WNK1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況及對(duì)預(yù)后的影響

劉利佳，吳欣愛，董文杰，李慧霞

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 腫瘤科，河南 鄭州 450052)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，和肺癌、乳腺癌一同被列為當(dāng)前全球的三大惡性腫瘤。2018年全球新發(fā)CRC病例共1 800 977例，占惡性腫瘤發(fā)病總數(shù)的10.2%，發(fā)病率在總?cè)巳褐袃H次于肺癌和乳腺癌，位列第3。死亡861 663例，占惡性腫瘤死亡總數(shù)的9.2%，死亡率在總?cè)巳褐袃H次于肺癌，位列第2[1]。近年來我國CRC發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢(shì)[2]。癌胚抗原和糖類抗原是當(dāng)前CRC臨床診斷中常用的腫瘤標(biāo)志物，但這些標(biāo)志物的敏感性和特異性不理想，因此急需尋找新的腫瘤標(biāo)志物以及評(píng)估患者預(yù)后較靈敏的指標(biāo)。WNK1[不含賴氨酸(K)1]是WNK激酶家族的成員之一，是一種位于集合管遠(yuǎn)端腎單位的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[3]。WNK1在腫瘤細(xì)胞增殖、代謝適應(yīng)、凋亡逃避、浸潤轉(zhuǎn)移中起重要作用[4]。Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)是發(fā)育的核心，HEK293T細(xì)胞中下調(diào)WNK1和WNK2，顯著降低了Wnt信號(hào)基因的表達(dá)，表明敲除WNK1、WNK2基因降低了HEK293T細(xì)胞的活性[5]。Vegf/Vegfr信號(hào)通路通過Akt激酶介導(dǎo)的磷酸化和WNK1的激活以及斑馬魚中WNK1的表達(dá)調(diào)控血管生成，提高了WNK1促進(jìn)癌組織中血管生成的可能性[6]。ZHANG等[7]研究發(fā)現(xiàn)，WNK1作為細(xì)胞質(zhì)第二信使參與Cl-通道誘導(dǎo)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)血管增生。根據(jù)以上研究推測(cè)，WNK1的表達(dá)與腫瘤的侵襲性行為相關(guān)。據(jù)報(bào)道，WNK1基因的拷貝數(shù)在CRC中是異常的[8]。然而WNK1在CRC中的表達(dá)情況以及其對(duì)CRC患者的影響尚無報(bào)道。本研究探討WNK1在CRC中的表達(dá)情況及其對(duì)結(jié)直腸癌預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1 患者組織芯片研究樣本為上海生物科技有限公司組織標(biāo)本庫提供的68例CRC組織?；颊呤中g(shù)時(shí)間為2006年7月至2007年5月，最后1次隨訪時(shí)間為2014年8月。根據(jù)TNM對(duì)腫瘤進(jìn)行臨床病理分期。其中男41例，女27例，中位年齡55歲。每個(gè)研究標(biāo)本均提供癌組織及癌旁組織，癌旁組織距癌1.5 cm。

1.2 免疫化學(xué)染色組織樣本按標(biāo)準(zhǔn)程序處理為福爾馬林固定石蠟包埋組織。兩名專業(yè)的病理學(xué)家對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行復(fù)檢。根據(jù)陽性程度將標(biāo)本分為3個(gè)等級(jí)：1級(jí)(0%～25%陽性)，2級(jí)(26%～50%陽性)和3級(jí)(51%～100%陽性)。統(tǒng)計(jì)分析中1、2級(jí)為陰性，3級(jí)為陽性。癌組織中WNK1表達(dá)陽性38例，陰性30例，癌旁組織中WNK1表達(dá)陽性10例，陰性58例。

1.3 細(xì)胞系、化學(xué)物質(zhì)和抗體本實(shí)驗(yàn)室在體積分?jǐn)?shù)為10%DMEM液的胎牛血清中保存了兩株CRC細(xì)胞株(HCT116和HCT15)。胎牛血清和DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司。Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司。針對(duì)WNK1的抗體購自Abclonal公司。粘連蛋白、波形蛋白和肌動(dòng)蛋白抗體均購自Cell Signaling Technology公司。通過小干擾RNA(siRNA)誘導(dǎo)WNK1基因抑制。WNK1 siRNAs的序列為:上游引物5’-CAAUGSGUCAGAUAUACGAAtt-3’；下游引物5’-UUCGAUAUCUGACUCAUUGtc-3’；轉(zhuǎn)染前24 h將體積分?jǐn)?shù)為10%DMEM液的胎牛血清中的HCT116和HCT15細(xì)胞接種于6孔板中(每2 mL每孔105個(gè)細(xì)胞)。Lipofectamine 2000 /siRNA的準(zhǔn)備是在500 μL不含血清的optiMEM中加入siRNA和5 μL Lipofectamine 2000。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在37 ℃溫度下孵育48 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆體通過蛋白免疫印跡法檢測(cè)得到驗(yàn)證。

1.4 蛋白免疫印跡收集細(xì)胞樣本，將樣品(20 μg)的細(xì)胞裂解物在體積分?jǐn)?shù)為10%的SDS-PAGE中進(jìn)行凝膠電泳，然后將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用50 g·L-1的脫脂奶粉和體積分?jǐn)?shù)為0.1%的Tween20在三倍緩沖鹽水中封閉膜，并用抗體探測(cè)，之后使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯影。

1.5 Transwell實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞濃度為1×105個(gè)·mL-1、體積分?jǐn)?shù)為0.1%胎牛血清的DMEM接種在室板(BD Biosciences)中的Transwell過濾器(8 μm孔徑)的每個(gè)小室上部培養(yǎng)嵌室內(nèi)。在底部培養(yǎng)室每室加入1.5 mL體積分?jǐn)?shù)為20%胎牛血清的DMEM。在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，用棉棒輕輕擦去嵌室底部?jī)?nèi)表面的細(xì)胞。用多聚甲醇固定并用Giemsa染色。顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野, 統(tǒng)計(jì)小室細(xì)胞的遷移數(shù), 取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)以每孔5×105個(gè)細(xì)胞將對(duì)數(shù)期siWNK1細(xì)胞及轉(zhuǎn)染空載體對(duì)照組細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h。用1 mL槍頭在孔內(nèi)沿直徑方向畫粗細(xì)均勻的1條豎線，用PBS洗細(xì)胞2次，去除脫落細(xì)胞，并將其放入培養(yǎng)箱中，0 h和48 h時(shí)在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞劃痕的狀態(tài)并拍照。計(jì)算劃痕的相對(duì)愈合率。公式為：劃痕的相對(duì)愈合率=(0 h的劃痕寬度-48 h的劃痕寬度)/ 0 h的劃痕寬度×100%。

2 結(jié)果

2.1 WNK1在CRC及癌旁組織中的表達(dá)情況CRC組織WNK1的表達(dá)陽性率[(55.9%(38/68)]高于癌旁組織[14.7%(10/68)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。WNK1的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)(均P<0.05)；WNK1表達(dá)與年齡、性別、腫瘤直徑和腫瘤浸潤深度無關(guān)(均P>0.05)。見表1。

表1 WNK1表達(dá)和CRC臨床病理特征的關(guān)系(n)

2.2 WNK1表達(dá)與CRC患者OS和PFS的關(guān)系WNK1高表達(dá)CRC患者OS率和PFS率均低于WNK1低表達(dá)患者(均P<0.05)。見圖1、2。

圖1 WNK1表達(dá)對(duì)CRC患者OS的影響

圖2 WNK1表達(dá)對(duì)CRC患者PFS的影響

2.3WNK1基因?qū)ι掀ぜ?xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的影響經(jīng)蛋白免疫印跡法證實(shí)，WNK1在HCT116和HCT15細(xì)胞系中的表達(dá)均下調(diào)，HCT116細(xì)胞中灰度降低72%，HCT15細(xì)胞中灰度降低85%。見圖3。在HCT116和HCT15細(xì)胞中，WNK1的下調(diào)可恢復(fù)上皮標(biāo)志物鈣黏附蛋白E的表達(dá)，并伴隨間質(zhì)標(biāo)記物波形蛋白的丟失。見圖4。

圖3 蛋白免疫印跡法檢測(cè)確認(rèn)HCT116和HCT15中瞬時(shí)siRNA轉(zhuǎn)染敲低WNK1

圖4 蛋白免疫印跡法檢測(cè)WNK1下調(diào)對(duì)鈣黏附蛋白E及波形蛋白的影響

2.4WNK1基因?qū)RC細(xì)胞遷移能力的影響Transwell結(jié)果顯示，采用siRNA抑制WNK1基因后HCT116細(xì)胞中通過濾膜遷移至下室的細(xì)胞(57.00±4.36)少于轉(zhuǎn)染空載體對(duì)照組(230.00±8.89)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HCT15細(xì)胞中通過濾膜遷移至下室的細(xì)胞(61.00±3.61)少于轉(zhuǎn)染空載體對(duì)照組(241.00±5.52)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在HCT116中下調(diào)WNK1基因后細(xì)胞48 h劃痕愈合率(10.7%)低于轉(zhuǎn)染空載體對(duì)照組(60.3%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在HCT15中下調(diào)WNK1基因后細(xì)胞48 h劃痕愈合率(7.8%)低于轉(zhuǎn)染空載體對(duì)照組(45.8%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖6。

圖5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)下調(diào)WNK1對(duì)HCT116和HCT15細(xì)胞遷移能力的影響

圖6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)WNK1對(duì)HCT116和HCT15細(xì)胞遷移能力的影響

3 討論

CRC由于早期癥狀缺乏或不典型，就診時(shí)往往已為進(jìn)展期腫瘤，且CRC患者生存率與其分期密切相關(guān)，Ⅰ期與Ⅳ期患者5年生存率分別為93%和8%[9]。尋找方便靈敏的指標(biāo)或方法來篩選腫瘤及評(píng)估預(yù)后是提高CRC患者生存期的有效方法。

絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶是一種保持血壓穩(wěn)態(tài)的重要蛋白激酶，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，WNK1激活OSR1信號(hào)級(jí)聯(lián)是調(diào)控小鼠胚胎發(fā)育過程中血管生成和心臟形成的重要途徑[10]，而新生血管形成在腫瘤性疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。肺癌組織中抑制WNK1可逆轉(zhuǎn)EMT和癌細(xì)胞遷移[11]。研究發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌中一種新的WNK1-ROS1融合，對(duì)克唑替尼敏感，WNK1-ROS1重排似乎是非小細(xì)胞肺癌的一個(gè)新的驅(qū)動(dòng)因素[12]。有證據(jù)表明PDK1/WNK1信號(hào)通路與乙肝相關(guān)性肝癌有關(guān)，p-PDK1和p-WNK1在乙肝相關(guān)性肝癌細(xì)胞中上調(diào)[13]。Kim等[14]最新研究表明，WNK1通過激活TRPC6促進(jìn)腎透明細(xì)胞癌增殖和遷移，通過激活TRPC6-NFAT通路促進(jìn)腎腫瘤進(jìn)展，WNK1是腎透明細(xì)胞癌潛在診斷標(biāo)準(zhǔn)物。Costa等[15]在甲狀腺乳頭狀癌中發(fā)現(xiàn)嵌合轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物WNK1-B4GALNT3，并與B4GALNT3過表達(dá)相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)性卵巢癌細(xì)胞中WNK1蛋白水平高于匹配的原發(fā)腫瘤細(xì)胞[16]。據(jù)報(bào)道，WNK1-OSR1激酶介導(dǎo)的NKCC磷酸化激活促進(jìn)膠質(zhì)瘤遷移[17-18]。WNK1的下調(diào)降低了前列腺和神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞遷移和侵襲能力[19-20]。此外，Desjardins等[21]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，WNK1-SPAK/OSR1信號(hào)通路通過調(diào)節(jié)NKCC1和KCC2參與了大鼠骨腫瘤疼痛的形成，WNK1-SPAK/OSR1信號(hào)可能是骨腫瘤疼痛治療的潛在靶點(diǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，CRC組織中WNK1的表達(dá)陽性率高于癌旁組織。此外，WNK1的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)。WNK1高表達(dá)CRC患者OS率和PFS率均低于WNK1低表達(dá)患者，提示W(wǎng)NK1可能參與了CRC的復(fù)發(fā)。為進(jìn)一步證明WNK1在CRC中的作用，采用蛋白免疫印跡法對(duì)細(xì)胞的上皮和間質(zhì)標(biāo)志物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在體外抑制WNK1基因可抑制EMT。Transwell分析與劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí)了在體外抑制WNK1基因可抑制CRC細(xì)胞的遷移能力。

WNK1在CRC中的表達(dá)顯著高于正常結(jié)直腸組織，且WNK1高表達(dá)與CRC TNM分期及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)。抑制WNK1基因可抑制EMT和CRC細(xì)胞的遷移能力。因此，WNK1基因的表達(dá)水平可能成為評(píng)估CRC預(yù)后的重要指標(biāo)和潛在的治療靶點(diǎn)，但具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。