反應(yīng)野生火棘果保健果酒的發(fā)酵工藝。

2.3 野生火棘果保健果酒品質(zhì)評(píng)價(jià)

該發(fā)酵所得果酒色澤鮮艷、果香濃郁、口感醇厚、整體飽滿(mǎn)協(xié)調(diào)。酒精度為11.5%vol～12%vol，殘?zhí)牵?.1%。細(xì)菌總數(shù)＜50 CFU/mL；大腸菌群＜3 MPN/100 mL；未檢出沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌等致病菌。

3 結(jié)論

本研究以實(shí)驗(yàn)室保藏的耐酸酵母菌株Y2-1和產(chǎn)酯酵母菌株T6-1為試驗(yàn)菌株，將野生火棘果果汁與枸杞果漿混合，調(diào)節(jié)初始糖度為21%，果膠酶添加量為35 mg/L，SO2添加量為70 mg/L，以產(chǎn)酯酵母菌株T6-1和耐酸酵母菌株Y2-1接種比例為1∶4（V/V）進(jìn)行發(fā)酵。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以野生火棘果保健果酒感官評(píng)分為考察指標(biāo)，通過(guò)Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化，建立了野生火棘果保健果酒的最佳發(fā)酵工藝條件：接種量為9%，初始pH值為5.5，發(fā)酵溫度為22 ℃，發(fā)酵時(shí)間為8 d。在此條件下發(fā)酵的野生火棘果保健果酒色澤鮮艷、果香濃郁、口感醇厚、整體飽滿(mǎn)協(xié)調(diào)，酒精度為11.5%vol～12%vol，感官評(píng)分達(dá)到94.61 分。