miR-375 在變應(yīng)性鼻炎小鼠鼻黏膜上皮細(xì)胞凋亡中的調(diào)控作用

汪濤 王珮華 陳東 李瑩

變應(yīng)性鼻炎是耳鼻咽喉科的常見(jiàn)病，普通人群患病率較高[1]，而且對(duì)患者的學(xué)習(xí)、工作和生活都有明顯的影響。變應(yīng)性鼻炎是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結(jié)果，其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜。研究證實(shí)參與變應(yīng)性鼻炎免疫反應(yīng)的分子機(jī)制具有多環(huán)節(jié)、復(fù)雜的瀑布效應(yīng)[2]，并有眾多micro RNA、蛋白分子、細(xì)胞因子等參與其中。近年來(lái)研究熱門(mén)的micro RNA在天然免疫和獲得性免疫系統(tǒng)中作用巨大，可調(diào)控多種免疫細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等功能，其中miR-375 就在腫瘤和炎癥的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的調(diào)控作用[3，4]。鼻黏膜上皮細(xì)胞異常凋亡會(huì)導(dǎo)致變應(yīng)性鼻炎[5]，miRNA-375 是否參與變應(yīng)性鼻炎鼻黏膜上皮細(xì)胞的凋亡目前尚未知。因此，該課題設(shè)計(jì)運(yùn)用變應(yīng)性鼻炎動(dòng)物模型來(lái)驗(yàn)證miR-375 參與變應(yīng)性鼻炎的鼻黏膜上皮細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制，為變應(yīng)性鼻炎的基因靶向治療方面提供新思路。

資料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用BALB/C 小鼠（SPF 級(jí)）雌性，5 周齡，購(gòu)買(mǎi)于南京大學(xué)動(dòng)物模型研究中心，所有動(dòng)物飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)條件為SPF 級(jí)，動(dòng)物的所有處理符合上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)要求。

2 實(shí)驗(yàn)分組

購(gòu)買(mǎi)的40 只雌性BALB/C 小鼠（SPF 級(jí)）隨機(jī)分為五組予以不同的實(shí)驗(yàn)干預(yù)。正常對(duì)照組（NC組）：小白鼠僅用生理鹽水進(jìn)行腹腔注射和滴鼻處理；OVA 組：為卵清蛋白致敏的變應(yīng)性鼻炎模型組（見(jiàn)變應(yīng)性鼻炎動(dòng)物建模部分）；OVA+敲除JAK2組：為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用卵清蛋白致敏后，用帶有敲除JAK2（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）的腺病毒感染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；OVA+miR-375 組：為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用卵清蛋白致敏后，繼續(xù)用帶有miR-375 模擬物（上海拓然生物科技有限公司）的腺病毒注射實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(每只小鼠20μM/5μl)，連續(xù)4 天；OVA+miR-375+JAK2 組：為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用卵清蛋白致敏后，繼續(xù)用帶有miR-375 模擬物的腺病毒腹腔注射和帶有過(guò)表達(dá)JAK2的腺病毒（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）灌注鼻腔，連續(xù)4 天。

3 BALB/C 小鼠變應(yīng)性鼻炎模型的制備

3.1 腹腔注射用卵清蛋白溶液

每毫升1×PBS 緩沖液含10μg 卵清蛋白OVA（美國(guó)Sigma 公司）和1mg 氫氧化鋁，使用前新鮮配置，震蕩混勻后進(jìn)行小鼠腹腔注射。

3.2 滴鼻用卵清蛋白

每20 微升1×PBS 緩沖液中含500μg 的OVA，使用前新鮮配置。

3.3 所有變應(yīng)性鼻炎組小鼠于第0、7、14 天每只小鼠腹腔注射上述腹腔注射用卵清蛋白溶液500μL進(jìn)行基礎(chǔ)致敏，一天1 次；從第21 天開(kāi)始經(jīng)鼻給予每只小鼠含500μg OVA 的1×PBS 緩沖液20μL 局部激發(fā)，連續(xù)7 天。觀察建模組小鼠有明顯過(guò)敏性行為表現(xiàn)時(shí)，說(shuō)明建模成功。正常對(duì)照組小鼠給予同等劑量生理鹽水的緩沖液腹腔注射和滴鼻。

4 標(biāo)本采集和處理

4.1 靜脈血清的采集和處理

靜脈采血：10%水合氯醛按0.01ml/g 劑量腹腔注射麻醉小鼠，小鼠約5 分鐘后達(dá)到理想的麻醉狀態(tài)，碘伏消毒眼周皮毛固定小鼠后使用毛細(xì)管進(jìn)行穿刺。用離心管收集毛細(xì)管末端流出的血液后靜置，待分離血清。

血清采集：將上述離心管中血樣室溫靜置2 小時(shí)后，以3000 轉(zhuǎn)/分鐘在4℃下離心15 分鐘，離心管上層清亮的液體即為血清，用200μl 離心管分裝后置于超低溫冰箱中保存，備用。

4.2 鼻黏膜標(biāo)本的采集和處理

各實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物完成建模和預(yù)設(shè)的實(shí)驗(yàn)步驟后24 小時(shí)，麻醉后頸椎脫曰處死小鼠，取頭部，與硬腭垂直方向剪開(kāi)鼻正中縫，在顯微鏡下暴露小鼠鼻腔，使用顯微器械刮取小鼠鼻中隔和雙側(cè)鼻腔外側(cè)壁的鼻黏膜，放入凍存管，液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

5 組織細(xì)胞的凋亡檢測(cè)（TUNEL 實(shí)驗(yàn)）

各實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的鼻黏膜標(biāo)本，生理鹽水沖洗后，用10%福爾馬林固定后，石蠟包埋處理，切片（厚度為5μm），用TUNEL 試劑盒（Sangon Biotech Co.Ltd.）進(jìn)行組織內(nèi)細(xì)胞凋亡的檢測(cè)，計(jì)數(shù)隨機(jī)5個(gè)視野下TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量。

6 實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）

使用TRIzolTMReagent（Cat＃15596026,Invitrogen,USA）試劑提取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物鼻黏膜組織總RNA；按照標(biāo)準(zhǔn)方案，使用miRNA RT 試劑盒（Cat＃1801，哈爾濱新海基因檢測(cè)有限公司） 和EasyScript Reverse Transcriptase（北京全式金生物）將目標(biāo)miRNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；使用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒（TaKaRa Bio Inc., USA）和Hairpin-itTMMicroRNAs Quantitation（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）在ABI Prism 7500 (Applied Biosystems, Inc., USA)上選擇性擴(kuò)增目標(biāo)miRNA，使用2-△△ct法計(jì)算miR-375 和每種轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平。

7 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

實(shí)驗(yàn)小鼠血漿采集后取其血清，血清IL-6、IL-10 和TNF-α 的濃度檢測(cè)按照ELISA 試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)程序操作，ELISA 試劑盒購(gòu)買(mǎi)于Abcam 公司（ab209519 用 于 IL -10；ab100712 用 于 IL -6;ab100747 用于TNF-α）。

8 蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)（Western Blot）

與細(xì)胞凋亡相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)蛋白及酶的一抗抗體均購(gòu)于Abcam 公司，包括抗JAK2 蛋白(ab108596)，抗裂解的蛋白酶3（Cleaved caspase 3）（ab2302），抗聚 [ADP-核糖] 聚合酶裂解酶（Cleaved PARP）（ab32064），抗蛋白酶3（Caspase 3）(ab13847)，抗聚[ADP-核糖]聚合酶（PARP）（ab32138)，抗p-STAT3 蛋白（ab30647），抗STAT3 蛋白（ab119352）和抗β 肌動(dòng)蛋白（β-actin）(ab8227)。蛋白電泳后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，并與過(guò)氧化物酶綴合的抗體一起溫育，使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑盒（Millipore），利用暗室顯影技術(shù)采集化學(xué)發(fā)光圖像。

9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用專(zhuān)業(yè)統(tǒng)計(jì)軟件（SAS Release 8.01 TS Level 01m0）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間的比較用T 檢驗(yàn)（T-test），不同實(shí)驗(yàn)組間的數(shù)據(jù)比較用方差分析（One-way ANOVA），P＜0.01 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)和TUNEL 實(shí)驗(yàn)

結(jié)果顯示，JAK2 和p-STAT3 染色的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在OVA 組明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.01）（圖1）；正常對(duì)照組、OVA 組和OVA+敲除JAK2 組中鼻黏膜上皮細(xì)胞凋亡情況顯示，OVA+敲除JAK2 組的鼻黏膜上皮細(xì)胞凋亡和裂解的蛋白酶3（Caspase 3）的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯低于OVA 組（P＜0.01），與正常對(duì)照組無(wú)明顯差異（圖2）；OVA+miR-375 組和OVA+miR-375+JAK2 組的TUNEL 染色和免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示（圖3），注射miR-375 模擬物顯著降低小鼠變應(yīng)性鼻炎鼻黏膜上皮凋亡陽(yáng)性和裂解的蛋白酶3 陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)（P＜0.01），這一保護(hù)作用可以被過(guò)表達(dá)JAK2 的腺病毒感染后而減弱。

圖1 免疫組織化學(xué)染色顯示JAK2 和p-STAT3 在正常對(duì)照組和OVA 組顯色情況

圖2 Tunel 陽(yáng)性細(xì)胞百分比和裂解的蛋白酶3 顯色陽(yáng)性的細(xì)胞百分比，OVA 組明顯高于OVA+敲除JAK2 組，（**顯示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性，P＜0.01）

圖3 Tunel 陽(yáng)性細(xì)胞百分比和裂解的蛋白酶3 顯色陽(yáng)性的細(xì)胞百分比，**顯示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性，P＜0.01

2 實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）

如圖4 所示，miR-375 在變應(yīng)性鼻炎模型組（OVA 組）的表達(dá)水平較正常對(duì)照組明顯偏低（P＜0.01）；而JAK2 miRNA 的表達(dá)水平在變應(yīng)性鼻炎模型組（OVA 組）明顯上調(diào)（P＜0.01），研究證實(shí)JAK2/STAT3 信號(hào)通路與細(xì)胞凋亡和過(guò)敏有關(guān)[6]；正常對(duì)照組、OVA 組和OVA+敲除JAK2 組中miR-375 的表達(dá)顯示，JAK2 敲除并未影響OVA 誘導(dǎo)致敏后變應(yīng)性鼻炎小鼠黏膜上皮內(nèi)miR-375 水平的降低（圖5），說(shuō)明JAK2 可能是miR-375 的一個(gè)下游靶點(diǎn)。

圖4 正常組和OVA 組miR-375 和JAK2 的比較（**顯示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性，P＜0.01）

圖5 miR-375 在OVA 組和OVA+敲除JAK2 組間并未顯示有差異性

3 蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)（Western Blot）

結(jié)果顯示，與細(xì)胞凋亡的相關(guān)蛋白在正常對(duì)照組和OVA 組表達(dá)明顯不同，JAK2 和p-STAT3 蛋白的表達(dá)在OVA 組明顯濃聚，而β-actin 和STAT3 蛋白并未顯示明顯差別（圖6-A）；為了驗(yàn)證變應(yīng)性鼻炎黏膜上皮的凋亡與JAK2 高表達(dá)有關(guān)，通過(guò)OVA組和OVA+敲除JAK2 組中凋亡相關(guān)蛋白的檢測(cè)明顯裂解的蛋白酶3 在OVA+敲除JAK2 組明顯低于OVA 組（圖6-B）；并且裂解的蛋白酶3 在OVA+miR-375 組明顯低于OVA 組和OVA+miR-375+JAK2 組（圖6-C）。

圖6 Western Blot 檢測(cè)顯示JAK2、p-STAT3、STAT3、β-actin 以及裂解的蛋白酶3、蛋白酶3 在各實(shí)驗(yàn)組間的比較

4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

結(jié)果顯示，敲除JAK2 可有效降低促炎細(xì)胞因子（IL-6 和TNF-α）的表達(dá)，同時(shí)增加變應(yīng)性鼻炎小鼠血漿中抗炎細(xì)胞因子IL-10 的表達(dá)（圖7），表明敲除了JAK2 可抑制變應(yīng)性鼻炎小鼠鼻黏膜上皮的細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)；為了進(jìn)一步探討了miR-375是否通過(guò)JAK2 途徑來(lái)調(diào)控變應(yīng)性鼻炎小鼠鼻黏膜細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，血清ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示，注射miR-375 模擬物可降低OVA 致敏后上調(diào)的促炎癥細(xì)胞因子（IL-6 和TNF-α）的表達(dá)，同時(shí)增加變應(yīng)性鼻炎小鼠血漿中OVA 致敏后下調(diào)的抗炎細(xì)胞因子IL-10 的表達(dá)，這些調(diào)控作用同樣可以通過(guò)過(guò)表達(dá)JAK2 腺病毒的感染而逆轉(zhuǎn)（圖8），因此該研究數(shù)據(jù)表明，miR-375 可通過(guò)JAK2 途徑調(diào)控變應(yīng)性鼻炎鼻黏膜上皮細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。

圖7 血漿IL-6、TNF-α、IL-10 細(xì)胞因子在OVA 組和OVA+敲除JAK2 組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性（**顯示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性，P＜0.01）

討論

變應(yīng)性鼻炎常見(jiàn)并且多發(fā)，對(duì)患者的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響，其發(fā)病機(jī)理復(fù)雜。近年來(lái)研究熱門(mén)的miRNA 在免疫系統(tǒng)中作用巨大，可調(diào)控多種免疫細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等功能。微小RNA（micro RNA, miRNA）是一類(lèi)內(nèi)源性表達(dá)的小分子非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控中發(fā)揮重要的作用[7]，是近年來(lái)生命科學(xué)研究中的重大突破，并且參與腫瘤和炎癥中細(xì)胞的分化和凋亡等生理病理過(guò)程[8-11]，針對(duì)miRNA 的研究可為變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病機(jī)制研究、免疫治療方面提供新的方向。

miR-375 是作為調(diào)節(jié)胰島素分泌的胰島特異性miRNA[12]，研究顯示miR-375 通過(guò)靶向幾個(gè)重要的基因如AEG-l，YAPl，IGFIR 和PDKl 等參與多種類(lèi)型的惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。陸翰杰等[13]證實(shí)miR-375 的低表達(dá)可能與食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移相關(guān)；前列腺癌患者血清miR-375 水平明顯升高，且與患者臨床病理特征存在相關(guān)性[14]；胃癌組織中的miR-375 基因的表達(dá)水平明顯下降，而基因甲基化的比例明顯上升，且均與腫瘤的分化程度有關(guān)[15]，均表明miR-375 參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控。變應(yīng)性鼻炎的發(fā)生與鼻黏膜上皮細(xì)胞的異常凋亡有關(guān)[5]，多項(xiàng)研究也證實(shí)JAK2/STAT3 信號(hào)通路參與了細(xì)胞凋亡的調(diào)控[6，16]，并且證實(shí)JAK2 就是miR-375 的下游潛在靶點(diǎn)[17，18]。因此，miR-375 是否參與了過(guò)敏性鼻炎的鼻黏膜細(xì)胞的凋亡，并且miR-375/JAK2/STAT3 軸是否存在于鼻黏膜上皮細(xì)胞凋亡中并且參與變應(yīng)性鼻炎是本研究需要證實(shí)的。

圖8 血漿IL-6、TNF-α、IL-10 細(xì)胞因子在OVA 組和OVA+miR-375+JAK2 組與OVA+miR-375 組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性（**顯示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性，P＜0.01）

我們通過(guò)對(duì)卵清蛋白致敏小鼠變應(yīng)性鼻炎模型的鼻黏膜樣本的基因檢測(cè)得出miR-375 的含量較對(duì)照組明顯降低，而JAK2 明顯升高，JAK2 和p-STAT3 的蛋白表達(dá)水平在變應(yīng)性鼻炎組明顯升高，說(shuō)明miR-375 在變應(yīng)性鼻炎進(jìn)展中有保護(hù)性作用，而JAK2 為miR-375 在鼻黏膜上皮細(xì)胞中的下游靶點(diǎn)；實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步通過(guò)miR-375 過(guò)表達(dá)或敲除JAK2的腺病毒感染OVA 致敏小鼠達(dá)到了有效抑制鼻黏膜上皮細(xì)胞凋亡和炎癥，說(shuō)明miR-375 可通過(guò)抑制JAK2/STAT3 通路阻止小鼠鼻黏膜細(xì)胞凋亡，改善變應(yīng)性鼻炎。曾有研究表明黃芩苷可以通過(guò)阻斷JAK2-STAT5 和NF-κB 信號(hào)通路來(lái)抑制卵清蛋白誘導(dǎo)豚鼠的變應(yīng)性鼻炎和肥大細(xì)胞的激活[19]。在本研究中，我們通過(guò)qRT-PCR、蛋白質(zhì)印跡、免疫組織化學(xué)、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)方法均證明了JAK2 為miR-375 的下游直接靶標(biāo)，并發(fā)現(xiàn)miR-375 可阻斷JAK2/STAT3 通 路，與 先 前 的 研 究 報(bào) 道 一 致[20，21]。miR-375/JAK2 軸可能是多種病理過(guò)程中的常見(jiàn)現(xiàn)象，另外，由于過(guò)表達(dá)JAK2 可能會(huì)減弱miR-375 對(duì)變應(yīng)性鼻炎小鼠的保護(hù)作用，并且miR-375 參與阻斷或激活下游其他信號(hào)通路較多[22-25]，因此，miR-375 介導(dǎo)的變應(yīng)性鼻炎保護(hù)作用可能會(huì)涉及其他信號(hào)通路，仍需要進(jìn)一步的研究來(lái)證實(shí)。本研究主要運(yùn)用了小鼠變應(yīng)性鼻炎的動(dòng)物模型驗(yàn)證了miR-375在變應(yīng)性鼻炎黏膜上皮細(xì)胞凋亡中的調(diào)控作用，并未證明miR-375 是否參與人類(lèi)變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病過(guò)程，這也是我們下一步實(shí)驗(yàn)需要驗(yàn)證的。

總之，miR-375 在變應(yīng)性鼻炎小鼠的鼻黏膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)顯著減少，并通過(guò)JAK2/STAT3 信號(hào)通路參與調(diào)控鼻黏膜上皮細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，miR-375 的高表達(dá)是變應(yīng)性鼻炎的保護(hù)性機(jī)制，miR-375 模擬物可能成為臨床變應(yīng)性鼻炎免疫治療的潛在靶向藥物。