微滴數(shù)字PCR技術(shù)動態(tài)監(jiān)測非小細胞肺癌患者血漿游離DNA EGFR基因突變研究

鄭曉彬 莊武 黃韻堅 林根 吳標 蔣侃 林金蘭 黃章洲

【摘要】 目的：探討微滴數(shù)字PCR技術(shù)（ddPCR）動態(tài)監(jiān)測非小細胞肺癌（NSCLC）患者血漿游離DNA表皮生長因子受體（EGFR）基因突變的臨床價值。方法：選取2017年3月-2019年3月就診于筆者所在醫(yī)院的120例NSCLC患者，均行突變擴增系統(tǒng)（ARMS）、ddPCR檢測血漿EGFR標本。以腫瘤組織ARMS檢查結(jié)果為金標準，分析血漿ARMS、ddPCR檢測EGFR基因突變的敏感性和特異性。結(jié)果：120例患者經(jīng)ARMS檢測到腫瘤組織標本中EGFR基因突變陰性59例（49.17%）;EGFR基因突變陽性61例（50.83%），其中Exon20 T790M突變2例，含Exon19del突變32例，含Exon21L858R突變26例，合并Exon20T790M突變1例;血漿ARMS、ddPCR檢測EGFR基因和含Exon19del、Exon21L858R基因突變的特異性均為100%，檢測EGFR基因和含Exon19del、Exon21L858R基因突變敏感性分別為57.38%（35/61）、80.33%（49/61），62.50%（20/32）、84.38%（27/32），46.15%（12/26）、76.92%（20/26），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論：ddPCR動態(tài)監(jiān)測NSCLC患者血漿EGFR基因突變的敏感性與特異性較高，并能夠定性EGFR基因突變類型，能為臨床治療提供指導。

【關(guān)鍵詞】 非小細胞肺癌 游離DNA表皮生長因子受體 微滴數(shù)字PCR技術(shù)

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2020.03.028 文獻標識碼 B 文章編號 1674-6805（2020）03-00-03

[Abstract] Objective： To investigate the clinical value of micro-drop digital PCR （ddPCR） in the dynamic monitoring of plasma free DNA epidermal growth factor receptor （EGFR） gene mutation in patients with non-small cell lung cancer （NSCLC）. Method： A total of 120 patients with NSCLC who were admitted to our hospital from March 2017 to March 2019 were enrolled in the study. All patients underwent mutation amplification system （ARMS） and ddPCR to detect plasma EGFR samples. The sensitivity and specificity of EGFR gene mutation were detected by plasma ARMS and ddPCR using the results of AMS examination of tumor tissue as the gold standard. Result： A total of 59 patients （49.17%） with negative EGFR gene mutations were detected by ARMS in the 120 patients. 61 cases were positive for EGFR gene mutation （50.83%）， including 2 cases of Exon20 T790M mutation， including 32 cases of Exon19del mutation， including Exon21L858R mutation 26 cases， 1 case of Exon20T790M mutation was combined. The specificity of EGFR gene and Exon19del and Exon21L858R gene mutations in plasma ARMS and ddPCR were 100%， and the mutation sensitivity of EGFR gene and Exon19del and Exon21L858R gene were 57.38% （35/ 61）， 80.33% （49/61）， 62.50% （20/32）， 84.38% （27/32）， 46.15% （12/26）， 76.92% （20/26） respectively， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion： The ddPCR can dynamically monitor the sensitivity and specificity of plasma EGFR gene mutation in patients with NSCLC， and can identify the type of EGFR gene mutation， which can provide guidance for clinical treatment.

[Key words] Non-small cell lung cancer Free DNA epidermal growth factor receptor Microdroplet digital PCR

First-authors address： Fujian Provincial Cancer Hospital Affiliated to Fujian Medical University， Fuzhou 350014， China

非小細胞肺癌（NSCLC）是肺癌常見類型之一，發(fā)病率約占肺癌的80%，其中60%～70%患者就診時已發(fā)展為中晚期，此時給予手術(shù)治療，難以達到理想的治療效果[1-2]。以游離DNA表皮生長因子受體（EGFR）基因為代表性靶點的小分子酪氨酸激酶抑制劑（TKI）是臨床治療NSCLC的靶向之一[3]。EGFR-TKI治療療效取決于EGFR基因突變。故選擇適宜的檢測方式篩選出EGFR基因突變及其類型，指導臨床治療，對改善患者預后尤為重要。因多數(shù)晚期NSCLC患者在疾病進展或初治后無法獲得組織標本檢測基因，限制患者從靶向治療獲益。有研究指出，可將外周血作為檢測EGFR基因突變的標本[4]。雖然液體活檢具有可重復檢測、方便易取等優(yōu)點，但因血漿循環(huán)腫瘤脫氧核糖核酸（ctDNA）濃度低、片段化嚴重、檢測手段欠標準化等不足，存在一定的爭議。本研究選取2017年3月-2019年3月就診于筆者所在醫(yī)院的120例NSCLC患者，均行突變擴增系統(tǒng)（ARMS）、ddPCR檢測血漿EGFR標本，以腫瘤組織ARMS檢查結(jié)果為金標準，分析兩者檢測價值，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年3月-2019年3月就診于筆者所在醫(yī)院的120例NSCLC患者，男58例，女62例;年齡31～79歲，平均（63.21±2.33）歲。納入標準：年齡≥18周歲;病理組織確診為NSCLC;骨髓功能、血常規(guī)、心電圖基本正常;首次治療。排除標準：精神疾患;造血功能嚴重障礙;哺乳期或妊娠期女性;肝腎功能嚴重障礙?；颊吆炇鹬橥鈺?。

1.2 方法

1.2.1 標本采集和DNA檢測 采集入組患者10 ml空腹靜脈血，行10 min的1 600 r/min離心操作，獲取上清液，再行10 min的16 000 r/min離心操作，收集血漿。按照循環(huán)DNA核酸提取試劑盒說明書提取DNA。使用美國Invitrogen公司的Qubit2熒光定量儀和安捷倫科技公司Agilent 2100生物分析儀對DNA片段大小和濃度進行分析。DNA片段約為170 bp，濃度>20 ng/μl為合格。

1.2.2 ARMS檢測 使用美國ABI公司的7500熒光定量PCR儀和人類EGFR基因突變檢測試劑盒（廈門艾德公司，批號01217081601X）檢測EGFR基因突變。嚴格按照試劑盒操作和結(jié)果判讀。

1.2.3 ddPCR 在含有相應探針的ddPCR超級混合液中加入DNA樣本，充分混合、離心后，置入20 ml的ddPCR反應液體系中，其含有模板、探針和引物等，在QX200 dd PCR系統(tǒng)中反應樣本。反應條件設(shè)置：擴增30個循環(huán)，95 ℃孵育5 min，72 ℃延伸7 min后結(jié)束，降至4 ℃。結(jié)果使用Quantasoft軟件分析。>2個突變微滴數(shù)為陽性界值。

1.3 觀察指標

以腫瘤組織ARMS檢查結(jié)果為金標準，分析ARMS、ddPCR檢測EGFR基因突變的敏感性和特異性。以n表示總例數(shù)，a表示真陽性，b表示假陽性，c表示假陰性，d表示真陰性。敏感性=a/（a+c），特異性=d/（b+d）。

1.4 統(tǒng)計學處理

用SPSS 21.0軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料以率（%）表示，采用字2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 以腫瘤組織ARMS檢查結(jié)果

120例患者經(jīng)ARMS檢測到腫瘤組織標本中EGFR基因突變陰性59例（49.17%）;EGFR基因突變陽性61例（50.83%），其中Exon20 T790M突變2例，含Exon19del突變32例，含Exon21L858R突變26例，合并Exon20T790M突變1例。

2.2 ARMS、ddPCR檢測EGFR基因突變的敏感性和特異性

ARMS、ddPCR檢測EGFR基因突變的特異性均為100%（59/59），敏感性分別為57.38%（35/61）、80.33%（49/61），差異有統(tǒng)計學意義（字2=7.491，P=0.006），見表1、表2。

2.3 ARMS、ddPCR檢測Exon19del突變特異性和敏感性

ARMS、ddPCR檢測Exon19del基因突變的特異性均為100.00%（59/59），敏感性分別為62.50%（20/32）、84.38%（27/32），差異有統(tǒng)計學意義（字2=3.925，P=0.048），見表3、表4。

2.4 ARMS、ddPCR檢測Exon21L858R突變特異性和敏感性

ARMS、ddPCR檢測Exon21L858R基因突變的特異性均為100%（59/59），敏感性分別為46.15%（12/26）、76.92%（20/26），差異有統(tǒng)計學意義（字2=5.200，P=0.023），見表5、表6。

3 討論

肺癌是目前死亡率較高的惡性腫瘤，其中NSCLC較為常見。EGFR-TKI阿法替尼、厄洛替尼、吉非替尼等治療存在EGFR基因突變的晚期NSCLC效果顯著。但初始對EGFR-TKI反應良好的患者幾乎均會在6～12個月內(nèi)出現(xiàn)疾病進展、耐藥等不良情況[5]。相關(guān)研究顯示，腫瘤對EGFR-TKI反應取決于EGFR基因突變狀態(tài)[6]。因此，早期準確鑒別診斷EGFR基因突變狀態(tài)，并持續(xù)監(jiān)測其變化狀態(tài)，及時發(fā)現(xiàn)耐藥、基因突變以改變治療策略，對針對性EGFR-TKI治療和預后預測至關(guān)重要。

細胞學標本或腫瘤病理組織標本是檢測EGFR基因突變的最常用來源，因腫瘤組織標本難以獲取，同時操作易受到腫瘤部位、大小及患者一般情況等影響，有時組織量太少或無法獲得滿意的組織標本實施基因突變檢測，且組織取材為有創(chuàng)操作，無法反復、便捷實施[7-8]。使用液體活檢技術(shù)取代組織活檢逐漸成為研究的熱點。ctDNA用于腫瘤突變檢測具有操作無創(chuàng)等優(yōu)勢，可作為腫瘤標記物，實時檢測、動態(tài)監(jiān)測，對治療策略的改變提供指導;可在疾病任一進程中獲取，且能夠克服腫瘤組織的異質(zhì)性。但檢測結(jié)果會因檢測技術(shù)不同存在一定差異，難以滿足臨床需要[9-10]。因而尋求一種檢測和判斷簡單且敏感度、高特異度的技術(shù)尤為重要。本研究結(jié)果顯示，ARMS、ddPCR檢測EGFR基因突變和Exon19del、Exon21L858R突變的特異性均為100%，檢測EGFR基因和含Exon19del、Exon21L858R基因突變敏感性分別為57.38%、80.33%，62.50%、80.77%，46.15%、76.92%，提示ddPCR檢測EGFR基因突變價值更高。ddPCR是經(jīng)微滴發(fā)生器對樣本實施微小滴化處理，制作成體積約為2×104個1 ml的微滴后實施PCR反應，隨后使用微滴檢測器逐個檢測每個微滴，能準確檢測出不含有目標分值的微滴數(shù)和含有目標分值的微滴數(shù)，根據(jù)兩者比例，計算出目標DNA分值的濃度，進而實現(xiàn)絕對定量[11-12]。微滴式數(shù)字PCR經(jīng)微滴化處理，能從大量的非目標DNA或雜質(zhì)中分離出目標片段，在單個微滴中獨立實施PCR反應，能使檢測敏感性提高。ddPCR使用現(xiàn)有的儀器便能完成檢測，操作簡單，且能絕對定量分析核酸，進而直接讀數(shù)判斷結(jié)果。本研究仍存在一定的不足之處，如納入樣本量較少，未對分析各方式診斷Exon20T790M突變、合并Exon20T790M突變的敏感性與特異性等，后期仍需深入研究。

綜上所述，ddPCR動態(tài)監(jiān)測NSCLC患者血漿EGFR基因突變的敏感性與特異性較高，并能定性EGFR基因突變類型，能為臨床治療提供指導。

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（收稿日期：2019-12-09） （本文編輯：張亮亮）