食管康對反流性食管炎模型大鼠呼吸鏈Complex Ⅰ、Ⅳ活性影響的實(shí)驗(yàn)研究

胡蓆寶，田晶晶，袁紅霞

胃食管反流?。℅ERD）是指胃酸和（或）胃內(nèi)容物反流到食管、口腔甚至呼吸道引起的一系列癥狀及并發(fā)癥[1]。反流性食管炎（RE）屬于GERD范疇，是一種常見的慢性消化系統(tǒng)疾病，是指胃和（或）十二指腸的內(nèi)容物反流到食管，引起食管黏膜出現(xiàn)炎癥改變、點(diǎn)片狀糜爛，甚至形成潰瘍。RE的主要臨床癥狀表現(xiàn)為胸骨后燒灼感、燒心、反酸等癥狀。近年來，伴隨著人們生活方式、飲食結(jié)構(gòu)的改變，RE的發(fā)病率逐年上升[2-3]。西藥治療RE的藥物包括PPI、黏膜保護(hù)劑及促胃動力藥等，可以短期控制RE癥狀，但是長期效果不明顯，而且不能從根本上解決問題，存在著復(fù)發(fā)率高等弊端[4-5]。

目前，多數(shù)中醫(yī)臨床學(xué)者采用不同方劑辨證論治RE，均取得了比較滿意療效，線粒體(脾)是機(jī)體細(xì)胞正常運(yùn)行的“氣血生化之源”，在機(jī)體炎癥調(diào)控中發(fā)揮核心作用，改善線粒體功能對于炎癥相關(guān)疾病的治療具有重要意義，呼吸鏈complex Ⅰ和complex Ⅳ在線粒體能量代謝和維持線粒體結(jié)構(gòu)、功能過程中具有非常重要的作用。本實(shí)驗(yàn)擬通過觀察中藥食管康顆粒對RE模型大鼠食管黏膜線粒體呼吸鏈complex Ⅰ和complex Ⅳ活性的表達(dá)情況，探討食管康治療RE的作用機(jī)制，從線粒體代謝角度為RE的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 64只健康的雄性Wistar大鼠購于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0002，常規(guī)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)室紫外線照射消毒，飼養(yǎng)籠過氧乙酸消毒，保持室內(nèi)相對恒溫，濕度控制在50%～60%，每日自由飲用自來水，進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)的顆粒食物。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 （1）食管康組：旋覆花15 g，代赭石5 g，炙甘草10 g，人參10 g，半夏10 g，延胡索15 g，黃連18 g，吳茱萸3 g等。以上藥味采用中藥配方顆粒(江陰市天江藥業(yè)有限公司)加熱水（水溫100 ℃）約200 mL充分?jǐn)嚢琛Ｖ兴幩幉娜坑商旖蚴心祥_醫(yī)院提供，根據(jù)人與動物的體表面積進(jìn)行換算，并煎制成1 g/mL生藥的溶液，根據(jù)人與動物給藥劑量換算，大鼠每日給藥劑量為生藥10 g/kg。（2）西藥對照組：蘭索拉唑腸溶片聯(lián)合枸櫞酸莫沙必利分散片，研為細(xì)粉末后，配制濃度為0.15 mg/mL的混懸液備用。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑與器械 電子天平，購自德國Sartorius公司，型號：Cubis? MSA224S-000-DA；電熱恒溫水浴槽，型號：HWS-24；-80 ℃低溫冰箱，型號：MDF-C8V(N)；4 ℃低溫冰箱，型號：HXC-106；脫色搖床，型號TS-100；電泳儀，型號BG-subMIDI；低溫離心機(jī)，購自德國Sigma，型號3-30K；SDS-PAGE，凝膠成像系統(tǒng)UVP，型號GelDoc-It310；ChemiDoc MP化學(xué)發(fā)光成像系 統(tǒng) Bio-rad， 型 號 170-8280。Anti-complexⅠ一抗和Anti-complex Ⅳ一抗購于Invitrogen公司，β-actin購自杭州華安生物技術(shù)有限公司，二抗羊抗鼠和羊抗兔IgG購自圣克魯斯生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將64只大鼠隨機(jī)分為4組：正常對照組、模型組、西藥治療組和食管康組，每組16只。采用改良后的“食管-十二指腸端側(cè)吻合術(shù)”方法造模[6]，應(yīng)用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射，麻醉后將造模大鼠固定在手術(shù)板上，備皮消毒后，取上腹部正中的劍突下約0.5 cm處，縱行切開皮膚約2 cm，然后沿腹白線剪開肌層和腹膜，將胃提出，剪斷肝胃韌帶，顯露食管，分離食管下段迷走神經(jīng)及血管，絲線結(jié)扎賁門，固定食管，預(yù)防食管回縮，從賁門上0.3 cm處切斷食管；縫合賁門并荷包包埋入胃中，保留全胃；在距幽門1 cm處側(cè)壁避開血管縱行切開十二指腸壁約0.5 cm；隨后將食管下端全層與十二指腸切口行端側(cè)吻合（6/0帶線縫合針縫合），前后左右四壁四針縫合即可，縫合之后盡量輕輕將胃、食管、十二指腸按原位置回納，以避免感染及粘連；關(guān)腹前于腹腔內(nèi)注射鹽酸左氧氟沙星注射液（1.5 mg/kg，揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司），然后進(jìn)行分層縫合，迅速關(guān)腹，消毒皮膚。術(shù)后24 h禁食不禁水，術(shù)后3 d內(nèi)，每天每只大鼠腹腔注入鹽酸左氧氟沙星注射液1.5 mg/kg，且給予注射用葡萄糖鹽水飲用，此后常規(guī)喂養(yǎng)。將成模的動物隨機(jī)分為三組：模型組、食管康組及西藥組。

1.2.2 藥物干預(yù) 正常對照組16只大鼠與各治療組同日開始，用生理鹽水1 mL/100 g體重進(jìn)行灌胃，2次/d，與各治療組同時處死。模型對照組16只大鼠于造模后第6天用生理鹽水1 mL/100 g體重進(jìn)行灌胃，2次/d，與治療組同日處死。食管康組、西藥治療組2組，每組16只大鼠。于造模術(shù)第6天開始，用相應(yīng)藥液1 mL/100 g體重進(jìn)行灌胃，2次/d，治療14天后，處死各組動物，開始進(jìn)行指標(biāo)檢測。

1.2.3 處死及取材 動物禁食不禁水1天后處死，用10%的水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉，開腹后盡快取出食管縱切一分為二，一份放入10%福爾馬林液中送病理科，另一份稱重之后用生理鹽水沖洗，放入液氮中，置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.4 觀察指標(biāo)及指標(biāo)檢測方法 （1）食管黏膜的肉眼表現(xiàn)：各組大鼠麻醉之后，迅速進(jìn)行開腹，取自胃與食管交界上0.5 cm處向咽喉部方向截取長約1.5～2.0 cm的食管，用冰生理鹽水將食管腔漂洗后，肉眼觀察食管大體的表現(xiàn)，并進(jìn)行肉眼RE分級，之后迅速將食管組織放入10%福爾馬林固定液中，防止自溶；（2）病理形態(tài)學(xué)觀察：將固定好的食管組織送病理科制備食管組織石蠟切片進(jìn)行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察病理組織學(xué)分級（參考2004年由中華醫(yī)學(xué)會消化內(nèi)鏡分會頒布的《反流性食管炎診斷及治療指南》見表1、表2。）（3）食管組織complex Ⅰ、Ⅳ活性的檢測：應(yīng)用Western blotting法測定標(biāo)本中大鼠食管組織complex Ⅰ、Ⅳ的活性，測定的過程按照試劑盒說明書進(jìn)行嚴(yán)格操作。

表1 反流性食管炎肉眼表現(xiàn)分級

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析；組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠死亡原因分析 正常組大鼠在實(shí)驗(yàn)過程中無死亡，造模組大鼠于處死前，48只大鼠共死亡8只，死亡率約為16.67%。其中2只死于彌漫性腹膜炎，2只死于吻合口狹窄，1只死于腸梗阻，3只死于吸入性肺炎。剩余大鼠各組為模型組12只，食管康組15只，西藥組13只。

2.2 食管黏膜肉眼的表現(xiàn) 正常組大鼠的食管黏膜光滑，無充血水腫表現(xiàn)；灌胃14天后，模型組大鼠食管下段黏膜水腫，顏色鮮紅，可見點(diǎn)片狀充血、糜爛，部分融合為潰瘍；食管康組大鼠食管黏膜結(jié)構(gòu)光滑，少數(shù)食管下段黏膜輕度充血水腫，未見糜爛及潰瘍；西藥組大鼠食管黏膜結(jié)構(gòu)相對完整，部分食管可見條索狀充血，少數(shù)可見條索狀糜爛，未見明顯潰瘍。各組大鼠RE肉眼分級分布及積分情況見表3。

2.3 食管黏膜光鏡下表現(xiàn) 正常組大鼠食管光鏡下黏膜層表面為完整的鱗狀上皮，其基底的細(xì)胞層有少許內(nèi)分泌細(xì)胞；模型組大鼠食管黏膜層有明顯的炎性細(xì)胞浸潤，局部黏膜糜爛；食管康組大鼠食管黏膜上皮恢復(fù)，炎性細(xì)胞明顯減少；西藥組大鼠食管黏膜可見炎細(xì)胞彌漫水腫，基層仍可見炎細(xì)胞浸潤，各組大鼠RE光鏡下分級分布及積分情況見表4，圖1～4。

表4 各組大鼠食管黏膜病理組織學(xué)分級

圖1 正常組大鼠食管黏膜（×400）

圖2 模型組大鼠食管黏膜（×400）

圖3 西藥組大鼠食管黏膜（×400）

圖4 食管康組大鼠食管黏膜（×400）

2.4 食管組織complexⅠ、Ⅳ活性的檢測 模型組大鼠食管組織complexⅠ、Ⅳ活性較正常組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），食管康組及西藥組大鼠食管組織complexⅠ、Ⅳ活性較模型組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），食管康組與西藥組比較，大鼠食管組織complexⅠ、Ⅳ活性表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表5，圖 4，5。

表5 complexⅠ、Ⅳ灰度值參數(shù)與內(nèi)參β-actin灰度值參數(shù)比值

圖4 各組大鼠食管組織complexⅠ、Ⅳ活性表達(dá)情況

圖5 各組大鼠食管組織complexⅠ、Ⅳ活性表達(dá)情況

3 討論

中醫(yī)學(xué)并無RE的病名，根據(jù)該病的主癥及臨床表現(xiàn)歸于中醫(yī)“反胃”“吐酸”“嘔吐”“噎膈”等范疇。RE的病位主要在食管，與肝、脾、胃等關(guān)系密切，基本的病機(jī)為脾胃虛弱，而病機(jī)之關(guān)鍵則為中焦氣機(jī)升降的失常。課題組成員提出“脾胃虛弱”為RE的發(fā)病之本，病機(jī)關(guān)鍵為“肝胃不和，胃氣上逆”，情志不暢、飲食不節(jié)、勞倦或久病等致脾胃虛弱，肝在五行屬木,主動,主升，主疏泄，肝為血之藏,司情志，喜條達(dá)、惡抑郁。若脾胃虛弱，肝木偏亢而克制脾土，即“土虛木乘”，而致中焦氣機(jī)升降失常，脾胃運(yùn)化功能失職，氣機(jī)郁結(jié)，肝氣夾胃濁上逆,出現(xiàn)肝胃不和，胃氣上逆，發(fā)生RE。故臨證中食管康顆粒治療各種類型的RE療效顯著[7-8]。

食管康顆粒是在《傷寒論》中經(jīng)方“旋覆代赭湯”的基礎(chǔ)上加左金丸，芍藥甘草湯，再佐以延胡索，郁金，丹參而成，其方證要點(diǎn)為脾胃虛弱，肝胃不和，胃氣上逆。旋覆花降氣化痰，降逆止嘔，其質(zhì)輕而氣主下，可降胃氣無傷脾礙胃之弊，并有疏肝中郁結(jié)之功；代赭石功善降逆止嘔，下氣降痰，該藥重鎮(zhèn)降逆可療胃氣不降，開胸膈，墜痰涎治喘息，平肝降胃鎮(zhèn)沖，治沖氣上逆，與旋覆花合用，佐助降逆化痰止嘔之效，降逆化痰，益氣和胃；半夏辛開，燥功善降逆和胃止嘔，燥濕化痰；黃連清胃熱，瀉肝火；吳茱萸疏肝和胃，降逆止嘔，二者為《丹溪心法》中之左金丸，辛開苦降，肝胃同調(diào)，佐君藥增強(qiáng)清肝和胃之功，共為臣藥；白芍養(yǎng)肝血，益肝陰，緩急止痛；由于此病多病程較長，久病則入絡(luò)化瘀，加丹參活血止痛，郁金清熱疏肝，解郁除煩，共為佐藥；炙甘草健脾和胃，調(diào)和諸藥?？v觀全方，配伍嚴(yán)謹(jǐn)，協(xié)調(diào)升降，平調(diào)氣血，降中有升，升中有降，降中有補(bǔ)，標(biāo)本兼顧，諸藥配合，共成健脾益氣，疏肝和胃，達(dá)到重建中焦氣機(jī)的升降功能，使氣逆得除，臟腑和諧狀態(tài)得復(fù)。

線粒體是半自主性的細(xì)胞器，是機(jī)體細(xì)胞正常運(yùn)行的“動力工廠”，可以氧化分解全身的營養(yǎng)物質(zhì)（水谷精微），為全身細(xì)胞的生命活動提供重要的能量[9]，是機(jī)體細(xì)胞正常運(yùn)行的“氣血生化之源”,也就是說機(jī)體細(xì)胞的中醫(yī)之“脾”。與線粒體呼吸鏈的電子傳遞偶聯(lián)形成的跨線粒體內(nèi)膜質(zhì)子梯度是生命活動中腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）合成最主要的動力。線粒體是通過三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化的過程, 把營養(yǎng)物質(zhì)(水谷精微)氧化生成ATP(氣)，同時利用甘氨酸和琥珀酸單酰CoA，共同合成血紅素(“血”)，可見，線粒體(脾)是機(jī)體細(xì)胞正常運(yùn)行的“氣血生化之源”。

呼吸鏈位于線粒體內(nèi)膜上，糖、脂肪、蛋白質(zhì)在代謝過程中形成電子，通過線粒體呼吸鏈依次傳遞，最終產(chǎn)生ATP，為組織細(xì)胞提供能量。線粒體內(nèi)膜呼吸鏈復(fù)合體包括complexⅠ(NADH泛醌氧化還原酶)、complexⅡ(琥珀酸泛醌氧化還原酶)、complex Ⅲ(細(xì)胞色素C還原酶)、complexⅣ(細(xì)胞色素C氧化酶)、complexⅤ(ATP合成酶)及一系列的輔酶[10-11]，線粒體呼吸鏈復(fù)合物的活性濃度變化直接反映著線粒體呼吸功能的變化[12]，其可保護(hù)線粒體膜結(jié)構(gòu)的完整性，改善氧化磷酸化的功能，對維持機(jī)體正常的能量代謝有重要意義[13-14]。

呼吸鏈complex Ⅰ是線粒體呼吸鏈的首個門戶，在線粒體能量代謝過程中具有非常重要的作用，其在電子傳遞的過程中泵出偶聯(lián)質(zhì)子，形成了線粒體基質(zhì)和膜間隙的質(zhì)子梯度，從而可以促進(jìn)線粒體ATP的合成[15-16]。呼吸鏈complex Ⅳ位于呼吸鏈的末端，催化細(xì)胞色素氧化，亦可以促進(jìn)ATP的合成，其酶活性的發(fā)揮對維持線粒體結(jié)構(gòu)、功能有很重要的意義。研究證明[17]，脾虛組大鼠脾臟的線粒體complex（Ⅰ-Ⅳ）的活性均明顯低于正常組，證實(shí)脾虛證中脾臟組織的ATP合成能力出現(xiàn)障礙，考慮與其氧化磷酸化過程complex活性的改變有相關(guān)性。

綜上所述，RE模型組大鼠食管組織中complex Ⅰ、Ⅳ活性較正常組明顯降低，而經(jīng)過食管康顆粒健脾益氣，疏肝和胃治療后，達(dá)到重建中焦氣機(jī)的升降功能，使食管組織中complex Ⅰ、Ⅳ活性升高，提示食管康顆粒治療RE的機(jī)制，可能為增加機(jī)體組織線粒體呼吸鏈酶的活性，保持呼吸鏈的完整性，提高線粒體氧利用的能力和氧化磷酸化的功能，從而改善線粒體膜結(jié)構(gòu)的完整性，改善食管下括約肌的正常舒縮，減少反流的發(fā)生，從而達(dá)到治療RE的目的。