響應(yīng)面法優(yōu)化膠紅酵母伴生的維生素C 混菌發(fā)酵培養(yǎng)基

廖 林， 呂淑霞， 張?jiān)弃Q， 姚 碩， 張 良， 馬 鏑， 林 英， 于曉丹

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng)110866）

維生素C（VC）是一種重要的人體必需維生素，在醫(yī)藥、食品、飼料、化妝品等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。 混菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化L-山梨糖為2-酮基-L-古龍酸（2-KGA）是二步發(fā)酵法[1]生產(chǎn)VC 工藝的核心過(guò)程。早期報(bào)道的VC 混菌發(fā)酵體系是由氧化葡萄糖酸桿菌（G.oxydans）和條紋假單胞桿菌（P. striata）組成[2]。 其中，氧化葡萄糖酸桿菌為產(chǎn)酸菌， 條紋假單胞桿菌為伴生菌。Urbance 等[3]對(duì)產(chǎn)酸菌進(jìn)行表型和基因型分析后，將其歸類為一個(gè)新的Ketogulonigenium屬，vulgare種，即普通生酮基古龍酸桿菌（K. vulgare，K.v）。 目前，工業(yè)上生產(chǎn)VC 常用的伴生菌主要為原核微生物中的芽孢桿菌屬，如巨大芽孢桿菌（B. megaterium）、蘇云金芽孢桿菌（B. thuringiensis）和蠟樣芽孢桿菌（B. cereus）[4]等，而用真核微生物作為伴生菌卻鮮有報(bào)道。 作者所在實(shí)驗(yàn)室篩選到1 株能高效促進(jìn)K. vulgare產(chǎn)2-KGA 的真核微生物——膠紅酵母（R.mucilaginosa）。 由于現(xiàn)有的發(fā)酵培養(yǎng)基是以某些芽孢桿菌作為伴生菌，其營(yíng)養(yǎng)成分可能無(wú)法滿足膠紅酵母（R.m）與產(chǎn)酸菌（K.v）組成新菌系的生長(zhǎng)與產(chǎn)酸。 因此，作者采用響應(yīng)面法對(duì)現(xiàn)有VC 混菌發(fā)酵培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化，以充分發(fā)揮新菌系發(fā)酵潛力，最終提高2-KGA 的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料 土樣： 沈陽(yáng)東陵龍尾湖淤泥；菌種：普通生酮基古龍酸菌（K. vulgare），作者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 萬(wàn)分之一電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司；LDZX-30KBS 立式壓力蒸汽滅菌器： 上海申安醫(yī)療器械廠；HPS-160 生化培養(yǎng)箱： 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；HZQ-C 空氣浴振蕩器：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；BH-2 顯微鏡：OLYMPUS；ST2100 pH 計(jì)：奧豪斯儀器常州有限公司；JW-2017HR 高速冷凍離心機(jī)： 安徽嘉文儀器裝備有限公司；S1000TMThermal Cycler：BIO-RAD；Universal Hood Ⅱ凝膠成像系統(tǒng)：BIO-RAD；DL-CJ-2ND-Ⅱ潔凈工作臺(tái)：北京東聯(lián)哈爾濱儀器有限公司；JY600C 電泳儀： 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：L-山梨糖80，玉米漿15， 尿素12，KH2PO41，MgSO40.2，CaCO35；pH 6.7～7.0。

種子培養(yǎng)基（g/L）：L-山梨糖20，葡萄糖2，尿素1，玉米漿5，CaCO31；pH 6.7～7.0。

YPD 培養(yǎng)基：酵母膏1 g/dL，蛋白胨2 g/dL，葡萄糖2 g/dL。 制備固體培養(yǎng)基，加入2 g/dL 瓊脂粉。

培養(yǎng)基所用試劑均為分析純， 配制時(shí)均以1 mol/L NaOH （HCl） 調(diào)節(jié)pH 為6.7， 然后再加入CaCO3攪拌均勻，L-山梨糖單獨(dú)在121 ℃滅菌25 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 目標(biāo)伴生菌的富集培養(yǎng) 取約5 g 淤泥，放入盛有50 mL 無(wú)菌水的150 mL 三角瓶中， 振蕩30 min，將泥土上的微生物分散在無(wú)菌水中，4 ℃靜置1 h后，取100 μL 涂布在YPD固體平板培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫倒置培養(yǎng)2～3 d，從中挑選表面光滑的菌落（目標(biāo)伴生菌）， 于新的YPD 固體平板培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)， 從長(zhǎng)出的單菌落上挑取一環(huán)接種于裝有20 mL YPD 液體培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，180 r/min、28℃培養(yǎng)24 h，得到待選的目標(biāo)伴生菌的菌懸液。

1.2.2 目標(biāo)伴生菌與產(chǎn)酸菌的混合發(fā)酵培養(yǎng) 取2 mL經(jīng)種子培養(yǎng)基活化的產(chǎn)酸菌K. vulgare，接種于裝有20 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中， 同時(shí)接入0.5 mL 目標(biāo)伴生菌的菌懸液，180 r/min、28 ℃混菌發(fā)酵培養(yǎng)96 h 達(dá)到終點(diǎn)。

1.2.3 繪制目標(biāo)伴生菌的菌株生長(zhǎng)曲線 用YPD固體培養(yǎng)基對(duì)目標(biāo)伴生菌菌株進(jìn)行活化培養(yǎng)24 h后，10%接種于20 mL YPD 液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28 ℃、180 r/min 恒溫振蕩培養(yǎng)， 每3 小時(shí)取樣1 mL 培養(yǎng)液，4 000 r/min 離心5 min， 取沉淀，加1 mL 蒸餾水洗滌，4 000 r/min 離心5 min，取沉淀，加1 mL 蒸餾水混勻后，取樣稀釋，650 nm 波長(zhǎng)下測(cè)OD 值，以蒸餾水為對(duì)照。 另以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD650值為縱坐標(biāo)，繪制目標(biāo)伴生菌菌株生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 2-酮基-L-古龍酸測(cè)定 采用碘量法測(cè)定[6]。

1.2.5 菌株初步鑒定 目標(biāo)伴生菌的初步鑒定主要對(duì)照真菌鑒定手冊(cè)[7]，依據(jù)菌株的菌落形態(tài)和個(gè)體形態(tài)特征進(jìn)行歸類與鑒定。

1.2.6 菌株分子鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定是傳統(tǒng)的方法，為確保鑒定的準(zhǔn)確性， 需結(jié)合分子鑒定。 利用ITS（Internal Transcribed Spacer） 序列進(jìn)行菌種鑒定是目前較多采用的方法。 ITS 序列位于rRNA 編碼基因18 S、5.8 S 和28 S 之間的小基因片段，具有高拷貝數(shù)， 整個(gè)序列的長(zhǎng)度范圍在600～800 bp， 利用rDNA 通用引物能夠很容易被擴(kuò)增出來(lái)。因此，rDNA在微生物的鑒定應(yīng)用中，具有檢測(cè)微生物種水平的多態(tài)性特征。

取目標(biāo)伴生菌的菌懸液，按照文獻(xiàn)[8]的方法提取基因組DNA。 PCR 引物為ITS4/ITS5，ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；ITS5：5’-GGAAG TAAAAGTCGTAACAAGG-3’ 由上海生工生物工程有限公司合成。PCR 擴(kuò)增DNA，反應(yīng)體系為20 μL：MIX 混合液10 μL，引物各1 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 6 μL。 PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性35 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存?；厥誔CR 產(chǎn)物并測(cè)序，以BLAST 程序進(jìn)行DNA 序列比對(duì)。

1.2.7 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1）單因素試驗(yàn)：以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中各個(gè)成分為試驗(yàn)因素，通過(guò)固定其它成分因素不變，每次只研究一個(gè)變化因素來(lái)進(jìn)行單因素試驗(yàn)。 以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中各個(gè)成分的不同添加量為試驗(yàn)水平， 以2-KGA產(chǎn)量為試驗(yàn)指標(biāo)，設(shè)計(jì)得到6 因素5 水平的因素水平表，見(jiàn)表1。

表1 單因素試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels in single factor test

2）響應(yīng)面試驗(yàn)：在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，借助Design Expert 8.0.6 軟件，采用Box-Behnken Design（BBD）[9-10]設(shè)計(jì)原理，選取L-山梨糖、尿素、玉米漿、CaCO3、MgSO4、KH2PO4添 加 量 為 試 驗(yàn) 因 素， 以2-KGA 產(chǎn)量為指標(biāo)，進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到6 因素3水平編碼表，見(jiàn)表2。

表2 試驗(yàn)因素水平及編碼Table 2 Factors, levels and codes of response surface tests

3）響應(yīng)面模型驗(yàn)證試驗(yàn)：以響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化后的培養(yǎng)基條件進(jìn)行VC 混菌發(fā)酵，重復(fù)3 次，所得平均值與系統(tǒng)預(yù)測(cè)值越接近則模型越可靠。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的形態(tài)特征

按照1.2.1 中的方法， 篩選得到一株能夠作為K. vulgare伴生菌的菌株，將其命名為A8，以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

分離純化后得到的菌株A8， 在YPD 固體平板培養(yǎng)基上劃線和涂布培養(yǎng)3 d。 通過(guò)菌落形態(tài)特征可知，菌株A8 呈粉紅色，菌落直徑大小為4～6 mm，邊沿整齊，表面光滑、濕潤(rùn)、發(fā)亮、呈奶酪狀，生長(zhǎng)較快，質(zhì)地細(xì)膩柔軟，見(jiàn)圖1。在顯微鏡下觀察菌株A8 的細(xì)胞呈橢圓形，以出芽方式進(jìn)行無(wú)性繁殖，見(jiàn)圖2。 經(jīng)形態(tài)特征初步鑒定，菌株A8 屬于酵母菌類。

圖1 菌株A8 的菌落形態(tài)Fig. 1 Colony morphology of strain A8

圖2 菌株A8 的細(xì)胞形態(tài)Fig. 2 Cell morphology of strain A8

2.2 菌株的分子鑒定

為進(jìn)一步鑒定菌株A8，以其基因組DNA 為模板，利用真菌ITS rDNA 通用引物ITS4/ITS5 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，電泳檢測(cè)得到長(zhǎng)度約為750 bp 的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，見(jiàn)圖3。 從圖3 可知，DNA 的擴(kuò)增效果較好，符合常規(guī)的ITS rDNA 序列長(zhǎng)度，可以用來(lái)測(cè)序。

將擴(kuò)增的菌株A8 ITS rDNA 序列送至北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序，測(cè)序后去除載體及引物序列，共610 bp，正向序列結(jié)果為：

圖3 菌株A8 ITS rDNA 的PCR 產(chǎn)物電泳圖譜Fig. 3 Electrophoresis of PCR production of ITS rDNA from strain A8

CCG TAAACTACTGCGGAGACATTAGTGATAT AGGACGTCCAACTTAACTTGGAGTCCGAACTCTCA CTTTCTAACCCTGTGCACTTGTTTGGGATAGTAACT CTCGCAAGAGAGCGAACTCCTATTCACTTATAAAC ACAAAGTCTATGAATGTATTAAATTTTATAACAAA ATAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGC ATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAA TGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAAT C T TTGAACGCACCTTGCGCTCCATGGTATTCCGTGGA GCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAATACTTCAACCC TCCTCTTTCTTAATGATTGAAGAGGTGTTTGGT TTC TGAGCGCTGCTGGCCTTTACGGTCTAGCTCGT TCG TAATGCATTAGCATCCGCAATCGAACTTCGGATTG ACTTGGCGTAATAGACTATTCGCTGAGGAATTCTA GTCTTCGGATTAGAGCCGGGTTGGGTTAAAGGAA GC TTCTAATCAGAATGTCTACATTTTAAGATTAGA TCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAG CATATCAATAAGCGGAGGAA

最后將測(cè)定的序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析，結(jié)果顯示菌株A8 的基因序列與膠紅酵母菌（Rhodotorula mucilaginosa）同源性為100%，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定，確定菌株A8 為膠紅酵母菌，命名為（Rhodotorula mucilaginosaA8，R. mucilaginosaA8）。進(jìn)一步查詢，該菌在通常情況下對(duì)動(dòng)物和人體不致病[11-13]。 另外，為了研究菌株A8 的發(fā)育系統(tǒng)在微生物種群中的地位，根據(jù)BLAST 比對(duì)結(jié)果，下載同源性99%以上序列， 采用MEGA 6.06 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖4。

2.3 菌株A8 的生長(zhǎng)特性

菌株A8 在28 ℃YPD 液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，最初的6 h 內(nèi)生長(zhǎng)比較緩慢， 屬于延滯期；6～18 h 其生長(zhǎng)量呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；18～48 h 處于穩(wěn)定階段， 此時(shí)菌株呈現(xiàn)波動(dòng)性增長(zhǎng)，48 h 時(shí)菌體生長(zhǎng)量達(dá)到最大值， 之后菌體生物量逐漸降低，進(jìn)入衰亡期，見(jiàn)圖5。

2.4 單因素試驗(yàn)結(jié)果

按照表1 進(jìn)行單因素試驗(yàn)， 得出了各試驗(yàn)因素成分添加量對(duì)2-KGA 產(chǎn)量的柱形圖。 再根據(jù)BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選擇在單因素試驗(yàn)中2-KGA 產(chǎn)量最優(yōu)的3 個(gè)水平值進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

圖4 基于菌株A8 ITS rDNA 序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 4 Phylogenetic trees based on the ITS rDNA sequences of strain A8

圖5 菌株R. mucilaginosa A8 的生長(zhǎng)曲線Fig. 5 Growth curve of strain of R. mucilaginosa A8

2.4.1 L-山梨糖添加量對(duì)2-KGA 產(chǎn)量的影響 L-山梨糖是混菌發(fā)酵生產(chǎn)VC 前體2-KGA 的原料。在工業(yè)生產(chǎn)中， 投糖量過(guò)低會(huì)造成其他資源的浪費(fèi)，而過(guò)高的糖質(zhì)量濃度又會(huì)抑制發(fā)酵菌系的細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)酸。 糖質(zhì)量濃度在100 g/L 時(shí)，2-KGA 產(chǎn)量最高，但與80 g/L 和90 g/L 的糖質(zhì)量濃度比較，其酸產(chǎn)量相差不大，見(jiàn)圖6。按照BBD 設(shè)計(jì)原理，選擇糖質(zhì)量濃度為80、90、100 g/L 共3 個(gè)水平進(jìn)行后續(xù)設(shè)計(jì)。

圖6 不同L-山梨糖添加量對(duì)新菌系K.v+R.m A8 產(chǎn)酸的影響Fig. 6 Effect of L- sorbitol concentration on 2-KGA production by a new mixed culture of K.v+R.m A8

2.4.2 尿素添加量對(duì)2-KGA 產(chǎn)量的影響 在微生物生長(zhǎng)過(guò)程中，尿素不僅作為氮源，而且也作為一種生理堿調(diào)節(jié)微生物生長(zhǎng)的pH 環(huán)境[14]。 在發(fā)酵終點(diǎn)，不同尿素添加量對(duì)2-KGA 產(chǎn)量影響較大，見(jiàn)圖7。按照BBD 設(shè)計(jì)原理， 選擇尿素質(zhì)量濃度為10、12、14 g/L 共3 個(gè)水平進(jìn)行后續(xù)設(shè)計(jì)。

2.4.3 玉米漿添加量對(duì)2-KGA 產(chǎn)量的影響 玉米漿中含有多種氨基酸等物質(zhì)供菌體生長(zhǎng)，是影響2-KGA 產(chǎn)量的重要因素之一[15]。 在發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)，玉米漿質(zhì)量濃度對(duì)2-KGA 產(chǎn)量沒(méi)有太大影響， 但是不同質(zhì)量濃度的添加量可以起到縮短發(fā)酵周期的作用，見(jiàn)圖8。 按照BBD 設(shè)計(jì)原理，選擇玉米漿質(zhì)量濃度為15、20、25 g/L 共3 個(gè)水平進(jìn)行后續(xù)設(shè)計(jì)。

圖7 不同尿素添加量對(duì)新菌系K.v+R.mA8 產(chǎn)酸的影響Fig. 7 Effect of urea addition amount on 2-KGA production by a new mixed culture of K.v + R.m A8

圖8 不同玉米漿添加量對(duì)新菌系K.v+R.m A8 產(chǎn)酸的影響Fig. 8 Effect of corn liquor amount on 2-KGA production by a new mixed culture of K.v+R.m A8

2.4.4 CaCO3添加量對(duì)2-KGA 產(chǎn)量的影響 在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加CaCO3的主要目的是為了緩沖發(fā)酵液中的酸，避免造成酸的反饋抑制作用。 不同的CaCO3添加量可以縮短發(fā)酵周期，見(jiàn)圖9。按照BBD設(shè)計(jì)原理，選擇CaCO3質(zhì)量濃度為1、3、5 g/L 共3 個(gè)水平進(jìn)行后續(xù)設(shè)計(jì)。

2.4.5 MgSO4添加量對(duì)2-KGA 產(chǎn)量的影響 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[6，16-17]，2-KGA 在還原酶的作用下生成L-艾杜糖酸， 而高質(zhì)量濃度的MgSO4可激活2-KGA 還原酶，使2-KGA 還原成L-艾杜糖酸，導(dǎo)致2-KGA 產(chǎn)量下降。 MgSO4質(zhì)量濃度為0.4 g/L 時(shí)，2-KGA 產(chǎn) 量最高，見(jiàn)圖10。 按照BBD 設(shè)計(jì)原理，選擇MgSO4質(zhì)量濃度為0.2、0.3、0.4 g/L 共3 個(gè)水平進(jìn)行后續(xù)設(shè)計(jì)。

圖9 不同CaCO3 添加量對(duì)新菌系K.v+R.m A8 產(chǎn)酸的影響Fig. 9 Effect of CaCO3 amount addition on 2-KGA production by a new mixed culture of K.v+R.m A8

圖10 不同MgSO4 添加量對(duì)新菌系K.v+R.m A8 產(chǎn)酸的影響Fig. 10 Effect of MgSO4 amount on 2-KGA production by a new mixed culture of K.v+R.m A8

2.4.6 KH2PO4添加量對(duì)2-KGA 產(chǎn)量的影響 KH2PO4是培養(yǎng)基中的常用成分， 磷和鉀促進(jìn)芽孢的形成，且K+能調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，保持酶活性，磷是核酸的重要組成元素， 同時(shí)對(duì)pH 值也有一定緩沖作用。在發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)，不同KH2PO4添加量對(duì)2-KGA 產(chǎn)量影響較大， 見(jiàn)圖11。 按照BBD 設(shè)計(jì)原理， 選擇KH2PO4質(zhì)量濃度為0.6、0.8、1.0 g/L 共3 個(gè)水平進(jìn)行后續(xù)設(shè)計(jì)。

圖11 不同KH2PO4 添加量對(duì)新菌系K.v+R.m A8產(chǎn)酸的影響Fig. 11 Effect of KH2PO4 amount on 2-KGA production by a new mixed culture of K.v+R.m A8

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

按照1.2.7 中方法， 采用BBD 原理對(duì)表2 中數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)， 得到要分兩批次進(jìn)行的54 組不同因素組合試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

對(duì)表3 中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)回歸分析，獲得2-KGA產(chǎn)量對(duì)6 個(gè)編碼自變量L-山梨糖（x1）、尿素（x2）、玉米漿（x3）、CaCO3（x4）、MgSO4（x5）、KH2PO4（x6）的二次多項(xiàng)回歸方程模型（1）：

表3 BBD 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Behnken Design

（續(xù)表3）

式中，Y：2-KGA 質(zhì)量濃度 （g/L）；x1：L-山梨糖質(zhì)量濃度（g/L）；x2：尿素質(zhì)量濃度（g/L）；x3：玉米漿質(zhì)量濃度（g/L）；x4：CaCO3質(zhì)量濃度（g/L）；x5：MgSO4質(zhì)量濃度（g/L）；x6：KH2PO4質(zhì)量濃度（g/L）。

2.5.1 回歸方程方差分析 對(duì)模型方程回歸系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

對(duì)模型方差分析結(jié)果表明，相關(guān)系數(shù)R2=0.954 6，校正系數(shù)R2Adj=0.905 5，本實(shí)驗(yàn)所選用模型（1）具有極度顯著性（P＜0.000 1），說(shuō)明該方程與實(shí)際情況擬合良好， 可以用該方程代替真實(shí)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分析。對(duì)回歸方程系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，x1、x2對(duì)產(chǎn)酸有極顯著影響（P＜0.001），x4、x22對(duì)產(chǎn)酸有高度顯著影響（P＜0.01），x12對(duì)產(chǎn)酸有顯著影響（P＜0.05），其他項(xiàng)系數(shù)均不顯著。 依據(jù)系數(shù)估計(jì)值，因素的主效應(yīng)關(guān)系為：x1=1.78，x2=8.28，x3=0.032，x4=1.15，x5=0.42，x6=0.62， 尿素＞L-山梨糖＞CaCO3＞KH2PO4＞MgSO4＞玉米漿。 在α=0.05 顯著水平下剔除不顯著項(xiàng)后，對(duì)模型（1）進(jìn)行優(yōu)化可得模型（2）：

表4 回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variance for the fitted regression equation with 2-KGA yield as a function

Y=58.71-1.78x1+8.28x2+1.15x4-0.96x1x2+0.79x1x4-0.096x2x4-1.46x12-2.29x22+0.096x32-0.74x42+0.74x52+0.62x62

式中，Y：2-KGA 質(zhì)量濃度 （g/L）；x1：L-山梨糖質(zhì)量濃度（g/L）；x2：尿素質(zhì)量濃度（g/L）；x3：玉米漿質(zhì)量濃度（g/L）；x4：CaCO3質(zhì)量濃度（g/L）；x5：MgSO4質(zhì)量濃度（g/L）；x6：KH2PO4質(zhì)量濃度（g/L）。

2.5.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化 根據(jù)BBD 模型探討各因素及其交互作用對(duì)2-KGA 產(chǎn)量的影響。 選取顯著性影響因素L-山梨糖、尿素、CaCO3為研究對(duì)象，得出兩因素交互作用對(duì)產(chǎn)酸影響的3D 曲面圖，見(jiàn)圖12。 可知，低水平和高水平的影響因素都不利于酸產(chǎn)量的提高， 其中尿素對(duì)酸產(chǎn)量的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡。在各因素中，尿素與L-山梨糖的交互作用最為顯著，從變化速率來(lái)看，尿素組分的主效應(yīng)大于L-山梨糖。由此可知，在試驗(yàn)水平內(nèi)，適當(dāng)?shù)脑黾幽蛩靥砑恿坑欣谒岙a(chǎn)量的提高。

2.5.3 響應(yīng)面模型驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 為了檢驗(yàn)響應(yīng)面模型預(yù)測(cè)值的準(zhǔn)確性，利用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基條件（L-山梨糖80 g/L、尿素14 g/L、玉米漿15 g/L、CaCO31.58 g/L、MgSO40.3 g/L、KH2PO41.0 g/L） 進(jìn)行3 組平行試驗(yàn)，產(chǎn)酸量分別為69.85、70.27、70.12 g/L，平均值為70.08 g/L， 與模型預(yù)測(cè)值70.38 g/L 基本一致，說(shuō)明試驗(yàn)所用模型能夠較好地預(yù)測(cè)實(shí)際發(fā)酵產(chǎn)酸情況。

3 結(jié) 語(yǔ)

圖12 兩因素交互作用對(duì)2-KGA 產(chǎn)量的影響Fig. 12 Effect of cross-interaction between two factors on 2-KGA production

經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定，確定新篩選出的伴生菌株A8 為膠紅酵母（R. mucilaginosa）。 菌株A8在最初的6 h 內(nèi)生長(zhǎng)處于延滯期；6～18 h 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；18～48 h 處于穩(wěn)定期，48 h 之后進(jìn)入衰亡期。 通過(guò)單因素試驗(yàn)優(yōu)化、響應(yīng)面法分析以及試驗(yàn)驗(yàn)證，得出新菌系發(fā)酵培養(yǎng)基為：L-山梨糖80 g/L、尿素14 g/L、 玉米漿15 g/L、CaCO31.58 g/L、MgSO40.3 g/L、KH2PO41.0 g/L。 利用優(yōu)化后的培養(yǎng)基對(duì)新菌系進(jìn)行VC混菌發(fā)酵，2-KGA 產(chǎn)量為70.08 g/L， 轉(zhuǎn)化率達(dá)81.3%，顯著高于工業(yè)生產(chǎn)菌系G. oxydans+B. megaterium2980 的產(chǎn)酸質(zhì)量濃度55.38 g/L[17]。 在二步發(fā)酵法研究初期， 從L-山梨糖到2-KGA 的轉(zhuǎn)化率僅為39.7%[18]。 仲崇斌等[19]以擲孢酵母作為伴生菌與氧化葡萄糖酸桿菌組成新混菌體系， 轉(zhuǎn)化率達(dá)66.81%。徐婷婷等[20]以短小芽胞桿菌HJ-04 為伴生菌進(jìn)行混菌產(chǎn)酸研究，在發(fā)酵終點(diǎn)48 h 時(shí)，產(chǎn)酸質(zhì)量濃度達(dá)76.9 mg/mL（糖質(zhì)量濃度94.95 mg/mL），轉(zhuǎn)化率約為75.2%。 呂淑霞等[18]以枯草芽孢桿菌A9 為伴生菌進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酸研究時(shí)， 糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到了94%左右。郭禮強(qiáng)等[21]利用紫外線（UV）、亞硝基胍（NTG）及兩者的復(fù)合誘變方法選育得到一株蘇云金芽孢桿菌UN-366，轉(zhuǎn)化率達(dá)到89.2%。在促K. vulgare產(chǎn)酸能力及轉(zhuǎn)化率方面， 膠紅酵母A8 顯著高于B.megaterium2980、 擲孢酵母以及短小芽胞桿菌HJ-04，而與枯草芽孢桿菌A9 比較則較弱，因此，接下來(lái)應(yīng)著手于膠紅酵母A8 和枯草芽孢桿菌A9 的對(duì)比研究，找出真核微生物和原核微生物促產(chǎn)酸能力差異的原因。 另外， 經(jīng)誘變后的蘇云金芽孢桿菌UN-366 能使轉(zhuǎn)化率達(dá)到89.2%， 后續(xù)可以借鑒此方法來(lái)對(duì)膠紅酵母A8 進(jìn)行誘變處理， 以更進(jìn)一步提升其促進(jìn)K. vulgare產(chǎn)酸的能力。 最后伴生菌株膠紅酵母A8 在通常情況下對(duì)動(dòng)物和人體不致病，可以與K. vulgare組成新菌系，用于工業(yè)生產(chǎn)。