2000—2019年廣西狂犬病病毒流行株的基因組遺傳穩(wěn)定性分析

覃晴 梁星雪 曹晗 韋顯凱 梁晶晶 李曉寧 羅廷榮

摘要：【目的】揭示廣西狂犬病病毒（RABV）的流行變異規(guī)律及進化特征，為廣西狂犬病防控提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā繉?018年從患狂犬病家犬腦組織分離獲得的2株RABV野毒株（GXYZ2018和GXSL2018）進行全基因組擴增與測序，測序結(jié)果采用SeqMan進行拼接以獲得全基因組序列，并與近20年來的RABV廣西流行株進行系統(tǒng)地遺傳變異分析?！窘Y(jié)果】GXSL2018株和GXYZ2018株的全基因組序列長度均為11923 bp，不同RABV廣西流行株間的核苷酸序列同源性在87.1%～99.4%，而2株毒株間的同源性為99.1%;與其他RABV廣西流行株相比，GXSL2018株和GXYZ2018株的3'-UTR為69 bp，且在第20位缺失一個核苷酸?；贜基因和G基因核苷酸序列同源性構(gòu)建的遺傳進化樹均顯示GXSL2018株和GXYZ2018株同屬于Group II型毒株，且2株毒株N蛋白上的B細胞表面抗原表位（第358～367位氨基酸殘基）、Th細胞表位（第404～418位氨基酸殘基）和RNA結(jié)合域（第298～352位氨基酸殘基），以及G蛋白上與病毒毒力密切關(guān)聯(lián)的第333、336、339和357位氨基酸殘基及中和抗體相關(guān)表位和受體結(jié)合位點均高度保守。【結(jié)論】GXYZ2018株和GXSL2018株同屬于Group II型毒株，與近20年來的RABV廣西流行株高度相似，病毒蛋白主要功能區(qū)的氨基酸序列高度保守，尚未發(fā)生變異，全基因組遺傳特性穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞： 狂犬病病毒（RABV）;基因組;遺傳穩(wěn)定性;Group II型毒株

0 引言

【研究意義】狂犬病是由狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）引起的一種人畜共患傳染病，具有高致死率。RABV主要侵害動物和人類的神經(jīng)系統(tǒng)，通常是經(jīng)受感染的動物咬傷傳播（陳芳芳，2013;徐素萍等，2018）。廣西是我國狂犬病主要疫區(qū)之一，每年因狂犬病死亡的人數(shù)居全國首位，且主要發(fā)生在鄉(xiāng)村地區(qū)。雖然經(jīng)過近年來的病原監(jiān)測及家犬免疫接種，狂犬病疫情得到明顯控制，但其引起的公共衛(wèi)生問題仍不容小覷?！厩叭搜芯窟M展】RABV是一種高度噬神經(jīng)性的單股負鏈RNA病毒，隸屬于彈狀病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒屬（Lyssavirus）（周松峰等，2011;譚業(yè)平等，2018），其病毒蛋白包括核蛋白（N）、非酶促聚合酶輔因子磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、糖蛋白（G）和病毒RNA聚合酶蛋白（L）（Liu et al.，2017）。由RNA、N蛋白、P蛋白及L蛋白共同組成的核糖核蛋白復(fù)合體（Ribonucleoprotein，RNP）是RABV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的核心組分（Jackson，2011）。P蛋白對機體免疫系統(tǒng)具有拮抗作用，Vidy等（2007）研究發(fā)現(xiàn)P蛋白能拮抗Ⅰ型干擾素的轉(zhuǎn)錄，通過阻斷信號分子STAT1與干擾素基因啟動子結(jié)合的方式發(fā)揮作用。L蛋白是一種多功能酶，既具備RNA依賴的RNA聚合酶活性（RNA dependent RNA polymerase，RDRP），又具有mRNA加帽酶作用，已有研究發(fā)現(xiàn)突變L蛋白攜帶的關(guān)鍵甲基化位點，能顯著降低RABV對小鼠的致病性（Tian et al.，2015;王朝等，2017）。在RABV復(fù)制過程中，M蛋白可通過招募RNP使其固定于細胞膜，而有利于病毒出芽（彭嬌嬌等，2016）。G蛋白是RABV與宿主細胞結(jié)合的配體，對病毒毒力及致病性起關(guān)鍵作用（楊健等，2012），已有研究證實將Flury株G蛋白的第333位氨基酸殘基突變?yōu)榫彼幔ˋrg）后，RABV可致死成年小鼠，即弱毒致病性發(fā)生改變（Tao et al.，2010;Zhang et al.，2013）。Yamada等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)RABV流行株的G蛋白存在第37位和第319位2個糖基化位點，當G蛋白發(fā)生糖基化時也會影響病毒毒力。家犬在傳播RABV的過程中起重要作用，廣西農(nóng)村散養(yǎng)家犬數(shù)量龐大，接種疫苗率低是狂犬病高發(fā)的主要原因。1999—2001年廣西的臨床健康犬RABV陽性率為1.10%（羅廷榮等，2007），2002—2005年的RABV陽性率為3.25%～4.39%，2006—2011年的RABV陽性率為3.72%～1.26%，2011—2012年的RABV陽性率為0.20%，2013—2018年的RABV陽性率為0。隨著家犬免疫接種率的提高，廣西狂犬病致死亡人數(shù)呈逐年下降趨勢，由2004年的602人降至2016年的57人，說明人類的狂犬病發(fā)病率與家犬帶毒率呈正相關(guān)（羅廷榮等，2017）。免疫接種是降低臨床健康犬帶毒的重要手段，但免疫抗體同時給RABV生存帶來壓力，誘發(fā)其產(chǎn)生變異，因此監(jiān)測病毒遺傳穩(wěn)定性及分析其變異規(guī)律，對有效防控狂犬病具有重要意義。【本研究切入點】已有相關(guān)研究對不同時期廣西RABV的遺傳特性進行分析，并證實RABV廣西流行株絕大部分屬于Group I和Group II型毒株，Group III型毒株較少（Tang et al.，2013;Wei et al.，2018），但鮮見針對廣西近20年來的RABV流行株進行綜合評估分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對本課題組2018年從患狂犬病家犬腦組織分離獲得的2株RABV野毒株進行全基因組測序，并與近20年來的RABV廣西流行株進行遺傳變異分析，旨在揭示廣西RABV的流行變異規(guī)律及進化特征，為廣西狂犬病防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

2018年從患狂犬病家犬腦組織分離獲得2株RABV野毒株（GXSL2018和GXYZ2018），其中，GXSL2018株分離自廣西南寧市上林縣咬人的患狂犬病家犬腦組織，GXYZ2018株分離自廣西河池市宜州區(qū)咬牛的患狂犬病家犬腦組織。組織RNA提取試劑盒、pMD18-T載體、PrimeSTAR Max和M-MLV Reverse Transcriptase購自TaKaRa公司;DNA膠回收試劑盒、2×Taq PCR MasterMix、dNTPs和DNA Marker購自天根生化科技（北京）有限公司;胰蛋白胨和酵母提取物購自O(shè)xid公司;LA固體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基和大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞由亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室自配或保存提供。

1. 2 引物設(shè)計與合成

參照RABV廣西毒株GX074全基因組序列（GenBank登錄號MG201923.1），采用Primer 5.0進行RABV全基因組合成引物（表1）設(shè)計，并委托深圳華大基因股份有限公司合成。

1. 3 RT-PCR擴增

參照組織RNA提取試劑盒說明提取GXSL2018和GXYZ2018株的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。RT反應(yīng)體系25.0 μL：5×Buffer 5.0 μL，dNTPs 2.0 μL，RNasin 0.5 μL，M-MLV Reverse Transcriptase 0.5 μL，上游引物1.0 μL，RNA模板16.0 μL。反轉(zhuǎn)錄程序：42 ℃ 1 h，90 ℃ 5 min。以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進行PCR擴增，反應(yīng)體系26.0 μL：PrimeSTAR Max 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，cDNA模板3.0 μL，ddH2O 8.5 μL。擴增程序：98 ℃預(yù)變性3 min;98 ℃ 10 s，退火溫度（表1）退火15 s，延伸溫度72 ℃（延伸速率1 kb/min），據(jù)此計算延伸時間，進行35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，對目的條帶進行DNA膠回收純化。

1. 4 全基因組序列比對分析

將目的片段與pMD18-T載體在4 ℃下連接過夜，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞。挑取疑似陽性單克隆菌落進行擴大培養(yǎng)，經(jīng)菌液PCR鑒定呈陽性的菌液送至深圳華大基因股份有限公司測序。測序結(jié)果采用SeqMan完成序列拼接，并與近20年來的RABV廣西流行株（表2）全基因組序列進行比對分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 RABV全基因組序列比對分析結(jié)果

利用12對引物分別對GXSL2018和GXYZ2018株進行全基因組分段擴增，獲得相應(yīng)目的片段后采用SeqMan進行序列拼接，結(jié)果得到2株RABV野毒株的全基因組序列，其基因組全長均為11923 bp，GenBank登錄號分別為MN186249和MN186250。

從NCBI下載2000—2019年RABV廣西流行株的全基因組序列，運用MegAlign進行同源性比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同RABV廣西流行株間的核苷酸序列同源性在87.1%～99.1%，其中GXSL2018株和GXYZ2018株的同源性為99.4%（圖1）。9株RABV廣西流行株的基因組序列全長為11921～11924 bp（表3），其主要區(qū)別在于P-M間隔區(qū)和5'-UTR，P-M間隔區(qū)多為87 bp（6株），只有3株毒株為86 bp，5'-UTR多為130或131 bp，但LB19株的5'-UTR為129 bp。2018年分離獲得的GXSL2018株和GXYZ2018株全基因組序列均為11923 bp，與其他RABV廣西流行株相比，其主要差異是這2株毒株的3'-UTR為69 bp，且在第20位缺失一個核苷酸（圖2）。綜上所述，近20年來廣西的RABV流行株非常保守，其遺傳特性穩(wěn)定。

2. 2 RABV的N基因序列比對分析結(jié)果

從NCBI下載近20年來的RABV廣西流行株及國內(nèi)其他省份具有代表性毒株的N基因序列，進行遺傳進化樹分析。結(jié)果表明，2018年分離獲得的GXSL2018株和GXYZ2018株同屬于Group II型毒株（圖3）。此外，在Group II內(nèi)，所有RABV廣西流行株聚類在同一個分支（紅色實線圈出的毒株）;在GroupⅠ內(nèi)，所有RABV廣西流行株也聚類在同一分支上。GXYZ2018株和GXSL2018株雖然分離自廣西的不同地區(qū)，兩地相距500 km，但2株毒株的N基因核苷酸序列同源性高達99.6%。與其他省份的RABV流行株相比，RABV廣西流行株N蛋白上的RNA結(jié)合域（第298～352位氨基酸殘基）、B細胞表面抗原表位（第358～367位氨基酸殘基）和抗原位點（第359～366位氨基酸殘基和第375～383位氨基酸殘基）及Th細胞表位（第404～418位氨基酸殘基）均高度保守，因此在遺傳進化樹上RABV廣西流行毒株緊密聚在一起。

2. 3 RABV的G基因序列比對分析結(jié)果

基于G基因序列的遺傳進化分析結(jié)果也表明，GXSL2018株和GXYZ2018株同屬于Group II型毒株（圖4）。從遺傳進化樹可直觀看出，近年來RABV廣西流行株主要為Group I型和Group II型毒株，且同一組別內(nèi)的RABV廣西流行株均聚類在同一分支上。成熟的G蛋白從結(jié)構(gòu)上可分為3個部分：膜外區(qū)（第1～439位氨基酸殘基），該區(qū)攜帶有RABV的主要抗原決定簇位點，具有強大的免疫原性和抗原性，在受體識別和膜融合過程中發(fā)揮重要作用;跨膜區(qū)（第440～461位氨基酸殘基），該區(qū)參與G蛋白在病毒脂質(zhì)雙分子層膜上的固定;膜內(nèi)區(qū)（第462～505位氨基酸殘基），該區(qū)位于病毒膜內(nèi)，與M蛋白和N蛋白相互作用有關(guān)（汪孟航等，2016）。通過氨基酸序列比對分析發(fā)現(xiàn)，RABV廣西流行株在以上重要抗原位點均高度保守，發(fā)生突變的氨基酸位點是否與病毒毒力及抗原性相關(guān)，目前尚未得到驗證。

3 討論

病毒變異是病毒病防控的主要難題。本課題組2018年從患狂犬病家犬腦組織中分離獲得2株RABV野毒株（GXSL2018和GXYZ2018），在全基因組測序的基礎(chǔ)上，與近20年來的RABV廣西流行株進行系統(tǒng)地遺傳變異分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GXSL2018株和GXYZ2018株的基因組全長均為11923 bp，且2株毒株的開放閱讀框（ORF）長度與之前分離獲得的RABV野毒株及固定毒株一致，僅少數(shù)堿基缺失或插入出現(xiàn)在間隔區(qū)。何曉霞（2013）研究發(fā)現(xiàn)，RABV的3'-UTR較保守，通常為70 bp;但本研究發(fā)現(xiàn)GXSL2018株和GXYZ2018株的3'-UTR在第20位點缺失一個核苷酸。病毒的3'-UTR和5'-UTR通常被認為與病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制有關(guān)，水皰性口炎病毒（VSV）3'-UTR前24個核苷酸缺失會極大降低其轉(zhuǎn)錄復(fù)制水平（Li and Pattnaik，1999），故推測GXSL2018株和GXYZ2018株的3'-UTR缺失一個核苷酸也會影響其轉(zhuǎn)錄復(fù)制水平。

開展RABV不同功能基因的遺傳進化分析有利于判斷其流行趨勢。N基因高度保守和高效表達的特性，被視為RABV基因分型的重要判斷指標（路靜等，2015）。RABV廣西流行株主要屬于Group I和Group II型毒株（熊毅等，2008），本課題組2018年分離獲得的GXYZ2018株和GXSL2018株同屬于Group II型毒株，其N蛋白上的B細胞表面抗原表位（第358～367位氨基酸殘基）、Th細胞表位（第404～418位氨基酸殘基）和RNA結(jié)合域（第298～352位氨基酸殘基）均高度保守，與Kouznetzoff等（1998）、Faber等（2002）分離報道的毒株高度一致，而其他發(fā)生變異的少數(shù)氨基酸殘基，與N蛋白功能位點無關(guān)。G蛋白負責(zé)誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體，也是決定RABV致病性的重要蛋白，位于病毒膜表面，與細胞受體結(jié)合（Faber et al.，2002）。本研究對近20年來的RABV廣西流行株進行比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)G蛋白上與病毒毒力密切關(guān)聯(lián)的第333、336、339和357位氨基酸殘基及中和抗體相關(guān)表位和受體結(jié)合位點的氨基酸殘基均未發(fā)生變異，高度保守。此外，P蛋白和M蛋白功能位點的氨基酸殘基也非常保守，均未發(fā)生變異。綜上所述，GXYZ2018株和GXSL2018株與近20年來的RABV廣西流行株高度相似，病毒蛋白主要功能區(qū)的氨基酸序列高度保守，尚未發(fā)生變異，全基因組遺傳特性穩(wěn)定。

4 結(jié)論

GXYZ2018株和GXSL2018株同屬于Group II型毒株，與近20年來的RABV廣西流行株高度相似，病毒蛋白主要功能區(qū)的氨基酸序列高度保守，尚未發(fā)生變異，全基因組遺傳特性穩(wěn)定。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）