垂盆草苷對幼齡肝內(nèi)膽汁淤積大鼠的作用機制

向華夏，康 權(quán)*

（1重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院肝膽外科，重慶400014；2重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院兒科研究所干細胞實驗室，兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室，國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學研究中心，兒童發(fā)育重大疾病國家國際科技合作基地，兒科學重慶市重點實驗室，重慶400014）

膽汁淤積是指膽汁形成、分泌和攝取中某一環(huán)節(jié)發(fā)生障礙導致膽汁流通不暢而引起的臨床癥狀［1］。臨床表現(xiàn)主要有黃疸、皮膚瘙癢、大便顏色變淺、尿色深等。按發(fā)生部位可分為肝內(nèi)膽汁淤積和肝外膽汁淤積，其中，肝內(nèi)膽汁淤積在肝臟疾病中十分普遍，可見于急性和慢性肝病、藥物性肝炎、妊娠性肝炎以及自身免疫性肝病等［2］。新生兒肝內(nèi)膽汁淤積癥［3］就是新生兒發(fā)病率較高的肝臟疾病，表現(xiàn)為結(jié)合性高膽紅素血癥伴黑尿，其發(fā)病率在1∶500到1∶5 000之間。據(jù)報道，垂盆草對于各種肝病都有一定的治療效果［4-5］，這給膽汁淤積的治療提供了一定的參考和啟示。

研究發(fā)現(xiàn)垂盆草粗提物對于膽汁淤積模型大鼠具有一定的治療效果［6］，其主要活性成分是垂盆草苷［7］（sarmentosin，SA），其主要的生物活性為保肝降酶作用。但是關(guān)于SA抗肝內(nèi)膽汁淤積的報道過少且不全面。因此，本研究基于SA抗肝內(nèi)膽汁淤積的作用研究，通過觀察SA對幼齡大鼠的膽汁流量及代謝酶的影響，膽汁酸轉(zhuǎn)運蛋白及合成蛋白的表達來評價SA的作用機制，為其臨床用藥提供可靠的實驗依據(jù)。

1 材 料

1.1 試 劑

羧甲基纖維素鈉（CMC-Na），垂盆草苷（SA，純度為97%，上海赫彭生物科技有限公司）；熊去氧膽酸（UDCA，成都普思生物有限公司）；α-萘異硫氰酸酯（ANIT，美國Sigma公司）；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）的活性和總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）、總膽汁酸（TBA）試劑盒（山東博科生物有限公司）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、γ-干擾素（INF-γ）、白細胞介素 1β（IL-1β）檢測試劑盒（南京建成生物有限公司）；DMEM培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清、RIPA細胞裂解液、蛋白質(zhì)上樣緩沖液、PBS緩沖液、TBST緩沖液；PVDF膜、電泳緩沖液、轉(zhuǎn)膜緩沖液、EPS300電泳液（北京索萊寶科技有限公司公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒、FXR（farnesoid X receptor）抗體、SHP-1（small heterodimer partner-1）抗體、SHP-2抗體、CYP7A1抗體、CYP27A1抗體、MRP2（multidrug resistance-associated protein-2）抗體、BSEP（bile salt export pump）抗體、NTCP（sodium taurocholate cotransporting polypeptide）抗體、β-actin抗體購自于（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

BK-200分立式全自動生化分析儀（山東博科生物有限公司）；AD200l-P高速分散勻漿機（上海平軒科學儀器有限公司）；Tecan Infinite F50酶標儀（瑞士Tecan公司）；Ti-S型倒置熒光顯微鏡（日本尼康公司）；TGL-20M型臺式高速冷凍離心機（廈門森態(tài)儀器儀表有限公司）；Tanon5200化學發(fā)光成像系統(tǒng)、VE180微型垂直電泳槽、VE186轉(zhuǎn)移電泳槽（上海天能科技有限公司）。

1.3 動 物

SPF級SD雄性大鼠（3周齡，100±20 g）由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證號:SYXK（渝）2017-0012。大鼠飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院動物中心清潔級動物房。之后相關(guān)動物實驗均在動物中心操作間進行。所有動物實驗均符合動物倫理委員會標準。

2 方 法

2.1 動物分組

48只幼齡雄性SD大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，使其充分熟悉環(huán)境，然后隨機分為6組，每組8只，具體為:正常組 （Control），模型組 （Model，ANIT 80 mg／kg），陽性對照組（UDCA，100 mg／kg），垂盆草苷低劑量組（SA-L，20 mg／kg）、中劑量組（SAM，40 mg／kg）和高劑量組（SA-H，80 mg／kg）。

2.2 大鼠膽汁淤積模型構(gòu)建

除正常組和模型組大鼠灌胃等量溶劑CMC-Na溶液外，其余各組大鼠均各自按照相應(yīng)的給藥劑量連續(xù)灌胃1周。在第5日除正常組外的其余各組大鼠均一次性灌胃80 mg／kg ANIT造模，正常組大鼠一次性灌胃等量溶劑橄欖油。在整個給藥周期中，觀察各組大鼠的一般狀況、皮毛變化、有無死亡情況等。造模后48 h開始收集實驗樣本并處理。

2.3 膽汁收集

用20%烏拉坦溶液麻醉大鼠，然后固定于大鼠固定板上，進行膽管膽汁引流手術(shù)。剪開大鼠腹腔，用注射針頭輕輕在膽總管上戳開一道小口，用PE-10插管插入膽總管后固定，有黃色膽汁流出即開始計時，用EP管收集0～45 min內(nèi)的膽汁流量（μL）。

2.4 血清生化指標檢測

對大鼠進行眼眶采血，常溫靜置1 h，5 000 r／min轉(zhuǎn)速下離心15 min，取上層血清放置于4℃溫度下保存，然后取血清采用全自動生化分析儀檢測大鼠血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）的活性和總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）、總膽汁酸（TBA）的活性水平。

2.5 肝組織病理學檢查

處死大鼠，取大鼠肝臟用多聚甲醛固定，經(jīng)乙醇常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅（HE）染色、封片、光學顯微鏡下觀察肝臟組織的病理學變化。

2.6 肝組織中 MDA、SOD、GSH-Px檢測

取一部分肝組織用生理鹽水制成10%的組織勻漿溶液，在4℃下10 000 r／min離心10 min，取上清液，按照丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒說明書測定肝臟相應(yīng)氧化應(yīng)激水平的含量。

2.7 血液中 TNF-α、IFN-γ、IL-1β檢測

取一部分血清依照腫瘤壞死因子（TNF-α）、γ干擾素（IFN-γ）和白介素1β（IL-1β）試劑盒說明書測定 TNF-α、IFN-γ和 IL-1β的表達。

2.8 Western blot法分析膽汁酸轉(zhuǎn)運蛋白和合成蛋白的表達

取大鼠肝組織約50 mg，用PBS溶液清洗3遍，然后剪碎，加入RIPA蛋白質(zhì)裂解緩沖液1 mL，冰上充分勻漿30 min，于4℃以10 000 r／min離心10 min，取上清液用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定其蛋白質(zhì)濃度。安置電泳裝置后，在10%SDSPAGE凝膠上電泳分離，調(diào)整蛋白上樣量為30μg，80 V電壓電泳至跑完濃縮膠，約30 min，然后將電壓調(diào)至120 V，跑完分離膠，約60 min，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜在5%BSA中封閉1 h，用TBST洗滌3次，每次5 min，然后將PVDF膜放入相應(yīng)的FXR、SHP-1、SHP-2、CYP7A1、CYP27A1、MREP2、BSEP、NTCP、β-actin一抗中，在 4℃下孵育過夜，第2天將一抗封閉后的PVDF膜用TBST洗滌3次，每次5 min。然后將PVDF膜加入相應(yīng)的二抗孵育1 h，然后用PBST洗滌3次，每次10 min。用ECL顯色液顯色。以β-actin為參比蛋白對FXR、SHP-1、SHP-2、CYP7A1、CYP27A1、MREP2、BSEP、NTCP進行分析。

2.9 統(tǒng)計學分析

應(yīng)用軟件SPSS 19.0、Image J對結(jié)果進行數(shù)據(jù)處理，各組數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用多因素方差分析（One Way ANOVA，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.01是顯著性差異。

3 結(jié) 果

3.1 垂盆草苷對膽汁流量的影響

膽汁流量是考察ANIT誘導的大鼠肝損傷模型是否造模成功的最直觀指標。結(jié)果如表1所示，與正常組相比，模型組大鼠膽汁流量被明顯抑制（P＜0.01），說明造模成功。與模型組相比，UDCA組大鼠的膽汁流量顯著增加（P＜0.01），垂盆草苷低劑量組無統(tǒng)計學意義，垂盆草苷中劑量組膽汁流量有一定的增加（P＜0.05，P＜0.01），垂盆草苷高劑量組膽汁流量顯著增加（P＜0.01），且膽汁流量的恢復呈劑量依賴性。

3.2 垂盆草苷對血清生化指標的影響

如表2所示，模型組大鼠血清中 ALT、AST、ALP、TBIL、DBIL和TBA含量水平較正常組均顯著升高（P＜0.01），說明ANIT造模成功；與模型組相比，UDCA組大鼠血清中 ALT、AST、ALP、TBIL、DBIL和TBA水平顯著下降（P＜0.01）；垂盆草苷低劑量組大鼠血清中的ALT、TBIL和DBIL水平降低（P＜0.05）；垂盆草苷中、高劑量組大鼠血清中的 ALT、AST、ALP、TBIL、DBIL和 TBA水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。垂盆草苷對于生化指標的影響呈劑量依賴性，其中，垂盆草苷高劑量組降低血清中的AST與AST水平優(yōu)于陽性對照組，降低ALP、TBIL、DBIL和TBA水平與UDCA相近，說明垂盆草苷高劑量組與UDCA組作用相當。

Table 1 Effect of sarmentosin（SA）on bile flow rate within 45 min in rats（±s，n＝8）

Table 1 Effect of sarmentosin（SA）on bile flow rate within 45 min in rats（±s，n＝8）

UDCA:Ursodeoxycholic acid**P＜0.01 vs control group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs model group

Group Dose／（mg／kg） Bile flow rate／［μL／（min·100 g ）］0 15 15 30 30 45 min Control - 10.43±2.53 11.14±2.31 8.79±1.55 Model 80 2.64±0.87** 2.95±0.65** 2.20±0.41**UDCA 100 8.49±1.10＃＃ 9.24±1.24＃＃ 7.23±0.66＃＃SA 20 3.38±0.46 4.27±0.92 2.76±0.69 40 5.52±1.65＃ 7.91±0.68＃＃ 4.23±0.82＃＃80 7.24±1.07＃＃ 9.02±0.72＃＃ 7.04±1.04＃＃

Table 2 Effect of SA on alanine aminotransferase（ALT），aspartate aminotransferase（AST），alkaline phosphatase（ALP），total bilirubin（TBIL），direct bilirubin（DBIL）and total bile acid（TBA）in serum of rats（±s，n＝8）

Table 2 Effect of SA on alanine aminotransferase（ALT），aspartate aminotransferase（AST），alkaline phosphatase（ALP），total bilirubin（TBIL），direct bilirubin（DBIL）and total bile acid（TBA）in serum of rats（±s，n＝8）

**P＜0.01 vs control group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs model group

Group Dose／（mg／kg）ALT／（U／L）AST／（U／L）ALP／（U／L）TBIL／（μmol／L）DBIL／（μmol／L）TBA／（μmol／L）Control - 36.28±3.62 134.81±25.77 54.34±15.45 6.63±3.38 3.06±1.14 47.93±8.17 Model 80 161.75±27.96**305.79±38.39**143.88±25.88**44.25±8.31**25.94±4.88**145.85±19.34**UDCA 100 48.65±10.82＃＃ 142.48±29.68＃＃ 59.7±10.91＃＃ 8.13±2.42＃＃ 5.68±1.54＃＃ 57.96±7.82＃＃SA 20 136.95±24.36＃ 277.63±32.26 131.49±14.95 36.75±5.99＃ 20.5±3.89＃ 131.34±15.76 40 90.1±10.26＃＃ 205.09±29.53＃＃ 85.91±11.75＃＃ 18.25±3.49＃＃ 14.01±2.57＃＃ 102.15±8.48＃＃80 46.01±8.59＃＃ 135.85±35.50＃＃ 62.9±9.91＃＃ 8.5±1.60＃＃ 6.73±1.17＃＃ 67.03±17.94＃＃

3.3 垂盆草苷對肝臟組織病理學的影響

如圖1所示，正常組大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)形態(tài)正常，細胞排列整齊緊密，未出現(xiàn)變性壞死的狀態(tài)（圖1-A）；模型組大鼠肝臟組織受損嚴重，遭到嚴重破壞，中央靜脈充血嚴重，出現(xiàn)明顯的炎癥浸潤現(xiàn)象，說明造模成功（圖1-B）；與模型組相比，UDCA組大鼠肝細胞壞死明顯減少，肝細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)較為完整，中性粒細胞浸潤明顯減少，未出現(xiàn)明顯的炎癥浸潤現(xiàn)象（圖1-C）；垂盆草苷低劑量組大鼠肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)好轉(zhuǎn)，但是中央靜脈區(qū)周圍肝細胞壞死，中央靜脈未出現(xiàn)嚴重的充血現(xiàn)象，同時有少量的炎癥浸潤現(xiàn)象（圖1-D）；垂盆草苷中劑量組大鼠肝組織可見大部分肝細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，中央靜脈區(qū)出現(xiàn)少量充血現(xiàn)象和炎癥浸潤現(xiàn)象（圖1-E）；垂盆草苷高劑量組與UDCA組類似，肝組織中細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)保持完整，中央靜脈區(qū)周圍界限模糊，比模型組明顯的好轉(zhuǎn)（圖1-F）。組織病理學結(jié)果表明，垂盆草苷對模型組肝臟組織損傷具有一定程度的改善作用，其中高劑量組大鼠肝組織病理改善明顯。

3.4 垂盆草苷對MDA、SOD、GSH-Px的影響

如表3所示，與正常組相比，模型組大鼠肝組織勻漿中脂質(zhì)代謝產(chǎn)物MDA含量明顯升高（P＜0.01），抗氧化酶 SOD和 GSH-Px含量顯著降低（P＜0.01），說明模型組大鼠出現(xiàn)明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)。與模型組相比，UDCA組大鼠肝組織勻漿中MDA含量有明顯降低（P＜0.01），而抗氧化酶SOD和GSH-Px含量顯著升高（P＜0.01）；垂盆草苷低劑量組大鼠肝組織勻漿中MDA含量下降同時，GSH-Px含量升高（P＜0.05）；而垂盆草苷中、高劑量組大鼠肝組織勻漿中MDA含量明顯下降（P＜0.01），而抗氧化酶SOD和GSH-Px含量明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果表明，垂盆草苷高劑量組降低組織中MDA的效果與UDCA組相似，同時提升組織中抗氧化酶SOD與GSH-Px的活性與UDCA組的效果類似。

Figure 1 Effect of SA on hepatic histopathology inα-naphthylisothiocyanate（ANIT）-induced cholestasis rats（HE，×200）A:Control；B:Model；C:UDCA；D:SA（20 mg／kg）；E:SA（40 mg／kg）；F:SA（80 mg／kg）

Table 3 Effect of SA on malondialdehyde（MDA），superoxide dismutase（SOD）and glutathione peroxidase（GSH-Px）in rats tissue homogenate（±s，n＝8）

Table 3 Effect of SA on malondialdehyde（MDA），superoxide dismutase（SOD）and glutathione peroxidase（GSH-Px）in rats tissue homogenate（±s，n＝8）

**P＜0.01 vs control group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs model group

Group Dose／（mg／kg） MDA／（nmol／mg） SOD／（U／mg） GSH-Px／（mg／g ）Control - 0.98±0.09 122.85±14.10 9.60±1.46 Model 80 2.83±0.58** 80.69±7.91** 2.43±0.82**UDCA 100 1.13±0.21＃＃ 118.82±9.38＃＃ 8.87±1.43＃＃SA 20 2.26±0.43＃ 85.09±6.45 4.54±0.86＃40 1.69±0.28＃＃ 99.02±10.94＃ 6.69±1.71＃＃80 1.19±0.24＃＃ 115.39±10.87＃＃ 8.79±1.83＃＃

3.5 垂盆草苷對 TNF-α、IFN-γ、IL-1β的影響

如表4所示，與正常組相比，模型組大鼠血清中 TNF-α、IFN-γ、IL-1β的表達明顯升高（P＜0.01），說明模型組大鼠出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)，與模型組相比，UDCA組大鼠血清中 TNF-α、IFN-γ、IL-1β的表達明顯降低（P＜0.01），垂盆草苷低劑量組大鼠血清中TNF-α與IL-1β表達降低（P＜0.05），；而垂盆草苷中、高劑量組大鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-1β的表達明顯降低（P＜0.01）。結(jié)果表明，垂盆草苷高劑量組下調(diào)炎癥因子TNF-α、IFN-γ的表達效果與UDCA組相似，說明垂盆草苷可以降低炎癥因子的表達。

Table4 Effect of SA on serum levels of tumor necrosis factor-alpha（TNF-α），interferon-gamma（IFN-γ）and interleukin-1β（IL-1β）in rats（±s，n＝8）

Table4 Effect of SA on serum levels of tumor necrosis factor-alpha（TNF-α），interferon-gamma（IFN-γ）and interleukin-1β（IL-1β）in rats（±s，n＝8）

**P＜0.01 vs control group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs model group

Group Dose／（mg／kg） TNF-α／（pg／mL） IFN-γ／（pg／mL） IL-1β／（pg／mL）Control - 60.69±5.25 25.05±4.50 41.51±6.29 Model 80 208.95±8.85** 116.14±10.72** 195.28±15.16**UDCA 100 90.34±5.41＃＃ 38.34±10.09＃＃ 85.74±9.01＃＃SA 20 198.34±10.71＃ 111.93±8.58 178.19±9.23＃40 135.09±10.54＃＃ 64.33±8.05＃＃ 142.31±8.51＃＃80 94.74±4.66＃＃ 36.59±5.61＃＃ 102.56±12.23＃＃

3.6 垂盆草苷對膽汁酸轉(zhuǎn)運蛋白和合成蛋白的影響

模型組 FXR、SHP-1、SHP-2、BSEP、MREP2、NTCP蛋白表達水平較正常組顯著下降（P＜0.01），CYP7A1、CYP27A1蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，垂盆草苷低劑量組SHP-1、BSEP、MREP2、NTCP蛋白表達水平升高（P＜0.05），垂盆草苷中劑量組 FXR、SHP-1、SHP-2、BSEP、MREP2、NTCP蛋白表達水平升高（P＜0.05，P＜0.01），CYP7A1蛋白表達水平降低（P＜0.05）；垂盆草苷高劑量組 FXR、SHP-1、SHP-2、MREP2、BSEP、NTCP蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01），CYP7A1、CYP27A1蛋白表達水平顯著下降（P＜0.01），且蛋白表達呈劑量依賴性（如圖2所示）。實驗結(jié)果表明，垂盆草苷是通過調(diào)控相關(guān)蛋白來發(fā)揮治療作用的。

Figure 2 Effect of SA on bile acid transporters and synthetic protein（xˉ±s，n＝3）**P＜0.01 vs control group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs model group

4 討 論

肝內(nèi)膽汁淤積患者主要臨床癥狀為黃疸、尿色深、皮膚瘙癢等［8］，其發(fā)病機制為肝細胞中膽汁轉(zhuǎn)運體異常、膽汁調(diào)節(jié)機制失控［9-10］等。新生兒肝內(nèi)膽汁淤積癥在新生兒中發(fā)病率較高，而ANIT是常用的誘導肝內(nèi)膽汁淤積的模型藥物，能夠很好地模擬人體肝內(nèi)膽汁淤積疾病的特點［11］，因此本研究選用ANIT誘導的幼齡肝內(nèi)膽汁淤積大鼠模型探討垂盆草苷的保肝機制。

研究表明，ANIT給藥造模后，能觀察到大鼠膽汁流量減少［12-14］，血清中 AST、ALT、ALP等水平升高，出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)，在炎癥反應(yīng)中淋巴細胞被激活進入肝臟，從而產(chǎn)生氧化應(yīng)激現(xiàn)象［15］，同時，ANIT給藥造模后，SOD、GSH-Px抗氧化酶顯著下降［16］。本研究結(jié)果與文獻報道一致，ANIT誘導的模型組大鼠膽汁流量明顯降低，血清中ALT、AST、ALP、TBIL、DBIL、TBA水平顯著升高，炎癥因子 TNF-α、IFN-γ、IL-1β的表達升高，肝組織勻漿中MDA含量增加，而抗氧化酶SOD、GSH-Px含量下降，這些都說明ANIT誘導的膽汁淤積癥狀有明顯的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激現(xiàn)象。

研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XR核受體是維持膽汁酸肝腸循環(huán)和穩(wěn)態(tài)平衡的重要核受體，在膽汁淤積過程中發(fā)揮重要作用，可以誘導多種基因的表達，參與調(diào)控膽汁酸的新陳代謝，維護體內(nèi)膽汁酸動態(tài)平衡［17-18］。首先是膽汁酸合成，膽汁酸合成有兩個途徑，中性合成途徑是其主要途徑，CYP7A1是該途徑的關(guān)鍵酶，會通過一系列酶促反應(yīng)生產(chǎn)膽汁酸，而激活 FXR會激活 SHP受體，從而抑制CYP7A1的表達，達到抑制膽汁酸合成［19］的目的；另外一個途徑被稱為替代途徑，這個途徑會產(chǎn)生酸性膽固醇，若膽固醇進入線粒體內(nèi)會導致膽汁酸合成受到限制，CYP27A1是一種多功能的細胞色素羥化酶，能夠催生替代途徑的第一步，因此，抑制CYP27A1的表達也會抑制膽汁酸的合成；同時，激活FXR-SHP軸［20］，可以抑制?；撬岬暮铣?，而?；撬嵩谀懼岽x中起著重要的中間作用。另外是膽汁酸轉(zhuǎn)運，F(xiàn)XR可激活膽汁酸外排轉(zhuǎn)運蛋白有膽鹽輸出泵（BSEP），其激動劑能上調(diào)MRP2的表達；同時，激活FXR誘導SHP上調(diào)，可調(diào)節(jié)鈉離子?；撬峁厕D(zhuǎn)運多肽（NTCP）對膽汁酸的攝取作用［21］。因此，探討膽汁酸合成和轉(zhuǎn)運的分子機制是研究膽汁淤積發(fā)生發(fā)展機制的熱點。在本研究結(jié)果中，模型組大鼠肝臟組織中的 FXR、SHP-1、SHP-2、MREP2、BSEP、NTCP蛋 白 表 達 降 低，CYP7A1、CYP27A1蛋白表達升高，這說明ANIT會誘導膽汁酸的合成增加以及降低膽汁酸的轉(zhuǎn)運，這樣會導致嚴重的膽汁淤積現(xiàn)象。

FXR核受體是調(diào)節(jié)膽汁酸合成、轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵受體，這是臨床研究膽汁淤積發(fā)病機制和臨床治療膽汁淤積的重要參考和方向［22］。但是，目前由于治療肝內(nèi)膽汁淤積的藥物十分缺乏，通過現(xiàn)代藥理學研究分析肝內(nèi)膽汁淤積病理機制，建立類似的動物模型，是目前去尋找發(fā)現(xiàn)治療藥物的常用方法［23］。因此，本研究利用ANIT誘導的幼齡SD大鼠的肝內(nèi)膽汁淤積模型，以探討垂盆草苷（SA）ANIT誘導的肝內(nèi)膽汁淤積大鼠模型的干預和調(diào)節(jié)作用。研究結(jié)果表明，垂盆草苷可顯著增加幼齡SD大鼠膽汁流量；降低血清中 ALT、AST、ALP、TBIL、DBIL、TBA水平；降低炎癥因子 TNF-α、IFN-γ、IL-1β的表達；顯著降低肝臟組織中脂質(zhì)代謝產(chǎn)物MDA的含量，顯著升高抗氧化酶SOD、GSH-Px的含量；改善肝臟組織病理狀態(tài)，垂盆草苷高劑量組的作用效果與UDCA組類似。同時，通過Western blot法分析膽汁酸轉(zhuǎn)運蛋白與合成蛋白發(fā)現(xiàn)，垂盆草苷可上調(diào) FXR、SHP-1、SHP-2、MREP2、BSEP、NTCP蛋白表達，下調(diào) CYP7A1、CYP27A1蛋白表達。因此，本研究結(jié)果表明，垂盆草苷可顯著改善幼齡SD大鼠膽汁淤積造成的肝臟損傷，對肝內(nèi)膽汁淤積造成的幼齡SD大鼠肝功能損傷具有干預和調(diào)節(jié)作用，其作用機制可能與參與膽汁酸的轉(zhuǎn)運與合成有關(guān)。