FAD 為輔基的葡萄糖脫氫酶發(fā)酵、純化及酶學(xué)性質(zhì)

林 榮， 宋祖坤， 張 玲， 王 男， 楊海麟

（江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122）

血糖水平是糖尿病臨床診斷的主要和常規(guī)檢測指標(biāo)[1]。 葡萄糖氧化酶是葡萄糖檢測試劑盒或葡萄糖傳感器中應(yīng)用最廣泛的原料用酶，但其催化活性易受溶解氧的限制，會造成測量誤差。 目前發(fā)現(xiàn)葡萄糖脫氫酶具有替代葡萄糖氧化酶的潛力，因其不以氧氣為電子受體，不受溶解氧的限制，檢測結(jié)果誤差更小[2]。

葡萄糖脫氫酶按照輔基或輔酶類型可分為4類[3]： 1）以NADP+為輔酶的葡萄糖六磷酸脫氫酶（EC1.1.1.49 簡稱G6PDH）； 2）以NAD+為輔酶的葡萄糖脫氫酶 （EC 1.1.1.47 簡稱NAD-GDH）； 3）以PQQ 為輔基的葡萄糖脫氫酶（EC1.1.5.2 簡稱PQQGDH）；4）以FAD 為輔基的葡萄糖脫氫酶（EC1.1.99.10簡稱FAD-GDH）。 G6PDH 和NAD-GDH 輔因子結(jié)合不緊密，催化過程中需要不斷添加輔酶[4-5]。 PQQGDH 熱穩(wěn)定性差，底物譜較廣[6]，除葡萄糖外還能以多種單糖和二糖為底物， 限制其檢測血糖的應(yīng)用。FAD-GDH 具有熱穩(wěn)定性好、催化效率高、輔基結(jié)合緊密等優(yōu)勢，可作為替代目前診斷用葡萄糖氧化酶的首選。

FAD-GDH 主要來源于真菌[7]，罕見于細(xì)菌。 真菌分泌FAD-GDH 較少，研究者主要研究其基因在Pichia pastoris和E.coliBL21 中的異源表達(dá)。楊愈峰等人將來源于土曲霉的FAD-GDH 基因在Pichia pastoris中進(jìn)行表達(dá)， 通過表達(dá)篩選及15 L 發(fā)酵罐發(fā)酵，上清液酶活達(dá)2.6×105U/L[8]，但在酵母菌中表達(dá)的異源葡萄糖脫氫酶存在糖基化修飾，會干擾血糖檢測電極的靈敏度，實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中需進(jìn)行酶的去糖基化步驟[9]。 周立偉等人篩選克隆出來源于青霉的FAD-GDH 基因，在E.coliBL21 中表達(dá)的蛋白質(zhì)大部分為包涵體[10]。 來源于真菌的葡萄糖脫氫酶在大腸桿菌中異源表達(dá)常常需要與分子伴侶共表達(dá)才能實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，蛋白質(zhì)純化和放大生產(chǎn)較為困難。Koji Sode 等人發(fā)現(xiàn)并克隆了迄今惟一來源于細(xì)菌Burkholderia cepacia的FAD-GDH 基因，并研究了分子伴侶對酶表達(dá)的影響[11]，但并未對其異源表達(dá)發(fā)酵生產(chǎn)、純化和酶學(xué)性質(zhì)做全面和深入研究。

作者將來源于Burkholderia cepacia的以FAD為輔基的葡萄糖脫氫酶基因[12]在E.coliBL21（DE3）中進(jìn)行表達(dá)，選用工業(yè)生產(chǎn)上廉價的乳糖作為誘導(dǎo)劑，7.5 L 發(fā)酵罐放大培養(yǎng)，探索分離純化工藝，研究其酶學(xué)特性，為其工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌 株 重 組E.coliBL21 （DE3）/pTrc99a-GDH：由作者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB（g/L）：酵母粉5，蛋白胨10，氯化鈉5，加入2 g/dL 的瓊脂為LB 固體培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：酵母膏10，蛋白胨15，葡萄糖0.5， 甘油5 mL/L， 無機(jī)鹽成分Na2HPO27.1，KH2PO42，K2HPO44，（NH4）2SO41.3，MgSO40.12，微量元素[11]。 培養(yǎng)基均添加過濾除菌的氨芐青霉素100 mg/L。

補(bǔ)料培養(yǎng)基（g/L）：酵母膏50，蛋白胨50，甘油100 mL。

乳糖誘導(dǎo)液（g/L）：乳糖200。

1.1.3 緩沖液 50 mmol/L 檸檬酸緩沖液（pH 4.0），50 mmol/L 醋酸緩沖液（pH 5.0），50 mmol/L 磷酸鉀緩沖液（pH 6.0～7.0），50 mmol/L Tris-HCl 沖液（pH 8.0～9.0）。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 種子液的制備：從平板挑取單菌落接種到LB 培養(yǎng)基，于37 ℃、200 r/min 搖床培養(yǎng)8 h。

7.5 L 罐發(fā)酵：7.5 L 發(fā)酵罐中加入4 L 培養(yǎng)基，115 ℃滅菌30 min，將活化的種子液按體積分?jǐn)?shù)5%接入發(fā)酵罐分批培養(yǎng)，溶氧迅速上升，恒速0.04 L/h流加補(bǔ)料培養(yǎng)基10 h， 溫度從37 ℃降到30 ℃，恒速0.015 L/h 流加乳糖誘導(dǎo)表達(dá)。 pH 通過自動流加50%的磷酸和25%的氨水控制在7.0，通過攪拌轉(zhuǎn)速及通氣量調(diào)節(jié)溶氧維持在30%[13]。

1.2.2 菌體生物量測定 取不同OD600的適量菌液，8 000 r/min 離心10 min 清洗兩次，105 ℃烘干至恒定值，稱取細(xì)菌干重，細(xì)胞干重與OD600成線性y=0.44x-0.036。

1.2.3 酶的分離純化 8 000 r/min 離心5 min 收集菌體后，用pH 7.0、50 mmol/L 的磷酸鉀緩沖液重懸菌體，冰水浴超聲破碎菌體，破壁后8 000 r/min 離心10 min，上清液即為粗酶液。 利用融合在酶C 末端的組氨酸標(biāo)簽，將粗酶液分別過HisTrap HP（鎳柱）、HiPre TM 26/10 Desalting（脫鹽柱）和DEAE FF（陰離子交換柱層析柱），獲得純酶。

1.2.4 酶活測定 酶活定義：在一定條件下，每分鐘還原1 μmol 2，6-二氯靛酚鈉所需的酶量定義為一個酶活單位。

以葡萄糖為底物，取100 μL 適當(dāng)稀釋的酶液，加入3 mL 顯色液（50 mmol/L 的磷酸鉀緩沖液，pH 7.0，0.03 mmol/L 的2，6-二氯靛酚鈉，1.6 mmol/L 的吩嗪硫酸甲酯，100 mmol/L 的葡萄糖溶液） 輕輕混勻，用重蒸水調(diào)零，37 ℃每隔1 分鐘記錄600 nm 處吸光值的變化，共記錄2～3 min[7]。

比酶活為每毫克蛋白質(zhì)具有的酶活力。 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度用考馬斯亮藍(lán)法測定[14]。

1.2.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳 SDS-PAGE 凝膠電泳采用5 g/dL 的濃縮膠與12 g/dL 的分離膠， 電泳緩沖液為pH 8.3 的Tris-Gly 緩沖液， 當(dāng)用電壓80 V 跑過濃縮膠，調(diào)節(jié)電壓至100 V，電泳后用考馬斯亮藍(lán)染色。 膠的具體配置操作方法參照SDS-PAGE試劑盒。

1.2.6 等電聚焦凝膠電泳 將蛋白質(zhì)樣品加入到加樣紙上， 將加樣紙排放在電極間的凝膠中央，恒壓60 V 電泳15 min，8 mA 恒流至電壓升至550 V，關(guān)閉電源，揭去加樣紙，然后恒壓550 V 電泳3 h，等電流降至接近零，停止電泳。 將膠在固定液中浸泡40 min，除去兩性電解質(zhì)（降低考馬斯亮藍(lán)對兩性電解質(zhì)的染色），用蒸餾水漂洗一次，然后用染色工作液染色。 膠使用GE 的預(yù)制膠。

1.2.7 葡萄糖脫氫酶酶學(xué)性質(zhì)分析 將純化得到的酶液取200 μL 進(jìn)行300~500 nm 范圍的全波長掃描， 再加入20 μL、1 mol/L 葡萄糖溶液反應(yīng)5 min，再進(jìn)行全波長掃描。

酶對不同糖類的催化差異： 分別選擇葡萄糖、麥芽糖、木糖、半乳糖、海藻糖、果糖、山梨醇、蔗糖作為底物，加入0.1 U/mL 的酶液100 μL，以葡萄糖為底物測得的酶活為100%， 計算其它底物的相對酶活。

酶動力學(xué)參數(shù)測定：配置0.2～4 mmol/L 不同濃度的葡萄糖、麥芽糖、木糖溶液為底物，測定不同底物濃度下酶的活力，計算相應(yīng)的反應(yīng)速度。 用雙倒數(shù)作圖法（Lineweaver-Burk）作圖，以1/[S]為橫坐標(biāo)，1/V為縱坐標(biāo)，求得Km與kcat。

最適反應(yīng)pH：在pH 5.0～9.0 條件下，于37 ℃測定酶活， 以酶活最高者為100%， 計算其相對活性，確定最適反應(yīng)pH。

pH 穩(wěn)定性： 將純酶置于pH 5.0～9.0 不同緩沖液中，25 ℃下放置16 h，測定其剩余酶活力。

最適反應(yīng)溫度：以葡萄糖為底物，在pH 7.0 緩沖液中， 于不同溫度（30、37、40、45、50、55、60、65、70、75、80 ℃）測定酶活，以酶活最高者為100%，計算其相對酶活，確定其最適反應(yīng)溫度。

溫度穩(wěn)定性：以葡萄糖為底物，在pH 7.0 緩沖液中，于不同溫度（30、37、40、45、50、55、60、65、70、75、80 ℃）放置30 min 后，測定殘余酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 7.5 L 罐發(fā)酵培養(yǎng)

相比真菌來源的FAD-GDH 在E.coli中可溶性表達(dá)困難，常常需要與分子伴侶系統(tǒng)共表達(dá)，細(xì)菌來源的外源基因在E.coli可實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)， 且產(chǎn)量可進(jìn)一步通過發(fā)酵優(yōu)化提升。

IPTG 由于價格昂貴且存在潛在的化學(xué)毒性，限制了其在工業(yè)上的應(yīng)用。 乳糖作為天然的誘導(dǎo)劑無污染， 價格便宜， 誘導(dǎo)強(qiáng)度相比IPTG 較小，可以減少包涵體產(chǎn)生，同時作為碳源還能促進(jìn)菌體生長[13-14]。 作者選取乳糖作為誘導(dǎo)劑， 通過分批補(bǔ)料提高菌體濃度，再通過分階段溫度控制促進(jìn)蛋白質(zhì)表達(dá)[15]。

圖1 為7.5 L 發(fā)酵罐培養(yǎng)。 發(fā)酵過程分為3 個階段：第一階段初始的營養(yǎng)物質(zhì)大約在10 h 左右消耗完，此時溶氧上升。 第二階段的補(bǔ)料開始，恒速0.04 L/h 流加補(bǔ)料培養(yǎng)基。在這一階段400 mL 補(bǔ)料培養(yǎng)基大約10 h 內(nèi)被消耗。將溫度調(diào)到30 ℃，恒速0.015 L/h 流加乳糖誘導(dǎo)開始第三階段，乳糖終質(zhì)量濃度10 g/L。 酶活達(dá)到1 341 U/L，菌體量達(dá)12.4 g/L。

圖1 7.5 L 罐發(fā)酵培養(yǎng)Fig. 1 7.5 L tank fermentation culture

2.2 酶的分離純化

通過鎳柱、脫鹽柱、陰離子交換柱三步層析對粗酶液進(jìn)行分離純化。

重組酶的C 末端帶有組氨酸標(biāo)簽， 見圖2（a）。先經(jīng)過鎳柱純化，去掉絕大多數(shù)的雜蛋白質(zhì)，對目的蛋白質(zhì)起到很好的濃縮效果，將這一步得到的酶液過脫鹽柱去除多余的鹽離子， 見圖2 （b）。 再經(jīng)DEAE 陰離子交換柱，見圖2（c）。 紫外吸收峰較為明顯，通過三步層析，獲得純化倍數(shù)為40、總回收率為40%的酶，分離純化結(jié)果見表1。利用SDS-PAGE檢驗(yàn)最終所得的蛋白質(zhì)純度，圖2（d）顯示最終樣品呈現(xiàn)單一條帶，說明該酶達(dá)到電泳純。

DEAE 純化時要求酶緩沖液的pH 高于酶的等電點(diǎn)，同時要求緩沖液鹽離子濃度較低。 DNAMAN軟件預(yù)測FAD-GDH 的等電點(diǎn)為6.71。 鎳柱層析時使用的是pH 7.0 的磷酸鉀緩沖液，經(jīng)過脫鹽柱層析緩沖液置換成pH 8.2 的Tris 緩沖液。DEAE 高鹽洗脫及較高的緩沖液pH 條件可能抑制部分酶活性，這可能是造成該酶經(jīng)過DEAE 純化后比酶活及純化倍數(shù)沒有很大提升的原因。

圖2 FAD-GDH AKTA avant 層析圖譜及重組蛋白質(zhì)純化的SDS-PAGE 鑒定Fig. 2 Chromatogram of FAD-GDH by AKTA avant and SDS-PAGE analysis on purified protein

表1 蛋白質(zhì)的純化Table 1 Purification of protein

2.3 輔基FAD 的檢測

全波長掃描結(jié)果見圖3。 可以看出，F(xiàn)AD-GDH溶液在385 nm 和454 nm 左右有2 個特征吸收峰（實(shí)線），是由酶的FAD 輔基造成的，當(dāng)加入足量的底物葡萄糖溶液，F(xiàn)AD 被還原成FADH2， 吸收峰消失（虛線），這些結(jié)果證明該葡萄糖脫氫酶的輔基是FAD。重組酶的氨基酸序列中含有一段FAD 結(jié)合位點(diǎn)的甘氨酸保守序列（GXGXXG），由此推測FAD 與酶非共價鍵結(jié)合。

圖3 全波長掃描FAD-GDH 酶液Fig. 3 Whole-weight screen of FAD-GDH solution

2.4 酶學(xué)性質(zhì)研究

2.4.1 酶的等電點(diǎn) 等電聚焦電泳見圖4。 結(jié)果顯示酶的等電點(diǎn)5.3，DNAMAN 軟件預(yù)測的等電點(diǎn)為6.71，表明該酶的等電點(diǎn)偏酸性。對等電點(diǎn)的精確測量有助于提高分離純化的效率及酶的穩(wěn)定性。

圖4 等電聚焦電泳圖Fig. 4 Isoelectric focusing electrophoresis pattern

2.4.2 酶對不同底物的催化差異 為了研究酶對不同底物的催化差異，測定了酶對不同底物相對酶活及動力學(xué)參數(shù)。

對異源表達(dá)的FAD-GDH， 以不同糖類為底物測定相對酶活，結(jié)果見表2。除對葡萄糖外僅對麥芽糖具有較高的催化活性，可能是由于麥芽糖由兩分子葡萄糖中間以α-1，6 糖苷鍵連接，水解產(chǎn)物為葡萄糖，對其他糖的催化活性較低，對果糖、山梨醇、蔗糖沒有催化活性， 較好的葡萄糖催化特性使得FAD-GDH 有較好的工業(yè)化應(yīng)用前景。

表2 FAD-GDH 對不同糖類的催化差異Table 2 Catalytic differences by FAD- GDH to different sugars

Km是酶的一個特征常數(shù)， 在一定反應(yīng)條件下Km的大小與酶的濃度無關(guān)，只與酶的性質(zhì)有關(guān)。 使用稀釋成不同濃度的不同糖為底物進(jìn)行酶活測定，得到的雙倒數(shù)曲線見圖5 和表3。 以葡萄糖為底物時，經(jīng)米氏方程計算得到Km為2.56 mmol/L，相比麥芽糖和木糖，半乳糖的Km最小，其對葡萄糖的親和力最高。 以葡萄糖為底物時，最大反應(yīng)速度Vmax為500 mmol/（L·s），kcat/Km為3 487.7 L/（mmol·s）。

圖5 FAD- GDH 催化不同糖的Lineweaver-Burk 關(guān)系Fig. 5 Lineweaver-Burk graph of FAD-GDH catalyze different sugars

表3 以不同糖為底物FAD-GDH 動力學(xué)參數(shù)Table 3 FAD-GDH kinetic parameters with different sugars as substrate

圖6 酶的pH 穩(wěn)定性及最適反應(yīng)pHFig. 6 pH stability of the enzyme and the optimum reaction pH

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2.4.3 酶pH 穩(wěn)定性 反應(yīng)體系的pH 會影響酶構(gòu)象的穩(wěn)定性，也會影響酶活性中心必需基團(tuán)及底物的解離狀態(tài)，進(jìn)而影響酶的催化效果。 由圖6 可知，酶的最適反應(yīng)pH 為7.0， 重組酶在pH 為5.5～8.0時，具有較好的穩(wěn)定性。 當(dāng)pH 大于8.0 時酶活力迅速下降。 2.2 中蛋白質(zhì)純化過程中DEAE 陰離子交換層析使用的是pH 8.2 的Tris 緩沖液，過堿的條件可能抑制了酶的活性，所以純化后比酶活及純化倍數(shù)沒有很大提升。

2.4.4 酶溫度穩(wěn)定性 溫度升高導(dǎo)致溶液的擴(kuò)散作用加劇， 一定程度上促使底物與酶分子的碰撞，使得反應(yīng)速率加快。 溫度的上升也會改變酶分子的構(gòu)象，從而影響酶的催化效率。 溫度過高使酶分子的結(jié)構(gòu)被破壞，最終失去催化活性。 圖7 顯示，酶的最適反應(yīng)溫度在70 ℃，55 ℃以內(nèi)穩(wěn)定。 同時通過DSC 測定該酶的Tm值為77 ℃，該重組酶的熱穩(wěn)定性較好。

圖7 酶的溫度穩(wěn)定性及最適反應(yīng)溫度Fig. 7 Temperature stability of the enzyme and the optimum reaction

3 結(jié) 語

作者利用乳糖誘導(dǎo)改善來源于Burkholderia cepacia葡萄糖脫氫酶表達(dá)水平，利用乳糖作為誘導(dǎo)劑在7.5 L 發(fā)酵罐放大，通過分批補(bǔ)料、分階段溫度控制，酶活達(dá)到1 341 U/L，菌體量達(dá)12.4 g/L。 酶活及菌體量可通過發(fā)酵優(yōu)化進(jìn)一步提升。

將重組菌破碎得到的粗酶液利用鎳柱、 脫鹽柱、陰離子交換柱三步層析，最終獲得純化倍數(shù)40、比酶活109 U/mg 的酶， 這一系列方法達(dá)到較好的純化效果。 SDS-PAGE 凝膠電泳顯示，重組蛋白質(zhì)純化后達(dá)到電泳純，相對分子質(zhì)量約60 000，與理論值相符。 等電聚焦電泳顯示，該酶的等電點(diǎn)為5.3，與DNAMAN 軟件預(yù)測的6.71 相比更加精確。 酶標(biāo)儀全波長掃描吸收光譜表明， 該酶的輔基為FAD，通過保守位點(diǎn)（GXGXXG）推測輔基與酶非共價鍵結(jié)合。

酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，該酶對葡萄糖的親和力最高，Km為2.56 mmol/L，與報道的2.8 mmol/L[18]有所差異， 可能是因?yàn)槲墨I(xiàn)中所用的表達(dá)宿主為E.coliDH5α，質(zhì)粒為pUC18，與本研究中存在差異。 最大反應(yīng)速度Vmax為500 mmol/（L·s），kcat/Km為3 487.7 L/（mmol·s）。 在pH 5.5～8.0 內(nèi)穩(wěn)定，最適反應(yīng)pH 在7.0， 當(dāng)pH 大于8.0 時酶活力迅速下降，55 ℃穩(wěn)定，差式掃描量熱分析（DSC）測得Tm值為77 ℃。

上述研究表明，該酶穩(wěn)定性較好，催化效率高且不存在糖基化修飾， 適用于高靈敏度電極的開發(fā)，該細(xì)菌源葡萄糖脫氫酶具有替代市場上葡萄糖氧化酶的潛力。 本研究為該酶的進(jìn)一步工業(yè)化應(yīng)用提供參考與借鑒。