基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究甘麥大棗湯改善睡眠障礙的作用機(jī)制

晏仁義陳襯心李赫宇張東星張 民?於洪建鄭艷超

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；2.天津益倍生物科技集團(tuán)有限公司，天津 300457）

睡眠障礙是指在睡眠時(shí)間和機(jī)會(huì)充足的情況下，發(fā)生反復(fù)入睡、睡眠維持與鞏固、睡眠質(zhì)量差等困難，導(dǎo)致患者日間功能受損。眾所周知，良好的睡眠是人體健康的基石，缺乏高質(zhì)量的睡眠會(huì)對(duì)人體器官造成不可逆的損傷。近年來隨著人們工作節(jié)奏的不斷加快，生活壓力的不斷加大，睡眠障礙的發(fā)病率也呈上升趨勢。據(jù)北京朝陽醫(yī)院發(fā)布的 《2018 中國睡眠質(zhì)量調(diào)查報(bào)告》顯示，在10 萬被調(diào)查人群中有83.81%經(jīng)常受到睡眠問題困擾。睡眠障礙會(huì)令人疲憊、記憶減退，且頭痛、目眩等癥狀同時(shí)出現(xiàn)，嚴(yán)重影響身體健康、生活質(zhì)量［1］。西藥治療多采用巴比妥類、苯二氮卓類等鎮(zhèn)靜安眠藥，但這些藥物會(huì)產(chǎn)生依賴、戒斷、宿醉等不良反應(yīng)。中醫(yī)學(xué)注重整體觀，具有豐富的理論與實(shí)踐基礎(chǔ)，且不良反應(yīng)少，因而受廣泛關(guān)注。

甘麥大棗湯出自 《金匱要略》，由甘草、小麥、大棗組成，3 味藥均為常見的藥食同源中藥。臨床和食療上，甘麥大棗湯用于調(diào)理睡眠障礙相關(guān)的精神類疾病，主治情志不舒、思慮過度、躁擾不寧的臟躁癥［2］。邵圓［3］采用隨機(jī)抽取方法對(duì)門診產(chǎn)后女性睡眠障礙進(jìn)行觀察，給予甘麥大棗湯治療2 周后，患者的匹茲堡睡眠表評(píng)分有所改善，糾正了抑郁狀態(tài)。李先曉等［4］通過臨床觀察發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用甘麥大棗湯合酸棗仁湯加減可有效改善更年期患者的失眠癥狀?，F(xiàn)代研究［5］表明甘麥大棗湯具有鎮(zhèn)靜、催眠、抗抑郁等藥理作用，但目前對(duì)甘麥大棗湯中的化學(xué)成分及如何發(fā)揮治療睡眠障礙的作用機(jī)制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是建立在多基因、多通路、多途徑的多層次網(wǎng)絡(luò)基礎(chǔ)上，用于從整體研究中藥，具有獨(dú)特的優(yōu)勢［6］。故本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討甘麥大棗湯改善睡眠障礙主要活性成分和作用機(jī)制。

1 方法

1.1 目標(biāo)化合物的收集 采用TCMSP 數(shù)據(jù)庫（http：//lsp.nwu.edu.cn/），提取甘草、大棗、小麥中化學(xué)成分，以口服生物利用度（Oral bioavailabiliy，OB）≥20% 和類藥性（Drug-likeness，DL）≥0.18% 作為活性成分篩選條件，同時(shí)結(jié)合2015 年版《中國藥典》 及文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)具有藥理活性的化學(xué)成分提取。

1.2 目標(biāo)化合物作用靶點(diǎn)的預(yù)測 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫提取活性成分的作用靶點(diǎn)，將靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niProt 數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org/）獲得靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因名稱。或通過PubChem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）提取活性成分的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入Swiss 數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）獲得靶點(diǎn)的基因名稱。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

1.3.1 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 將化合物和對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)整合到Excel 表格中，利用Cytoscape軟件繪制甘麥大棗湯的活性成分-靶點(diǎn)的（Component-Target，C-T）網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3.2 睡眠障礙相關(guān)靶點(diǎn)收集 將“Sleep disorders”關(guān)鍵詞輸入 到DrugBank（https：//www.drugbank.ca）數(shù)據(jù)庫中，對(duì)調(diào)控睡眠障礙的基因進(jìn)行檢索，得到共計(jì)174 個(gè)作用靶點(diǎn)。

1.3.3 “關(guān)鍵成分-關(guān)鍵靶標(biāo)-關(guān)鍵通路”的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 將甘麥大棗湯活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，睡眠障礙對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)分別導(dǎo)入BioGRID 數(shù)據(jù)庫（https：//thebiogrid.org/），構(gòu)建睡眠障礙蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)和甘麥大棗湯化學(xué)成分蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。將睡眠障礙蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)和甘麥大棗湯化學(xué)成分蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分別導(dǎo)入Cytoscape 軟件，運(yùn)用Merge 將睡眠障礙靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)與甘麥大棗湯化學(xué)成分蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)起來，采用Network analysis 對(duì)網(wǎng)絡(luò)表征進(jìn)行分析，獲取蛋白相互作用關(guān)系，保存CSV 格式文件，并提取degree＞4作為關(guān)鍵靶點(diǎn)。

采用 DAVID 數(shù)據(jù)庫（http：//davki.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp，version 6.7）對(duì)甘麥大棗湯作用于睡眠障礙的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行生物通路分析，選擇P＜0.05，作為與靶點(diǎn)密切相關(guān)的重要作用通絡(luò)，使用Omicshare（https：//www.omicshare.com/tools/Home/index/index.html）對(duì)富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化，分析甘麥大棗湯治療睡眠障礙的可能作用機(jī)制。

根據(jù)DAVID 數(shù)據(jù)庫關(guān)鍵通路中對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，及靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)化學(xué)成分，構(gòu)建“關(guān)鍵成分-關(guān)鍵靶標(biāo)-關(guān)鍵通路”Excel 表格，運(yùn)用Cytoscape 軟件構(gòu)建“關(guān)鍵成分-關(guān)鍵靶標(biāo)-關(guān)鍵通路”相關(guān)靶標(biāo)相互作用所構(gòu)建的多層次多靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 活性化學(xué)成分的篩選 以O(shè)B ≥20% 且DL≥0.18為篩選條件，同時(shí)結(jié)合藥典及文獻(xiàn)報(bào)道的主要成分，有些成分雖不符合要求，但文獻(xiàn)報(bào)道具有較強(qiáng)的相關(guān)藥理活性，本研究也將其納入活性成分，如甘草酸苷、異甘草素、刺甘草查爾酮等［7-9］。通過篩選，最終獲得127 個(gè)化合物（甘草95 個(gè)，小麥9 個(gè)，大棗23 個(gè)）。且不同藥材之間所含化合物有重疊，如甘草、大棗中都含有C3（白樺脂酸）、C7（齊墩果酸）、C95（槲皮素）等5 個(gè)化合物。有研究報(bào)道，甘草中甘草次酸能促進(jìn)大腦分泌內(nèi)源性物質(zhì)，從而改善睡眠作用［10］；大棗水提取物可調(diào)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)及抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)內(nèi)源性物質(zhì)分泌，改善睡眠［11］。

表1 各化合物信息Tab.1 Information of various compounds

續(xù)表1

續(xù)表1

2.2 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將篩選出的活性成分和靶點(diǎn)相連構(gòu)建（C-T）網(wǎng)絡(luò)圖（圖1）。圖中共涉及365 個(gè)節(jié)點(diǎn)（127 種化學(xué)成分和238 個(gè)靶點(diǎn)）。不同形狀的節(jié)點(diǎn)分別代表活性成分和靶點(diǎn)，圓形代表作用靶點(diǎn)，V 節(jié)點(diǎn)代表活性成分，邊代表活性成分和作用靶點(diǎn)間的相互關(guān)聯(lián)。網(wǎng)絡(luò)中，degree 值可反映節(jié)點(diǎn)的重要性，其中degree 值排名靠前的化合物中甘草成分主要有山柰酚（degree=50）、甘草查爾酮A（degree=31）、異甘草 素（degree=29）、甘草素（degree=10）、甘草次酸（degree=6）等；小麥中主要有谷胱甘肽（degree=15）、玉米黃質(zhì)（degree=15）、豆甾醇（degree=15）等；大棗中主要有β-胡蘿卜素（degree=22）、兒茶素（degree=18）、西托糖苷（degree=16）等。

2.3 睡眠障礙靶點(diǎn)收集 對(duì)調(diào)控睡眠障礙相關(guān)的基因在DrugBank 數(shù)據(jù)檢索收集，共有174 個(gè)與睡眠障礙相關(guān)的疾病靶標(biāo)用于網(wǎng)絡(luò)分析，與睡眠障礙相關(guān)的靶標(biāo)信息，見圖2。

2.4 “關(guān)鍵成分-關(guān)鍵靶標(biāo)-關(guān)鍵通路”的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將甘麥大棗湯化學(xué)成分相互作用網(wǎng)絡(luò)和睡眠障礙相互作用網(wǎng)絡(luò)互作之后的關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫，對(duì)甘麥大棗湯治療睡眠障礙121 關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 生物通路富集分析。選擇P＜0.05，篩選排名靠前的關(guān)鍵通路，用基因個(gè)數(shù)、P值和Rich factor 來衡量KEGG 富集程度，見圖3。Rich factor 是目標(biāo)基因集中在這個(gè)通路的基因數(shù)量/背景基因集中在這個(gè)通路的基因數(shù)量，且Rich factor越大，表示富集程度越高。研究發(fā)現(xiàn)，靶點(diǎn)主要富集于HIF-1、ErbB、雌激素等信號(hào)通路，采用Cytoscape軟件構(gòu)建“關(guān)鍵成分-關(guān)鍵靶標(biāo)-關(guān)鍵通路”相關(guān)靶標(biāo)相互作用所構(gòu)建的多層次多靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖，見圖4。

3 討論

圖3 通路富集氣泡圖Fig.3 Pathway enrichment bubble diagram

本文對(duì)甘麥大棗湯化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)degree 值較高的化合物包括3 個(gè)黃酮類，分別為山柰酚（degree=50）、甘草查爾酮A（degree=31）、異甘草素（degree=29）；肽類化合物谷胱甘肽（degree=15）；萜類化合物β-胡蘿卜素（degree=22）。有文獻(xiàn)報(bào)道，山奈酚能改善腦缺血大鼠的海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)，具有神經(jīng)保護(hù)作用，改善認(rèn)知功能障礙［12-13］。谷胱甘肽是一種具有重要生物活性的天然活性肽，在神經(jīng)系統(tǒng)中，作為一種輔酶因子充當(dāng)神經(jīng)遞質(zhì)，抑制氧化應(yīng)激介導(dǎo)而發(fā)揮作用［14-15］。β-胡蘿卜素是一種抗氧化劑，膳食攝入可以降低阿爾茨海默病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)［16］。

圖4 成分-靶標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Component-target-pathway network

本研究基于甘麥大棗湯化學(xué)成分238 個(gè)靶點(diǎn)和睡眠障礙174 個(gè)靶點(diǎn)互作，預(yù)測甘麥大棗湯治療睡眠障礙的主要作用靶點(diǎn)。通過網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，GSK3B（degree=14）、CALM1（degree=13）、MAPK14（degree=13）、AKT1（degree=12）、MAPK1（degree=12）、ESR2（degree=11）等中心度較高的靶點(diǎn)。有研究報(bào)道，GSK3B 是一類在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)高表達(dá)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與大腦神經(jīng)元的再生過程［17］。周彩鳳［18］以四動(dòng)脈結(jié)扎全腦缺血模型，研究延后性腦缺血后處理介導(dǎo)的大鼠海馬CA1 區(qū)Akt/GSK3B 信號(hào)介導(dǎo)通路，發(fā)現(xiàn)延遲性腦缺血后處理能夠誘導(dǎo)線粒體內(nèi)GSK3B 磷酸化水平升高。MAPK1 和MAPK14 均是絲氨酸/蘇氨酸激酶，MAP 激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要組成部分。甘草總黃酮通過MAPKs 中的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)ERK 信號(hào)通路，抑制iNOS和COX-2 基因和蛋白的表達(dá)，而起到抗炎效果［19］。AKT1 是3種密切相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶之一，磷酸化后AKT 活化，進(jìn)一步激活或抑制下游mTOR、GSK 等，參與調(diào)控細(xì)胞存活、生長、代謝［20］。在成人神經(jīng)發(fā)生過程中，AKT 是AKT-mTOR 信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，控制新生神經(jīng)元整合過程的節(jié)奏，包括神經(jīng)元的正確定位、樹突發(fā)育和突觸形成。ESR1 是一種配體依賴的轉(zhuǎn)錄因子，是雌激素及選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)生物學(xué)效應(yīng)的主要介導(dǎo)者［21］。研究發(fā)現(xiàn)，ESR1 在MAPK/ERK 和PI3K/AKT 信號(hào)通路中，可迅速激活生長因子相關(guān)的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而增強(qiáng)細(xì)胞增殖能力［22］。

KEGG 生物通路富集分析發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵靶點(diǎn)主要富集于HIF-1、ErbB、雌激素等信號(hào)通路。HIF-1 信號(hào)通路是機(jī)體應(yīng)對(duì)缺氧時(shí)，在機(jī)體形成復(fù)雜的反應(yīng)機(jī)制中發(fā)揮重要作用，其HIF-1α 是唯一一個(gè)特異性缺氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的轉(zhuǎn)錄因子，參與了PI3K/AKT/HIF-1α、MAPK/HIF-1α 等多條細(xì)胞信號(hào)通路，是介導(dǎo)缺氧信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)中樞［23］。ErbB 信號(hào)通路是參與編碼髓鞘蛋白，促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘形成，保證神經(jīng)系統(tǒng)功能正常運(yùn)轉(zhuǎn)［24］。在神經(jīng)系統(tǒng)中，ErbB 與NRG1 結(jié)合后，胞內(nèi)發(fā)生自身酪氨酸磷酸化，并激活下游的Ras/MAPK、PI3K/AKT［25］。甘草查爾酮A 通過抑制PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路而抑制腎癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，可誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞自噬［26］。雌激素可以通過調(diào)節(jié)5-HT、GABA、NA、多巴胺等覺醒神經(jīng)遞質(zhì)，可間接影響睡眠-覺醒周期，改變睡眠模式［27］。

綜上所述，本研究用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法初步探討了甘麥大棗湯配方的主要活性成分、對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)、相關(guān)疾病及作用生物通路。結(jié)果篩選到127 個(gè)化合物，174 個(gè)與睡眠障礙相關(guān)的靶點(diǎn)，靶點(diǎn)主要對(duì)應(yīng)10 條生物通路，為進(jìn)一步深入探究其作用機(jī)制奠定了良好的基礎(chǔ)。