HPLC 法測定丁樸凝膠貼膏中3 種成分

王奕博，杜媛媛，于穎超，曲昌海，尹興斌，董曉旭，孫毅坤，倪 健

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，北京 100029）

丁樸凝膠貼膏是以北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院臨床經(jīng)驗方——“胃癱外敷方”為基礎(chǔ)，原劑型為中藥細(xì)粉與蜂蜜等黏合劑混合成外敷制劑，現(xiàn)將其改為凝膠貼膏劑。該方臨床應(yīng)用多年，尤其對寒癥型術(shù)后胃癱患者效果顯著［1-2］，它由丁香、姜厚樸、肉桂等中藥組成，所含丁香酚、和厚樸酚、厚樸酚等成分具有促進(jìn)胃腸蠕動、保護(hù)胃黏膜、增強(qiáng)胃動力的作用［3-7］。本實驗建立HPLC 法測定這3 種成分的含有量。

凝膠貼膏性質(zhì)黏稠，而且部分高分子材料不溶于有機(jī)試劑，不同方法對其提取率有較大影響。目前，相關(guān)提取方法包括冷浸法、超聲法、分散后再處理法［8-11］，但鮮有對其所得提取率進(jìn)行比較，故本實驗又考察了超聲時間、冷浸時間、溶劑量、是否分散對丁樸凝膠貼膏提取率的影響，以期為后續(xù)研究提供借鑒。

1 材料

1.1 儀器 LC-20AT 型高效液相色譜儀（配置SPD-M20A PDA 檢測器，日本島津公司）；UltiMate 3000 型高效液相色譜儀［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；TLE204102型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ3200DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；JY5002 型電子天平（上海衡平儀器儀表廠）。

1.2 試劑與藥物 桂皮醛（批號110710-201720，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.7%）、丁香酚（批號110725-201716，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.6%）、和厚樸酚（批號110730-201614，質(zhì)量分 數(shù)99.3%）、厚樸酚（批號 110729-201714，質(zhì)量分 數(shù)100.0%）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。凝膠貼膏及缺肉桂、丁香、厚樸陰性貼膏均為自制。硅藻土（天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號20180320）。甲醇為色譜純（美國Fisher 公司）或分析純（北京化工廠）；水為純凈水（娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 凝膠貼膏制備 取處方量聚丙烯酸鈉、氫氧化鋁，混合均勻后加入甘油、中藥揮發(fā)油攪拌均勻，作為油相；取處方量酒石酸、純凈水、厚樸流浸膏攪拌均勻，作為水相；將水相均勻加到油相中，以60 r/min 左右轉(zhuǎn)速攪拌成型后置于無紡布上，將膏體均勻涂布于自制涂布框內(nèi)，加蓋壓花膜，室溫靜置，即得（生藥量15 g/貼）。

2.2 指標(biāo)成分含有量測定

2.2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相甲醇-水，梯度洗脫，程序見表1；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長290 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2.2 供試品溶液制備 取自制凝膠貼膏，揭下壓花膜，不銹鋼勺刮取0.5 g 置于蒸發(fā)皿中，精密稱定質(zhì)量，加入等量硅藻土，以鋼勺不斷擠壓攪拌至硅藻土與凝膠貼膏完全混勻，具體表現(xiàn)為貼膏外觀類似絮狀且黏性消失，即為分散完成。將其置于具塞錐形瓶中，精密加入50 mL甲醇，稱定質(zhì)量，超聲（100 W、40 kHz）10 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

表1 梯度洗脫程序

2.2.3 對照品溶液制備 精密稱取桂皮醛、丁香酚、和厚樸酚、厚樸酚對照品適量，加甲醇制成每1 mL 分別含四者0.107 24、1.073、0.158 6、0.334 mg，搖勻，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液制備 取等量缺肉桂、缺丁香、缺厚樸陰性樣品，按“2.2.2”項下方法制備，即得。

2.2.5 專屬性試驗 精密吸取供試品、對照品、陰性樣品溶液各10 μL，在“2.2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1，可知陰性無干擾，方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液0.1、1.0、2.0、3.0、6.0 mL 置于10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，在“2.2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系

2.2.7 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10 μL，在“2.2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得桂皮醛、丁香酚、和厚樸酚、厚樸酚峰面積RSD 分別為0.44%、0.50%、0.56%、0.38%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗 稱取凝膠貼膏約0.5 g，共6 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得桂皮醛、丁香酚、和厚樸酚、厚樸酚含有量RSD 分別為2.78%、2.73%、2.27%、1.61%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，于0、1、3、6、12、24 h 在“2.2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得桂皮醛、丁香酚、和厚樸酚、厚樸酚峰面積RSD 分別為2.59%、0.48%、1.42%、1.20%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗 精密稱取同一批含有量已知的凝膠貼膏0.5 g，共6 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，加入對照品溶液后在“2.2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，計算回收率。結(jié)果，桂皮醛平均加樣回收率為92.03%，RSD 為4.14%；丁香酚平均加樣回收率為98.03%，RSD 為1.56%；和厚樸酚平均加樣回收率為98.31%，RSD 為2.10%；厚樸酚平均加樣回收率為99.06%，RSD 為1.32%。

2.3 提取方式考察

2.3.1 凝膠貼膏制備 取適量丁香、肉桂混合揮發(fā)油及厚樸流浸膏，加入處方量輔料，即得（每1 g 含丁香酚7.69 mg、桂皮醛1.28 mg、和厚樸酚1.05 mg、厚樸酚2.03 mg）。

2.3.2 正交試驗 取0.5 g 凝膠貼膏，分別加入規(guī)定量硅藻土分散或不分散，并加50 mL 甲醇超聲或冷浸規(guī)定時間，以丁香酚、厚樸酚、和厚樸酚平均提取率為評價指標(biāo)，考察硅藻土分散比（A）、超聲時間（B）、冷浸時間（C）對其的影響，因素水平見表3，結(jié)果見表4。由此可知，除A1B1C1外，各組合所得提取率相差不大，推測這3 個因素之間可能存在相互作用，故對其進(jìn)行單因素試驗考察。

表3 因素水平

表4 試驗設(shè)計與結(jié)果

2.3.3 料液比、冷浸時間 取凝膠貼膏0.5、1、2 g，加50 mL 甲醇（即料液比1∶100、1∶50、1∶25）冷浸后，于10、20、30、60、120、180、240、360、480、600、720、1 440 min 各取樣1 mL，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，計算提取率，平行3 次，取平均值，結(jié)果見圖2。由此可知，料液比1∶100、冷浸時間2 h 時可得到90%以上的提取率。

圖2 不同料液比下冷浸時間對提取率的影響

2.3.4 不分散后超聲時間 取凝膠貼膏0.5 g，加50 mL甲醇超聲后，于10、20、30、40 min 各取樣1 mL，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，計算提取率，平行5 次，取平均值，結(jié)果見圖3。由此可知，提取40 min 時提取率仍不能達(dá)到90%，而且不同提取時間之間差異較大。

圖3 不分散后超聲時間對提取率的影響

2.3.5 分散后超聲時間 取凝膠貼膏0.5 g，加等量硅藻土分散，加50 mL 甲醇超聲后于10、20、30、40 min 各取樣1 mL，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，計算提取率，平行5 次，取平均值，結(jié)果見圖4。由此可知，提取10 min 時提取率即可達(dá)90%以上，而且不同提取時間之間差異較小，故確定最優(yōu)提取方法為加1 倍量硅藻土分散后超聲10 min。

圖4 分散后超聲時間對提取率的影響

2.3.6 樣品含有量測定 制備3 批樣品，按上述方法進(jìn)行測定，每批3 次。結(jié)果，丁香酚、和厚樸酚、厚樸酚平均含有量分別為7.54、1.00、1.79 mg/g。

3 討論

本實驗對丁樸凝膠貼膏中桂皮醛也進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)在貼膏制備過程中其失達(dá)40%，即使保證避光條件其平均加樣回收率亦僅為92.03%。桂皮醛在甲醇中的穩(wěn)定性較差，而且樣品分散可能導(dǎo)致其損失，故在提取含該成分的凝膠貼膏時應(yīng)避免使用硅藻土，同時提取溶液可選擇乙腈［12-13］。

考察冷浸時間時發(fā)現(xiàn)，取樣量0.5、1、2 g 條件下所得提取率大致相同，而貼膏體積越大，所需冷浸時間越長。然后，對三者對未達(dá)到穩(wěn)態(tài)部分的釋放曲線進(jìn)行擬合，發(fā)現(xiàn)均符合一級動力學(xué)方程（r分別為0.970 0、0.990 3、0.991 4），表明凝膠貼膏在有機(jī)試劑中并不會產(chǎn)生溶蝕作用，僅是類似于一種固體［14］，成分由內(nèi)而外被動擴(kuò)散，進(jìn)而解釋了不分散時為何需要長時間超聲才能達(dá)到90%以上提取率。

考察檢測波長時發(fā)現(xiàn)，290 nm 下桂皮醛、丁香酚、和厚樸酚、厚樸酚峰面積大小適中，故確定其作為檢測波長。

不使用硅藻土分散冷浸2 h 以上后，可充分提取0.5 g小塊凝膠貼膏，并且貼膏體積越大，所需冷浸時間越長，雖然超聲提取有助于指標(biāo)成分溶出，但也需要長時間才能達(dá)到90%以上提取率，同時RSD 也較大，其原因可能是不分散時凝膠貼膏性質(zhì)黏稠，取樣表面積差異較大，導(dǎo)致擴(kuò)散速度不同，從而放大誤差；使用硅藻土分散后超聲10、40 min 時，所得提取率基本接近，RSD 較小，為了節(jié)約時間、降低誤差，本實驗選擇分散后超聲提取10 min。

4 結(jié)論

本實驗通過HPLC 法測定丁樸凝膠貼膏中丁香酚、和厚樸酚、厚樸酚的含有量，其專屬性、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性均符合2015 年版《中國藥典》 藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則規(guī)定，可為該制劑質(zhì)量控制提供參考。