用于腫瘤免疫治療的干擾素基因刺激因子激動劑的研究進展

吉力揚，郝 婧，王國成，謝唯佳

（1中國藥科大學(xué)藥物化學(xué)教研室，南京210009；2天士力控股集團有限公司天士力研究院，天津300410）

腫瘤免疫療法是繼手術(shù)治療、化療、靶向療法之后新的腫瘤治療手段之一，被Science雜志推舉為2013年度全球十大科學(xué)研究突破之首。近年來，以CTLA-4、PD-1通路為代表的免疫檢查點抑制劑及嵌合抗原受體T細胞免疫療法（CAR-T）的成功，更加印證了腫瘤免疫療法獨特的優(yōu)勢與廣闊的應(yīng)用前景。干擾素基因刺激因子（stimulator of interferon genes，STING）是DNA感受通路中的關(guān)鍵蛋白，對于固有免疫和適應(yīng)性免疫啟動具有重要作用［1］。STING作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)接頭蛋白能募集TANK結(jié)合激酶1（TANK binding kinase 1，TBK1）并激活干擾素調(diào)節(jié)因子3（interferon regulatory factor 3，IRF-3），進而誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素（IFN-α、IFN-β）的產(chǎn)生并調(diào)控抗腫瘤固有免疫應(yīng)答反應(yīng)［2］。作為一種治療方法，腫瘤內(nèi)注射STING激動劑已經(jīng)在多種小鼠腫瘤模型中顯示出顯著的治療效果［3-5］。

1 STING通路的生物學(xué)機制

1.1 STING蛋白的結(jié)構(gòu)與功能

STING蛋白是與固有免疫應(yīng)答密切相關(guān)的一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，在多種內(nèi)皮細胞、上皮細胞和造血干細胞中均有表達，主要定位于胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體及微粒體的外膜上［6］。人源STING（hSTING）蛋白由379個氨基酸組成，可分為3個結(jié)構(gòu)功能域，包括N端的4次跨膜結(jié)構(gòu)域（TM1～4）、二聚化結(jié)構(gòu)域和C端面向胞質(zhì)內(nèi)的結(jié)構(gòu)域。一般認為STING蛋白N端的4個TM使其能夠錨定于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，二聚化結(jié)構(gòu)域高度保守，可能與其活化功能有關(guān)，而球狀的C端結(jié)構(gòu)域含有多種信號基序，其C尾端結(jié)構(gòu)域?qū)TING有著自我抑制作用，是招募TBK1的關(guān)鍵基序［7-8］。hSTINGH232（又稱 hSTINGR232H，R232H表示組氨酸His替代原有的精氨酸Arg）與環(huán)二核苷酸 c［G（2′，5′）pA（3′，5′）p］結(jié)合誘導(dǎo)構(gòu)形變化。自由狀態(tài)下的STING二聚體結(jié)構(gòu)比較松散，呈“開放”狀態(tài)。當二聚體間的U型溝槽被2′，3′-cGAMP占據(jù)時，二聚體會形成一個緊密的“關(guān)閉”狀態(tài)（圖1-A），并由4個標準的β-折疊片覆蓋在結(jié)合溝槽上面，使得二聚體完全包裹結(jié)合的配體［9］。然而，也有研究發(fā)現(xiàn)當氨基苯并咪唑類化合物（di-ABZI）激活STING時，始終使STING保持在“開放”的狀態(tài)，如圖1-B所示［10］。這一發(fā)現(xiàn)提高了STING的激活無需封閉構(gòu)象的可能性?？傊€需要更多的研究以了解STING構(gòu)象如何調(diào)控信號通路的激活。

Figure 1 Crystal structure of cGAMP-STING（PDB ID:4 LOH）（A）and di-ABZI compound-STING（PDB ID:6 DXL）（B）

1.2 STING信號通路

由STING蛋白介導(dǎo)的cGAS-STING胞內(nèi)DNA感受通路參與機體的固有免疫應(yīng)答，在抗病毒感染、自身免疫疾病和腫瘤免疫治療中發(fā)揮著重要作用，其信號傳導(dǎo)機制如下:在識別胞質(zhì)內(nèi)的DNA后，環(huán)鳥苷酸-腺苷酸合成酶（cGAS）二聚化，催化GTP與ATP反應(yīng)生成環(huán)二核苷酸cGAMP。cGAMP作為第二信使結(jié)合并激活STING蛋白，使其形成二聚體。二聚化后的STING蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移至高爾基體再至核外周小體，招募細胞質(zhì)中的TANK結(jié)合激酶1（TBK1），繼而誘導(dǎo)干擾素調(diào)節(jié)因子 3（IRF3）磷酸化。然后，IRF3進入細胞核中引起干擾素β（IFN-β）和其他基因的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)（圖2）［11-14］。

1.3 STING通路在腫瘤免疫監(jiān)控中的作用

STING通路在腫瘤免疫監(jiān)控中具有重要作用。腫瘤細胞中存在持續(xù)的DNA損傷反應(yīng)，這導(dǎo)致其細胞溶質(zhì)中DNA的積累。Woo等［15］報道了宿主體內(nèi)STING通路識別腫瘤細胞的主要機制:腫瘤來源的DNA被宿主的抗原提呈細胞（antigen presenting cell，APC）監(jiān)測到并攝入其胞質(zhì)中，隨后激活STING通路，介導(dǎo)依賴STING的Ⅰ型IFN的產(chǎn)生。而多項實驗研究表明，腫瘤特異性CD8＋T細胞的激活及淋巴細胞的浸潤與由Ⅰ型IFN誘導(dǎo)的基因表達密切相關(guān)［16-18］。Ⅰ型IFN信號通路缺陷，如干擾素-α／β受體α鏈或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1（STAT1）缺陷，將會抑制 IFN的刺激效應(yīng)，導(dǎo)致針對腫瘤相關(guān)抗原的T細胞減少［19］。由此而知，STING通路能夠通過介導(dǎo)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生發(fā)揮抗腫瘤適應(yīng)性免疫效應(yīng)。

2 抗腫瘤STING激動劑

STING介導(dǎo)的天然免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是體內(nèi)生成Ⅰ型干擾素的重要途徑之一。采用一定策略激活宿主體內(nèi)腫瘤微環(huán)境中的STING，一方面可以產(chǎn)生Ⅰ型干擾素，促進交叉呈遞和抗腫瘤細胞毒T淋巴細胞反應(yīng)；另一方面活化后的STING誘導(dǎo)趨化因子產(chǎn)生，有助于招募效應(yīng)T細胞在腫瘤微環(huán)境中殺傷腫瘤細胞。此外，通過STING活化的免疫系統(tǒng)還可以提高對放療的敏感性［20］。這些基本原理有助于STING直接激動劑的研究。

2.1 環(huán)二核苷酸類激動劑

微生物產(chǎn)生的 c-di-GMP（1），c-di-AMP（2），3′，3′-cGAMP（3）及人體內(nèi)合成的 2′，3′-cGAMP（4）是STING的天然激動劑，結(jié)合STING后激活宿主的固有免疫應(yīng)答［21-22］。然而，天然的環(huán)二核苷酸激動劑在候選藥物特性方面存在明顯的不足，例如其相對分子質(zhì)量大于500，強極性使其難以透過細胞膜，且磷酸酯鍵易被水解，這些因素一定程度上限制了其臨床應(yīng)用［23］。

Figure 2 Model for cGAS-mediated cytosolic DNA sensing

Figure 3 Close-up of the2′，3′-cGAMP-STINGcomplex depicting key interactions

通過對 STING蛋白和2′，3′-cGAMP復(fù)合體晶體結(jié)構(gòu)及化合物2′，3′-cGAMP的結(jié)構(gòu)進行分析（圖3），結(jié)果顯示兩個嘌呤堿基是與STING蛋白結(jié)合的核心基團，其通過多個氫鍵和 π-π堆積與STING結(jié)合。因此，可以將磷酸核糖的環(huán)狀結(jié)構(gòu)作為這類化合物的分子骨架，兩個嘌呤堿基作為藥效團，這為設(shè)計新型的環(huán)二核苷酸類激動劑提供了理論依據(jù)。全消除，其中約50%的小鼠存活超過150 d，且免受腫瘤的二次攻擊［25］。2015年，F(xiàn)u等［26］設(shè)計出STINGVAX，一種結(jié)合合成類環(huán)二核苷酸的腫瘤疫苗。實驗觀察到當結(jié)合 ML-RR-S2 CDA時，STINGVAX與PD-1免疫檢查點抑制劑聯(lián)用可明顯提高抑瘤效果。目前，針對ML-RR-S2 CDA（也稱作MIW815或ADU-S100）的安全與有效性已開展人體臨床Ⅰ期試驗，用于治療晚期轉(zhuǎn)移性的實體腫瘤與淋巴瘤。

2014年，Li等［24］鑒別出一種外核苷酸磷酸二酯鍵水解酶，名為ENPP1。ENPP1能夠水解天然環(huán)二核苷酸2′，3′-cGAMP。研究人員在這個基礎(chǔ)上設(shè)計了一系列雙硫代抗水解的衍生物，命名為2′，3′-cGsAsMP。體外實驗顯示這種經(jīng)過修飾的激動劑結(jié)合 STING的能力與 2′，3′-cGAMP相當，但在人THP1細胞中誘導(dǎo)產(chǎn)生Ⅰ型干擾素的能力是后者的10倍。其中，代表化合物ML-RR-S2 CDA（5）擁有高穩(wěn)定性和高的抗腫瘤效應(yīng)，能夠激活所有的hSTING變體。在小鼠的B16黑色素瘤腫瘤模型中，瘤內(nèi)注射ML-RR-S2 CDA可顯著抑制腫瘤生長。實驗結(jié)果顯示，大多數(shù)受治療的小鼠腫瘤完

MK-1454是默沙東公司開發(fā)的一種STING激動劑，用于治療晚期轉(zhuǎn)移性實體瘤與淋巴瘤，目前也正處于Ⅰ期臨床試驗研究階段。有結(jié)果顯示MK-1454作為單一療法無應(yīng)答或部分應(yīng)答，在與Keytruda的聯(lián)合治療中產(chǎn)生部分應(yīng)答，相關(guān)的數(shù)據(jù)分析試驗仍在進行中［27］。目前該公司尚未公開MK-1454的結(jié)構(gòu)，涉及此類激動劑的化合物專利有3個。其中，代表化合物6和化合物7在體外THP-1細胞測定中顯示誘導(dǎo)分泌Ⅰ型IFN的能力明顯優(yōu)于2′，3′-cGAMP，化合物 8的 EC50達到了 1 nmol／L［28-29］。

葛蘭素史克（GSK）公司的研究人員對 2′，3′-cGAMP中核糖上的自由羥基進行取代修飾，引入F原子，得到化合物9。在對BALB／c小鼠乙肝表面抗原（HBsAg）模型的體內(nèi)研究中，化合物9與參考激動劑 cGAMP均可調(diào)節(jié)HBsAg的免疫應(yīng)答［30］。目前由該公司開發(fā)的STING激動劑GSK-532處于臨床前研究階段，雖然其結(jié)構(gòu)尚未公開，但根據(jù)該公司申請的關(guān)于此類激動劑僅有的一項化合物專利，推測其結(jié)構(gòu)由化合物9改造而來。體外配體實驗顯示GSK-532與hSTING結(jié)合的Kd為3.3μmol／L，體內(nèi)實驗中GSK-532對 CT26細胞移植瘤具有顯著抑制作用［31］。

此外，處于臨床前研究階段的CDN類激動劑藥物還包括 Spring Bank Pharmaceuticals公司的SB-11285和百時美施貴寶（BMS）與IFM Therapeutics公司聯(lián)合開發(fā)的BMS-986301，二者的結(jié)構(gòu)尚未公布。根據(jù)已有臨床前研究結(jié)果，SB-11285在人單核細胞白血病細胞系中誘導(dǎo)依賴于STING的IFN和 NF-κB表達的 EC50為2和200 nmol／L，分別是2′，3′-cGAMP的 1 000倍與 200倍［32］。瘤內(nèi)注射BMS-986301分別至CT-26和MC38小鼠腫瘤模型中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超過90%注射和非注射部位的腫瘤完全消退，而ADU-S100在相同的劑量下腫瘤消退率僅有13%。在CT-26模型中，BMS-986301與抗PD-1抗體的聯(lián)合治療引起80%注射與非注射部位腫瘤的完全消退，而單獨使用抗PD-1抗體治療時無效果［33］。

近期，幾家公司又相繼報道了一些新的CDN類STING激動劑化合物。Aduro公司與諾華公司報道了一類全新結(jié)構(gòu)的環(huán)二核苷酸化合物作為STING激動劑，這類激動劑的結(jié)構(gòu)特點是將化合物中核苷酸的2′位與4′位連接成閉環(huán)。其中代表化合物10在熒光測試中顯示對野生型，HAQ型（STING突變型，存在R71H，G230A和R293Q 3個單點突變）和REF型（STING突變型，存在R232H單點突變）的STING均有較高親和力。在熒光素酶報告基因檢測中，化合物10在THP-1細胞中對HAQ型STING存在激活作用，EC50為 9.5μmol／L［34］。

Boehringer Ingelheim公司的研究人員報道了一類環(huán)二核苷酸類似物作為hSTING激動劑，在熒光測試中代表化合物11顯示了對hSTING的高親和力。在IRF誘導(dǎo)的分泌型胚胎堿性磷酸酶報告基因檢測中，化合物11激活了人類急性單核細胞白血病THP-1 Blue ISG細胞的hSTING活性，其EC50為0.17μmol／L。對雄性 C57BL／6NRj小鼠靜脈注射給予 10μmol／kg化合物 11，在 0.25、0.5、0.75、1和 2 h時血藥濃度分別為 2 710、1 280、595、260和 111 nmol／L［35］。

Lioux等［36］設(shè)計了一系列新穎的環(huán)腺苷酸肌苷酸單磷酸類化合物，通過變化核糖上的取代基團，核苷酸間的連接位置和磷酸上的修飾篩選出了11個能激活STING信號通路的cAIMP類似物，并初步總結(jié)出這類化合物的構(gòu)效關(guān)系（圖4）。

Figure 4 General structure of the cAIMP analogs

（1）核苷酸間的連接方式影響化合物的穩(wěn)定性和產(chǎn)生Ⅰ型干擾素的活性。實驗觀測到2′，3′連接與3′，3′連接結(jié)合STING的能力相同，后者誘導(dǎo)產(chǎn)生Ⅰ型干擾素的活性更高。而cGAMP中2′，3′-cGAMP與 STING的結(jié)合力約為 3′，3′-cGAMP的300倍，這體現(xiàn)出cAIMP與cGAMP不同的構(gòu)效關(guān)系。（2）五碳糖上2′位雙脫氧取代能夠提高或降低對酶的穩(wěn)定性，取決于酶的特異性。2′位氟代導(dǎo)致產(chǎn)生Ⅰ型干擾素的活性明顯提高，其中雙氟代化合物的活性最強。（3）硫代磷酸酯修飾顯著提高了這類CDNs的體外穩(wěn)定性和活性，并在小鼠體內(nèi)腫瘤模型中表現(xiàn)出優(yōu)良的抗腫瘤免疫效能。與人源 STING激動劑 2′，3′-cGAMP相比，體外細胞試驗表明這類激動劑中某些化合物誘導(dǎo)產(chǎn)生IFNs和NF-κB的能力更強，較之2′，3′-cGAMP對內(nèi)切酶更加穩(wěn)定。體內(nèi)試驗顯示化合物 3′，3′-cAIMP的EC50為6.4μmol／L，其衍生物的 EC50為 0.4～4.7 μmol／L，較 2′，3′-cGAMP（EC50為 19.6μmol／L）顯示出更好的活性。

綜上所述，主要從3個方面來進行CDN類激動劑藥物設(shè)計的考慮:第一，通過部分或全部取代2′，3′-cGAMP中不穩(wěn)定的磷酸二酯鍵，增加化合物在人體內(nèi)的穩(wěn)定性，減少電荷對分子跨膜轉(zhuǎn)運的影響；第二，用其他一些基團取代核糖上的自由羥基，避免化學(xué)合成中羥基的保護與脫保護、選擇性差與難分離；第三，由于堿基是此類化合物與STING結(jié)合的重要作用位點，應(yīng)考慮原有堿基能否被其他堿基或類似物替代等。

2.2 非CDN類小分子激動劑

雖然當前STING激動劑的開發(fā)聚焦于模擬內(nèi)源性蛋白配體cGAMP上，但是對于新型結(jié)構(gòu)的非CDN類STING小分子激動劑的探索研究也逐漸成為研究熱點?；赟TING蛋白結(jié)合環(huán)二核苷酸類化合物的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)的報道，采用合理藥物設(shè)計，藥物化學(xué)家們已經(jīng)合成篩選出一些兼具體內(nèi)外功效的新的分子實體。

2.2.1 DMXAA 黃酮乙酸（FAA，化合物12）被證實通過破壞血管對小鼠結(jié)腸腫瘤有著顯著的抑制活性。然而，隨后的Ⅰ期臨床試驗的失敗以及大鼠腫瘤模型中顯示無活性，提示可能存在物種特異性［37］。為了獲得可使腫瘤發(fā)生出血性壞死的類似藥物，研究人員對FAA的分子結(jié)構(gòu)進行進一步修飾，合成了一系列化合物，其中5，6-二甲基呫噸酮-4-乙酸（DMXAA，化合物13）的效果最好。DMXAA在不同的小鼠模型中顯示抗腫瘤活性，同時也在大鼠的乳腺癌腫瘤模型中顯示抗腫瘤活性［38］。然而，對其聯(lián)合化療用于治療非小細胞肺癌的Ⅲ期臨床試驗宣告失敗。對小鼠和人STING的結(jié)構(gòu)-功能研究表明，DMXAA是鼠源 STING（mSTING）特異性激動劑，對人源STING并無激動效果，從而解釋了用于人體治療時的臨床活性差異［39］。

2.2.2 氨基苯并咪唑類化合物 2018年11月，GSK公司的研究人員在Nature雜志上報道了一類新型結(jié)構(gòu)的氨基苯并咪唑類激動劑（ABZIs）。研究人員運用高通量篩選方法得到一系列可以抑制3H-cGAMP與STING結(jié)合的小分子ABZIs類化合物。其中，代表化合物14在10μmol／L時的抑制率為（59±8）%，表觀抑制常數(shù) IC50約為（14±2）μmol／L。晶體結(jié)構(gòu)分析表明，STING蛋白C端結(jié)構(gòu)域（CTD）二聚體形成的口袋中結(jié)合了相鄰的兩個化合物14，每個小分子各自結(jié)合1個STING亞基?；衔?4的N-1位上基團-CH（OH）-Ph雖落在結(jié)合口袋中，卻與STING蛋白沒有相互作用，因此研究人員將N-1位羥甲苯基替換成linker從而將2個ABZI連接成一個新的二聚分子，形成化合物15，其結(jié)合能力提升了近千倍。如圖5所示，化合物15的1-乙基-3-甲基-1H-吡唑-5-甲酰胺部分結(jié)合在口袋的底部，吡唑氮部分與Ser162的羥基之間形成關(guān)鍵的氫鍵，羧酰胺部分與Thr263形成氫鍵，末端酰胺與Ser241形成2對H鍵網(wǎng)絡(luò)，維持復(fù)合物的構(gòu)象穩(wěn)定?；衔?6是在化合物15的基礎(chǔ)上進一步優(yōu)化而成，親和力及細胞內(nèi)效能進一步提高，EC50約為 130 nmol／L，是化合物 15的20多倍。小鼠實驗中觀察到化合物16激活了適應(yīng)性免疫，產(chǎn)生持久的抗腫瘤效應(yīng)并引起腫瘤消退［10］。

Figure 5 Close-up of diABZI compound 15 binding in the ligandbinding pocket of STING

2.2.3 苯并噻吩類化合物 默沙東公司的研究人員報道了一類苯并噻吩結(jié)構(gòu)型的STING激動劑，根據(jù)該公司公布的專利，體外測定顯示在THP-1細胞中代表化合物 17的 EC50達到 531 nmol／L［40］。在MC-38細胞移植瘤雌性C57BL／6J小鼠體內(nèi)實驗中，化合物18與抗PD-1單克隆抗體mIgG1（鼠源免疫球蛋白G亞型1）聯(lián)用時較單獨使用mIgG1顯著抑制腫瘤生長。該公司在專利中描述了將此類化合物與PD-1拮抗劑聯(lián)用的策略，用于晚期轉(zhuǎn)移性實體瘤和淋巴瘤患者治療，目前已進行了Ⅰ期臨床試驗研究，但其結(jié)果尚未公布［41］。

2.2.4 其他類化合物 此外，Sali等［42］利用高通量篩選鑒定出一種hSTING特異性激動劑G10（化合物19）。G10在人成纖維細胞中顯示出誘導(dǎo)針對甲病毒的抗病毒反應(yīng)，對基孔肯雅病毒（CHIKV）的抑制活性 IC90達到 8.01μmol／L，不過其體內(nèi)生物活性和藥理學(xué)性質(zhì)有待確定。Kimura等［43］報道一個新的化合物SINCRO（化合物20），并發(fā)現(xiàn)該化合物除了激活STING外，還可以通過不依賴于STING的細胞毒作用發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，目前不確定SINCRO是否直接與STING蛋白作用。Liu等［44］使用高通量篩選的方法從16 000多個化合物中篩選出一個二螺二哌嗪結(jié)構(gòu)的化合物（化合物21）。該化合物通過依賴于功能性人源STING的方式誘導(dǎo)細胞因子表達，對小鼠STING無激動效果。這一激動劑豐富了哌嗪類靶向STING在治療病毒感染或腫瘤方面的應(yīng)用。

3 總結(jié)及展望

與瓶頸，但是依然有可能成為免疫療法的又一個新興熱點。

STING蛋白是目前較為新穎的藥物靶點，在研藥物及專利申請數(shù)目比較有限。雖然目前尚未完全了解STING的確切作用機制，但越來越多的證據(jù)表明，STING激動劑有望應(yīng)用于腫瘤的免疫治療。盡管如此，STING激動劑的研究仍存在著許多問題，例如:在腫瘤細胞死亡后宿主的APC細胞如何獲得腫瘤來源的DNA尚不清楚；除了放射療法外，激活STING通路在其他腫瘤療法（如化療）中，與激酶抑制劑聯(lián)用中的功效作用仍有待確證。此外，關(guān)于STING通路的調(diào)控方面的研究還不夠深入，已知負反饋機制的表征將有助于建立更準確的策略來調(diào)節(jié)STING信號通路用于治療用途?？傊?，目前STING激動劑的研發(fā)雖然存在許多限制