母豬卵泡發(fā)育同步化調(diào)控技術(shù)研究及應(yīng)用

秦玉圣，白佳樺，田見(jiàn)暉，馮 濤，宋玉清，肖霖力，黃 正，翁士喬，劉 彥*

(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100097；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，北京 100193；3.北京菲繁生物技術(shù)有限公司，北京 100142；4.寧波三生生物科技有限公司，浙江 寧波，315105）

生豬產(chǎn)業(yè)是我國(guó)畜牧業(yè)的重要支柱，我國(guó)不僅是世界上最大的豬肉生產(chǎn)國(guó)，同時(shí)也是最大的豬肉消費(fèi)國(guó)。自2018年8月國(guó)內(nèi)首次出現(xiàn)非洲豬瘟疫情后，其大面積迅速暴發(fā)，導(dǎo)致我國(guó)能繁母豬存欄急劇下降，對(duì)生豬產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)造成巨大損失。但通過(guò)此次疫情，國(guó)內(nèi)的生豬生產(chǎn)理念正在得到根本轉(zhuǎn)變，生物安全防控意識(shí)得到空前提高，基于母豬定時(shí)輸精技術(shù)的批次化全進(jìn)全出生產(chǎn)管理模式得到行業(yè)人員的更多關(guān)注。母豬定時(shí)輸精技術(shù)的實(shí)現(xiàn)前提是豬群發(fā)情周期同步化、卵泡發(fā)育同步化、排卵同步化和配種同步化，也就是既要發(fā)情周期的同步又要卵泡發(fā)育及排卵的同步。文章就母豬卵泡發(fā)育的同步化技術(shù)及其在定時(shí)輸精中的應(yīng)用進(jìn)行簡(jiǎn)要介紹。

1 發(fā)情周期同步化

欲母豬卵泡發(fā)育同步化，首先需要確保其發(fā)情周期同步。經(jīng)產(chǎn)母豬哺乳期間，由于仔豬吮吸乳頭刺激促乳素的分泌，負(fù)反饋抑制促性腺激素釋放激素（GnRH）的釋放，使母豬卵泡靜止不發(fā)育，統(tǒng)一斷奶后，由于同時(shí)解除了對(duì)GnRH的抑制，經(jīng)產(chǎn)母豬發(fā)情周期也達(dá)到同步化。同樣，通過(guò)激素制劑調(diào)控也可實(shí)現(xiàn)母豬發(fā)情周期的同步化，例如對(duì)處在不同發(fā)情周期的后備母豬，通過(guò)連續(xù)14～18 d飼喂15～20 mg/d烯丙孕素的措施，能有效阻止卵泡發(fā)育，當(dāng)停喂烯丙孕素后，后備母豬群可實(shí)現(xiàn)發(fā)情周期的同步化。

2 卵泡發(fā)育同步化

經(jīng)上述發(fā)情周期同步處理，依然存在母豬發(fā)情的個(gè)體差異較大，以及靜立發(fā)情、排卵較分散的問(wèn)題，無(wú)法實(shí)現(xiàn)定時(shí)輸精，原因在于母豬卵泡發(fā)育尚未達(dá)到同步。

2.1 母豬卵泡發(fā)育尚未達(dá)到同步的原因

1）母豬斷奶后卵泡會(huì)呈現(xiàn)多種發(fā)育狀態(tài)。由于母豬個(gè)體差異比較明顯，卵泡發(fā)育速度千差萬(wàn)別（圖1）。有的母豬斷奶時(shí)卵泡直徑較大，但在隨后的發(fā)育過(guò)程中生長(zhǎng)速率卻相對(duì)較慢，從而在正常時(shí)間區(qū)間內(nèi)發(fā)情。另有部分母豬斷奶時(shí)的卵泡直徑較大，但正在發(fā)生閉鎖，斷奶發(fā)情需要啟動(dòng)新的卵泡波，因此，斷奶發(fā)情間隔變長(zhǎng)，其發(fā)情時(shí)間晚于斷奶時(shí)卵泡較小的母豬。此外，還有一些母豬斷奶時(shí)直徑為5～6 mm的卵泡受到促黃體素（LH）的刺激，從卵泡閉鎖波中逃脫，這部分母豬斷奶發(fā)情間隔僅為3～4 d，并且快速進(jìn)入排卵前階段[1]。由此可見(jiàn)，即使發(fā)情周期實(shí)現(xiàn)同步化，但卵泡發(fā)育仍然不同步。

2）母豬卵泡發(fā)育是受生殖激素的調(diào)控。母豬斷奶后往往受多種因素影響，會(huì)干擾LH等激素的分泌進(jìn)而影響到卵泡的發(fā)育進(jìn)程。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)產(chǎn)母豬斷奶前后釋放LH的模式不同，斷奶前表現(xiàn)為低頻高振幅，斷奶后則以高頻低振幅為特點(diǎn)（圖2）。

圖1 母豬斷奶-排卵期間卵泡直徑的變化（取自3～5個(gè)最大卵泡的平均直徑）；（A）初產(chǎn)母豬斷奶-排卵間隔（◇：小于 6 d；■：6-7 d；△：8-9 d；※：大于 10 d）；（B）經(jīng)產(chǎn)母豬斷奶-排卵間隔（▲：4 d；■：5 d；◆：6 d）

圖2 母豬斷奶前LH分泌模式（A）和斷奶后分泌模式（B）

圖3 B超實(shí)時(shí)超聲斷奶母豬巢卵泡生長(zhǎng)圖像 A：母豬斷奶時(shí)卵泡直徑約3 mm； B：母豬斷奶后86～96 h卵泡直徑約6～8 mm（引自Sean O’Leary and Mark Nottle）

哺乳期間母豬能量負(fù)平衡會(huì)干擾LH的釋放模式，而卵泡發(fā)育、成熟與LH脈沖密切相關(guān)。尤其是初產(chǎn)母豬，斷奶時(shí)卵泡發(fā)育受LH影響較大，其斷奶時(shí)卵泡直徑平均約為2.5 mm，排卵時(shí)直徑達(dá)到7.0 mm。經(jīng)產(chǎn)母豬斷奶時(shí)卵泡發(fā)育受LH脈沖影響相對(duì)較小，斷奶、排卵時(shí)卵泡平均直徑分別為3.3 mm 和 8.0 mm[2]（圖 3）。

2.2 促卵泡發(fā)育的激素制劑研發(fā)應(yīng)用

卵泡發(fā)育是復(fù)雜的生物學(xué)事件，定時(shí)輸精需使卵泡發(fā)育同步化，但是不同生殖激素發(fā)揮著不同的作用。研究表明用純化后的促卵泡素（FSH）、LH每8 h處理一次母豬，連續(xù)處理64 h后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)FSH處理的母豬卵巢上3～6 mm的竇狀卵泡數(shù)量很多，但直徑均沒(méi)有突破6 mm。經(jīng)LH處理的母豬卵巢卵泡數(shù)量雖然少，但已達(dá)到排卵卵泡直徑標(biāo)準(zhǔn)7～9 mm，這說(shuō)明FSH可以增加中等卵泡的數(shù)量（卵泡募集），但卵泡進(jìn)一步生長(zhǎng)、發(fā)育則需要LH的刺激（卵泡優(yōu)勢(shì)化）。

為使母豬卵泡發(fā)育達(dá)到同步此，可采用外源性促性腺激素對(duì)卵泡發(fā)育進(jìn)行調(diào)控。目前，刺激卵泡發(fā)育的常見(jiàn)激素有孕馬血清（PMSG/eCG）、PG600、以及GnRH的激動(dòng)劑等。

PMSG屬于糖蛋白，其兼有FSH和LH的活性，但以FSH活性為主，在刺激卵泡同步發(fā)育方面具有很好的效果。研究表明經(jīng)產(chǎn)母豬斷奶后24 h注射500～750 IU的PMSG能促使母豬卵泡同步發(fā)育，后備母豬和初產(chǎn)母豬由于內(nèi)源性L(fǎng)H濃度較低，在應(yīng)用PMSG促進(jìn)母豬卵泡發(fā)育時(shí)劑量需增加到900～1 000 IU，停喂烯丙孕素后40 h肌肉注射1 000 IU的PMSG可促進(jìn)卵泡同步發(fā)育。雖然PMSG促進(jìn)卵泡發(fā)育取得較好的效果，但國(guó)內(nèi)外研究認(rèn)為PMSG產(chǎn)品批次之間生物活性差異很大，導(dǎo)致應(yīng)用效果不穩(wěn)定，因此，除了在生產(chǎn)提取工藝上對(duì)PMSG進(jìn)行純化外，PMSG與人絨毛膜促性腺激素（hCG）等激素組合也被用于研究母豬卵泡同步發(fā)育。

PG600是由400 IU的PMSG和200 IU的hCG組成，研究顯示PG600處理母豬不僅可縮短斷奶發(fā)情間隔，卵泡發(fā)育速度也更快、斷奶后同一時(shí)間點(diǎn)卵泡直徑更大。PG600處理泌乳母豬時(shí)，雖然能刺激卵泡發(fā)育至排卵前階段，但斷奶發(fā)情間隔顯著延長(zhǎng)。并且，可能是由于hCG具有LH效應(yīng)，兩者組合使用引起一定比例的卵泡囊腫或黃體化。研究表明，當(dāng)PMSG、hCG劑量分別從400 IU增加到700 IU、200 IU增加到350 IU時(shí)，母豬卵巢囊腫病變率由36%升至88%，同時(shí)妊娠率顯著下降。德國(guó)經(jīng)過(guò)大量試驗(yàn)表明，經(jīng)純化凍干后的PMSG粉劑用于刺激卵泡發(fā)育時(shí)，母豬受胎效果要顯著優(yōu)于PMSG和hCG的聯(lián)合制劑。

GnRH的激動(dòng)劑如Maprelin也可以用于刺激卵泡同步發(fā)育，并被認(rèn)為是PMSG的替代品。Maprelin注射閹豬時(shí)表現(xiàn)出FSH活性，研究表明其用于刺激初產(chǎn)、經(jīng)產(chǎn)母豬時(shí)卵泡發(fā)育、配種受胎率等指標(biāo)與PMSG相當(dāng)。hCG也能夠促進(jìn)卵泡的發(fā)育，但配種后母豬受胎率受到一定的影響。目前，誘導(dǎo)母豬卵泡同步發(fā)育研究及應(yīng)用方面，依然以PMSG為主。

3 卵泡排卵同步化

自然條件下，母豬排卵持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)6 h，這使部分卵子在與精子相遇前，已經(jīng)失去受精能力或死亡，輸精時(shí)間不當(dāng)將直接影響配種受胎率，所以，排卵同步化對(duì)于定時(shí)輸精的成敗至關(guān)重要。PMSG等促性腺激素雖然可實(shí)現(xiàn)母豬卵泡發(fā)育同步化，但母豬個(gè)體之間受品種、胎次、管理等因素影響，發(fā)情差異較大、排卵前LH峰出現(xiàn)時(shí)間不一致、排卵時(shí)間分散。為使母豬排卵時(shí)間更集中，通常需要在注射PMSG基礎(chǔ)上再注射促排卵激素進(jìn)行處理，最終實(shí)現(xiàn)卵泡發(fā)育及排卵的同步化，為精準(zhǔn)定時(shí)輸精建立基礎(chǔ)（圖4）。

在排卵的啟動(dòng)中，GnRH起到了關(guān)鍵的調(diào)控作用。生理?xiàng)l件下，卵泡分泌的雌激素正反饋?zhàn)饔糜谙虑鹉X釋放GnRH刺激垂體，促進(jìn)LH的分泌并達(dá)到排卵前LH峰值，引發(fā)卵泡破裂排卵。GnRH是由10個(gè)氨基酸組成的十肽，第1-4位氨基酸和第9-10位氨基酸高度保守，但第6和第7位、第9和第10位氨基酸之間的肽鍵極易被裂解酶分解斷裂，因此，GnRH在體內(nèi)極易失活。為提高GnRH的穩(wěn)定性，人工合成了一系列GnRH類(lèi)似物，如曲普瑞林、布舍瑞林、戈舍瑞林、亮丙瑞林、那法瑞林等等（如圖5）。

目前某些GnRH類(lèi)似物已在國(guó)外進(jìn)行試驗(yàn)研究[3]，并且部分結(jié)果表明，GnRH或其類(lèi)似物可誘導(dǎo)內(nèi)源性排卵前LH峰的出現(xiàn)，降低發(fā)情排卵間隔變異，用于母豬排卵同步化處理（圖6）。

3.1 曲普瑞林誘導(dǎo)母豬同步排卵

2000年，kraeling研究發(fā)現(xiàn)曲普瑞林能夠誘導(dǎo)雌激素處理的后備母豬出現(xiàn)LH峰，隨后Baer進(jìn)一步確認(rèn)曲普瑞林能夠誘導(dǎo)母豬排卵。目前，針對(duì)曲普瑞林研究較多的是將其制成凝膠狀，并通過(guò)特殊注射器定量將藥物置于母豬陰道，經(jīng)黏膜吸收刺激母豬排卵（如圖7）。

圖4 性周期同步化母豬在PMSG、GnRH處理后達(dá)到排卵同步化

圖5 GnRH類(lèi)似物及其分子結(jié)構(gòu)模式圖

Knox將曲普瑞林凝膠注入母豬陰道篩選給藥時(shí)間和劑量[4]。發(fā)現(xiàn)200 μg曲普瑞林處理后48 h可使81%的母豬排卵。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在斷奶后72 h、84 h、96 h的不同時(shí)間點(diǎn)給予200 μg曲普瑞林陰道凝膠，結(jié)果顯示處理后40 h，3組母豬排卵比例分別達(dá)到56.5%、62.2%和13%；處理后48 h，3組母豬排卵比例均達(dá)到64%，同時(shí)，自然發(fā)情對(duì)照組僅有34%母豬出現(xiàn)排卵，此試驗(yàn)說(shuō)明母豬斷奶后96 h給予200 μg曲普瑞林凝膠能使母豬排卵更集中。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，斷奶96 h陰道凝膠處理組母豬斷奶排卵間隔顯著縮短，妊娠率、分娩率達(dá)到自然狀態(tài)下母豬發(fā)情鑒定、適時(shí)輸精生產(chǎn)的水平。試驗(yàn)中，雖然72 h、84 h處理后母豬排卵提前至少10 h，但采用人工輸精后，兩組配種妊娠率顯著降低20%～50%，分娩率降低30%～50%，其可能原因是激素處理時(shí)間較早，此時(shí)卵子尚未徹底成熟，曲普瑞林誘發(fā)LH峰后卵泡提前排卵，導(dǎo)致輸精后精子未能與卵子在合適的時(shí)間完成受精，也可能是未成熟的卵子受精后胚胎質(zhì)量較低，在早期發(fā)育階段死亡。

后備母豬經(jīng)烯丙孕素處理達(dá)到發(fā)情周期同步化[5]，間隔120 h，分別用 100 μg、200 μg、400 μg 曲普瑞林凝膠誘導(dǎo)其排卵，發(fā)現(xiàn)在處理后48 h母豬集中排卵，其中以200 μg劑量組誘導(dǎo)排卵集中度最高（圖8）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，停喂烯丙孕素后96 h、120 h、144 h給予200 μg曲普瑞林處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)120 h處理組母豬24～48 h內(nèi)排卵比例達(dá)到80%，有效促進(jìn)后備母豬的同步排卵。

3.2 布舍瑞林誘導(dǎo)母豬同步排卵

布舍瑞林作為GnRH的類(lèi)似物，在誘導(dǎo)母豬同步排卵方面也獲得較多的關(guān)注。研究表明，母豬斷奶時(shí)肌肉注射600 IU的PMSG，間隔90 h后注射布舍瑞林，并在30 h后進(jìn)行第一次配種，結(jié)果發(fā)現(xiàn)能夠顯著縮短母豬斷奶到排卵的間隔，并且在布舍瑞林處理后32 h，排卵母豬比例達(dá)到95%以上。當(dāng)僅用布舍瑞林處理斷奶母豬時(shí)，斷奶排卵間隔雖然也能顯著縮短，但效果不如與PMSG聯(lián)合使用。在另一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，大白母豬斷奶后94 h、104 h肌肉注射布舍瑞林，結(jié)果顯示，斷奶94 h布舍瑞林處理后32～56 h內(nèi)排卵母豬比例達(dá)到100%，而104 h、以及自然發(fā)情組排卵母豬比例分別僅有66.7%、68.7%，說(shuō)明布舍瑞林注射時(shí)間點(diǎn)的選擇對(duì)母豬排卵同步化至關(guān)重要。目前，國(guó)內(nèi)獸藥企業(yè)正在積極開(kāi)發(fā)布舍瑞林相關(guān)藥物，但其應(yīng)用于定時(shí)輸精程序仍需要結(jié)合大量生產(chǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析優(yōu)化研究。

圖6 GnRH類(lèi)似物單獨(dú)或與PMSG連用對(duì)母豬排卵前LH峰的影響（引自Sean O’Leary and Mark Nottle）

圖7 曲普瑞林凝膠陰道給藥模式圖

圖8 后備母豬曲普瑞林凝膠陰道給藥劑量篩選

3.3 其他促性腺激素誘導(dǎo)母豬同步排卵

hCG作為L(zhǎng)H的類(lèi)似物，可直接作用于卵巢。20世紀(jì)70年代初，東歐部分國(guó)家已經(jīng)在用PMSG預(yù)處理母豬后，注射hCG誘導(dǎo)排卵，并且85%～90%的母豬在處理后42 h發(fā)生排卵。pLH是豬促黃體生成素，與hCG作用原理一致，研究表明母豬斷奶時(shí)注射600 IU PMSG，間隔80 h后注射5 mg pLH，通過(guò)B超監(jiān)測(cè)排卵時(shí)間結(jié)果發(fā)現(xiàn)母豬在34.25～42.5 h后發(fā)生排卵，平均排卵時(shí)間為38.2 h。但由于這些激素存在一定的副作用，或提取困難、成本高等缺點(diǎn)，逐漸被市場(chǎng)上其他促排藥物代替。

就目前各種促排激素制劑而言，與其他蛋白類(lèi)誘導(dǎo)排卵激素制劑如hCG、LH相比，GnRH及其類(lèi)似物能夠刺激內(nèi)源性L(fǎng)H的分泌，并且具有低毒、代謝快、價(jià)格低等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)GnRH屬于小分子，重復(fù)使用不會(huì)引起機(jī)體產(chǎn)生抗體，安全性高，因此，獲得越來(lái)越多的關(guān)注。

4 卵泡發(fā)育同步化在定時(shí)輸精中的應(yīng)用

事實(shí)上，母豬發(fā)情周期、卵泡發(fā)育及排卵同步化調(diào)控效果與豬場(chǎng)管理、母豬品種、激素制劑效價(jià)及穩(wěn)定性等密切相關(guān)。近幾年，豬場(chǎng)批次化生產(chǎn)在國(guó)內(nèi)引起了高度關(guān)注，不少豬場(chǎng)開(kāi)始建立三周批次、四周批次等批次化模式生產(chǎn)，先期嘗試引入國(guó)外的簡(jiǎn)式或精準(zhǔn)定時(shí)輸精程序，但是出現(xiàn)了諸多效果不一的問(wèn)題，有人甚至對(duì)定時(shí)輸精技術(shù)產(chǎn)生了疑問(wèn)。為此，國(guó)內(nèi)一些高校、科研單位、動(dòng)物制藥企業(yè)與養(yǎng)豬企業(yè)相繼開(kāi)展了定時(shí)輸精技術(shù)的研發(fā)與生產(chǎn)試驗(yàn)。其中，全國(guó)豬定時(shí)輸精協(xié)作組在國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃等項(xiàng)目支持下，結(jié)合我國(guó)實(shí)際生產(chǎn)及豬場(chǎng)管理情況，開(kāi)展了較為系統(tǒng)的定時(shí)輸精程序的優(yōu)化研究。通過(guò)許多次探索研究，項(xiàng)目組成功將B超技術(shù)應(yīng)用于母豬卵泡的動(dòng)態(tài)檢查，以直觀(guān)呈現(xiàn)卵巢對(duì)激素制劑處理的應(yīng)答效應(yīng)，直接應(yīng)用生產(chǎn)中開(kāi)展定時(shí)輸精程序優(yōu)化的研究。借助B超技術(shù)對(duì)定時(shí)輸精的激素制劑處理后的卵泡發(fā)育實(shí)時(shí)檢查分析[6]，不斷進(jìn)行激素制劑使用與輸精時(shí)機(jī)的調(diào)整，通過(guò)生產(chǎn)試驗(yàn)建立了母豬發(fā)情促排模式的定時(shí)輸精程序（圖9上）；另外，在前期精準(zhǔn)式程序基礎(chǔ)上優(yōu)化出了兩點(diǎn)式查情定時(shí)輸精程序（圖9下）。

圖9 發(fā)情促排定時(shí)輸精程序（上）、兩點(diǎn)式查情定時(shí)輸精（下）

經(jīng)過(guò)多個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)連續(xù)多批次的生產(chǎn)應(yīng)用，優(yōu)化的定時(shí)輸精程序在生產(chǎn)中取得了較穩(wěn)定的生產(chǎn)效果，顯著提高了批次母豬的受胎率、分娩率與利用率，母豬利用率的提高也為批次化生產(chǎn)中母豬群周轉(zhuǎn)安排提供了方便，促進(jìn)了豬場(chǎng)批次化生產(chǎn)的整體效率提高，有效推動(dòng)我國(guó)規(guī)?；i場(chǎng)連續(xù)式生產(chǎn)向批次化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)變。