紫蘇葉提取物對黃嘌呤氧化酶的抑制作用

王亞楠，張志軍，李會珍

（中北大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，山西 太原 030051）

高尿酸血癥是由遺傳或后天因素引起的嘌呤代謝性疾病［1］，已被定為心血管疾病的危險(xiǎn)因子［2］。高濃度血清尿酸對腎有直接傷害，可導(dǎo)致腎纖維化、腎衰竭，也可誘發(fā)高血壓。高尿酸血癥是引發(fā)痛風(fēng)的重要生化基礎(chǔ)［3］。當(dāng)高尿酸血癥患者體內(nèi)的尿酸以鈉鹽的形式沉積在關(guān)節(jié)、軟組織處，就會引起組織炎癥進(jìn)而導(dǎo)致痛風(fēng)［4］。黃嘌呤氧化酶（XOD）是有效治療高尿酸血癥的重要靶點(diǎn)［5］，能催化次黃嘌呤生成黃嘌呤，再進(jìn)一步生成尿酸和自由基［6］，抑制其活性可以阻止黃嘌呤向尿酸轉(zhuǎn)化，降低體內(nèi)尿酸的含有量［7］，達(dá)到治療高尿酸血癥的目的。目前，臨床上治療高尿酸血癥和痛風(fēng)的藥物主要包括別嘌呤醇、奧昔嘌呤、非布司他、托匹司他、丙磺舒、苯溴馬隆等［8］，但均對人體有嚴(yán)重傷害，如常用藥物別嘌呤醇療效確切，但不良反應(yīng)也十分明顯，容易引起頭痛、惡心、白細(xì)胞異常等。因此，從天然植物中篩選高效、低不良反應(yīng)的黃嘌呤氧化酶抑制劑具有良好的應(yīng)用前景。

紫蘇Perilla frutescens（L.）Britt.屬一年生草本植物，是衛(wèi)生部首批頒布藥食兩用的中藥之一［9］。紫蘇葉既可鮮食，也可用于治療多種疾病，如鎮(zhèn)咳［10］、健胃、降血脂血壓［11］、增強(qiáng)記憶力［12-13］、解表散 寒［14］、抑 菌［15-16］等。Kaufmann 等［17］研究表明，紫蘇提取物在體外可抑制黃嘌呤氧化酶的活性，其中主要有效成分為野黃芩素-7-O-二葡萄糖苷、木犀草素-7-O-二葡萄糖苷、芹菜素-7-O-二葡萄糖苷等黃酮苷；Wang 等［18］采用超濾結(jié)合高效液相色譜法，鑒定出紫蘇提取物中山奈酚-3-O-蕓香苷、迷迭香酸、甲基迷迭香酸、芹菜素和4′，5，7-三甲氧基黃酮為有效的黃嘌呤氧化酶抑制劑；霍立娜［19］采用高速逆流色譜技術(shù)，從紫蘇葉70%乙醇提取物中得到3 種高純度的黃嘌呤氧化酶抑制劑化合物，即野黃芩素、木犀草素和芹菜素；肖小年等［20］研究表明，紫蘇子油對黃嘌呤氧化酶也有抑制作用?，F(xiàn)階段，針對紫蘇葉提取物對黃嘌呤氧化酶的抑制作用動力學(xué)尚未有深入詳細(xì)的研究和報(bào)道，故本實(shí)驗(yàn)對此進(jìn)行研究。

1 材料

1.1 試劑與藥物 紫蘇葉采自課題組專用品種，經(jīng)中北大學(xué)張志軍老師鑒定為正品，開花前收獲，自然晾干，去雜，粉碎過80 目篩，密封袋保存?zhèn)溆谩｜S嘌呤（批號D1828210）、別嘌呤醇（批號C1805121）購于上海阿拉丁生化科技有限公司；黃嘌呤氧化酶（批號611L011）購于北京索萊寶科技有限公司；其他試劑為分析純，均購于天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司。

1.2 儀器 SB-5200 DTDN 超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；TDL-5-A 臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；RE-5210A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；FD-1A-50 冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；AR1530 精密電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；UV-8000S 紫外分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）。

2 方法

2.1 紫蘇葉提取物制備 精密稱取紫蘇葉粉末50 g，加入1 000 mL 50%乙醇。浸泡2 h，超聲提取，功率200 W，時(shí)間1 h，溫度50 ℃。將上清液濾出，相同條件下將濾渣再提取2 次，合并濾液，離心除去殘?jiān)蒙锨逡河眯D(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，冷凍干燥，備用。在該提取條件下，紫蘇葉提取物的得率為31.3%。

2.2 酶活力測定 紫蘇葉提取物對黃嘌呤氧化酶活力測定方法參照文獻(xiàn)［21-22］加以改進(jìn)。將pH=7.5 磷酸緩沖液2.5 mL 置于試管中，加入0.6 mmol/L 黃嘌呤溶液2 mL，25 ℃水浴20 min，加入25 ℃預(yù)溫的0.05 U/mL 酶溶液0.5 mL，充分混勻，紫外分光光度計(jì)全波長掃描，確定反應(yīng)產(chǎn)物尿酸的特征吸收峰。采用相同的反應(yīng)體系，從黃嘌呤氧化酶加入時(shí)開始計(jì)時(shí)，測定在特征吸收峰下一定時(shí)間內(nèi)吸光度變化，即尿酸生成量，系統(tǒng)自動每1 s 測定1 次，連續(xù)5 min，每個(gè)樣品平行操作3 次，計(jì)算平均值。以反應(yīng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)作圖，直線斜率表示反應(yīng)速率（dA/min），斜率越大，說明酶活力越強(qiáng)，以每分鐘特征峰處吸光度值的增加來定義酶活力（dA/min），dA為吸光度的增加值。

2.3 紫蘇葉提取物對黃嘌呤氧化酶抑制作用的測定 5 mL酶促反應(yīng)體系中依次加入 pH=7.5 磷酸緩沖液、0.6 mmol/L黃嘌呤溶液、紫蘇葉提取物、0.05 U/mL 酶溶液，充分混勻，具體加樣量見表1。

表1 反應(yīng)體系

按“2.2”項(xiàng)下方法，測定一定時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物尿酸的吸光度，以反應(yīng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖，通過其斜率計(jì)算酶活力。加入紫蘇葉提取物時(shí)，酶活力表示為A；無紫蘇葉提取物加入時(shí)，酶活力表示為B，紫蘇葉提取物對黃嘌呤氧化酶的相對抑制率=（1-A/B）×100%。以空白組調(diào)零，測定樣品組A；以陰性對照組調(diào)零，測定陽性對照組B。

2.4 不同濃度紫蘇葉提取物對酶的抑制作用 按“2.2”項(xiàng)下方法，測定1、2、3、4、5、6、7 mg/mL 紫蘇葉提取物對黃嘌呤氧化酶的抑制率，將紫蘇葉提取物濃度與抑制率進(jìn)行回歸，得到回歸方程，再根據(jù)回歸方程計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）。在酶促反應(yīng)體系中，固定黃嘌呤溶液濃度（0.6 mmol/L）不 變，加入不同質(zhì)量 濃度紫 蘇提取 物（1.0、3.0、5.0 mg/mL），測定在 不同濃 度酶溶 液（0.025、0.05、0.10、0.15 U/mL）對酶活力的影響，即對反應(yīng)速率的影響。以酶濃度為橫坐標(biāo)，反應(yīng)速率為縱坐標(biāo)作圖，通過得到的相關(guān)曲線即可判斷紫蘇葉提取物對黃嘌呤氧化酶的抑制是否為可逆抑制。

2.5 紫蘇葉提取物對黃嘌呤氧化酶抑制動力學(xué)及抑制常數(shù)的測定 保持酶促反應(yīng)體系5 mL，首先固定酶濃度不變（0.05 U/mL），依次改變底物黃嘌呤溶液濃度（1.2、0.6、0.3、0.15 mmol/L），測定不同質(zhì)量濃度提取物（1.0、3.0、5.0 mg/mL）對酶活力的影響，即對反應(yīng)速率的影響。采用雙倒數(shù)作圖法（Lineweaver-Burk），以底物黃嘌呤溶液濃度的倒數(shù)1/ ［S］為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)速率的倒數(shù)1/V為縱坐標(biāo)作圖，判斷提取物對黃嘌呤氧化酶的抑制類型。再根據(jù)其抑制類型運(yùn)用Dixon 作圖法計(jì)算抑制動力學(xué)常數(shù)Ki。

3 結(jié)果

3.1 特征吸收峰的測定 按“2.2”項(xiàng)下方法，在反應(yīng)體系中依次加入各反應(yīng)物進(jìn)行反應(yīng)，對其產(chǎn)物進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果見圖1，可知酶反應(yīng)產(chǎn)物尿酸在294 nm 處有最大吸收峰。

圖1 反應(yīng)產(chǎn)物紫外吸收光譜圖

3.2 紫蘇葉提取物對黃嘌呤氧化酶的抑制率 以紫蘇葉提取物濃度為自變量，抑制率為因變量作圖，見圖2。由此可知，隨著紫蘇葉提取物質(zhì)量濃度增大抑制率不斷增強(qiáng)，說明提取物對黃嘌呤氧化酶的抑制是呈劑量依賴；在0～1 mg/mL時(shí)，抑制率隨著提取物質(zhì)量濃度升高呈線性增長；在1～5 mg/mL 時(shí)，隨著提取物質(zhì)量濃度增加抑制率增強(qiáng)，但增長趨勢較?。淮笥? mg/mL時(shí)，抑制率趨于恒定。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇紫蘇葉提取物質(zhì)量濃度為5 mg/mL。利用SPSS 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得出紫蘇葉提取物對黃嘌呤氧化酶的IC50為5.80 mg/mL。

圖2 紫蘇葉提取物質(zhì)量濃度對XOD 抑制率的影響

3.3 紫蘇葉提取物對黃嘌呤氧化酶的抑制作用 在反應(yīng)體系中，保持底物黃嘌呤溶液質(zhì)量濃度不變，分別測定1、3、5 mg/mL紫蘇葉提取物在不同酶濃度體系中的反應(yīng)速率，以黃嘌呤氧化酶濃度為橫坐標(biāo)，反應(yīng)速率為縱坐標(biāo)作圖。如圖3 所示，圖中直線基本經(jīng)過原點(diǎn)，且隨著提取物質(zhì)量濃度的增大，反應(yīng)速率隨之減小，表明紫蘇葉提取物對黃嘌呤氧化酶的抑制作用是可逆抑制。

3.4 紫蘇葉提取物對黃嘌呤氧化酶的抑制動力學(xué)分析

3.4.1 紫蘇葉提取物對黃嘌呤氧化酶的抑制類型 在反應(yīng)體系中，保持黃嘌呤氧化酶濃度不變，分別測定1、3、5 mg/mL紫蘇葉提取物在不同黃嘌呤溶液濃度體系中的反應(yīng)速率。用雙倒數(shù)作圖法作圖，以底物濃度的倒數(shù)［1/S］為橫坐標(biāo)，反應(yīng)速率的倒數(shù)［1/V］為縱坐標(biāo)作圖，得到一組直線，見圖4。由此可知，所有直線相交于縱軸上的一點(diǎn)，且縱軸的截距不隨提取物濃度的不同而改變，這些特點(diǎn)符合競爭性抑制。因此，紫蘇葉提取物對黃嘌呤氧化酶的抑制類型屬于競爭性可逆抑制。

圖3 紫蘇葉提取物對XOD 的抑制作用

圖4 紫蘇葉提取物對XOD 的抑制類型的影響

3.4.2Ki計(jì)算 采用Dixon 作圖法求Ki。對黃嘌呤溶液濃度0.15、0.30 mmol/L 兩個(gè)反應(yīng)體系進(jìn)行測定，以紫蘇葉提取物質(zhì)量濃度為自變量，反應(yīng)速率的倒數(shù)為因變量作圖。圖中直線相交于一點(diǎn)，計(jì)算出該點(diǎn)即可得Ki。如圖5 所示，紫蘇葉提取物對黃嘌呤氧化酶的Ki為2.19 mg/mL。

圖5 紫蘇提取物對XOD 抑制常數(shù)的影響

4 討論

本實(shí)驗(yàn)采用超聲輔助提取法從紫蘇葉中提取出黃嘌呤氧化酶抑制劑，利用紫外分光光度法對其進(jìn)行檢測，證明了確有該類成分，抑制作用為可逆的競爭性抑制，與別嘌呤醇相同?；诖?，在臨床上治療高尿酸血癥及痛風(fēng)時(shí)可以適量加入紫蘇葉中提取的黃嘌呤氧化酶抑制劑以減少別嘌呤醇的使用劑量，從而降低后者對患者的毒副作用。

此外，進(jìn)一步研究了對黃嘌呤氧化酶的抑制作用及抑制動力學(xué)，得出抑制劑對黃嘌呤氧化酶的 IC50為5.80 mg/mL，抑制動力學(xué)常數(shù)Ki為2.19 mg/mL。紫蘇葉提取物作為黃嘌呤氧化酶抑制劑，最大優(yōu)勢是無副作用、來源廣泛，可作為一種治療高尿酸血癥及痛風(fēng)低毒、價(jià)廉的潛在藥物，同時(shí)也可開發(fā)相關(guān)的保健品，應(yīng)用前景廣闊。本研究為紫蘇資源開發(fā)、尋求治療高尿酸血癥和痛風(fēng)新型藥物提供了參考依據(jù)，但其工業(yè)化提取、純化技術(shù)和臨床試驗(yàn)仍需要作深入系統(tǒng)研究。