紅藤湯對(duì)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的保護(hù)作用及機(jī)制探究

劉麗華，曹澤偉

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種常見的慢性非特異性腸道疾病，主要臨床表現(xiàn)包括便血、腹痛和稀便等，且反復(fù)發(fā)作，容易癌變。近年UC發(fā)病率逐漸升高[1]，臨床主要應(yīng)用免疫抑制劑和激素類藥物治療，尚缺乏有效的治療手段[2]。中醫(yī)藥治療UC療效確切，副作用少，復(fù)發(fā)率低，顯示出了獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[3]。

根據(jù)UC各種的臨床表現(xiàn)，中醫(yī)可以把其歸屬于 “腸辟”和“痢疾”等范疇。病因主要包括臟腑功能失調(diào)，氣滯血瘀，大腸濕熱證、熱毒熾盛證，并涉及氣滯、瘀血、痰濁、寒濕、毒疫、伏毒、血熱等。主要辨證治療方法包括清熱解毒和活血化瘀[4]。紅藤湯加減方臨床治療UC效果顯著[5]，但其作用機(jī)理尚未明確，故本文將從抗炎和抗氧化二個(gè)方面對(duì)紅藤湯治療UC的作用及其機(jī)制進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 藥物制備 紅藤湯藥物組成：紅藤30 g，敗醬草30 g，蒲公英30 g，桃仁15 g，赤芍15 g，加8倍量水，煎煮2次，每次40 min，濾過(guò)，合并濾液，減壓濃縮至60 mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與模型制備 本實(shí)驗(yàn)選擇SPF級(jí)BALB/c雄性小鼠30只，6～8周，體重20～25 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)： SCXK( 京) 2016-0011，于室溫飼養(yǎng)一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采取隨機(jī)數(shù)字表法分為3組(n=10)：對(duì)照組（C組）；模型組（M組）和紅藤湯治療組（H組）。參照文獻(xiàn)方法[2]，M組和H組小鼠自由飲用4%葡聚糖硫酸鈉（DSS）水溶液建立UC模型， C 組自由飲水，連續(xù)飲用10天。自造模第1天開始，H組給予紅藤湯灌胃（15 mL/kg，1 次/d），連續(xù)給藥10天；C組和M組以相同方式給予生理鹽水。

1.3 標(biāo)本的采集及結(jié)腸組織病理評(píng)分 所有小鼠于造模后第11天麻醉，取血置于促凝管中，于4 ℃，3000 rpm離心15 min，分離血清，置-80 ℃冰箱冷凍保存。采血后處死小鼠，取出整個(gè)結(jié)腸段，肛門至盲腸末端，用剪刀沿著腸系膜剪開整個(gè)腸腔，放到4 ℃生理鹽水中，用棉簽去除腸內(nèi)容物，平鋪整個(gè)腸段于玻璃皿中，進(jìn)行大體觀察損傷情況，剪取各組小鼠結(jié)腸病變較明顯處的結(jié)腸組織，用4%的多聚甲醛溶液內(nèi)固定，脫水、包埋和切片，并進(jìn)行HE染色，用顯微鏡進(jìn)行拍照，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野（×200），按照表1的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織病理學(xué)損傷評(píng)分。另剪取各組部分的病變組織，-80℃冰箱保存，用于組織中細(xì)胞因子含量及蛋白表達(dá)的測(cè)定。

表1 組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.4 ELISA檢測(cè)血清中炎癥因子的含量 采取ELISA方法檢測(cè)血清中TNF-α和IL-6炎癥因子的濃度，按試劑盒說(shuō)明書操作，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm吸光度值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算出小鼠血清TNF-α 和IL-6的含量。

1.5 比色法檢測(cè)結(jié)腸組織MDA、SOD和GSHPx 取-80 ℃冰箱冷凍保存的結(jié)腸組織，制備10%的生理鹽水組織勻漿液。利用分光光度計(jì)按照試劑盒（南京建成生物工程研究所）說(shuō)明書操作，檢測(cè)結(jié)腸組織中MDA的含量及SOD和GSH-Px的活力。

1.6 Western blotting 檢測(cè)結(jié)腸組織中ERK1/2和JNK蛋白表達(dá)水平 取-80℃冰箱冷凍保存的結(jié)腸組織，利用蛋白提取試劑盒提取總蛋白，離心取上清后進(jìn)行蛋白定量和加熱變性，取80 μg蛋白進(jìn)行凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜，一抗（稀釋度1:1000）4℃冰箱過(guò)夜，TBST漂洗三遍后，加入二抗（稀釋度1:5000）室溫孵育1h，洗膜后加上化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行曝光，使用Quantity One凝膠成像儀進(jìn)行掃描和分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 18.0完成，所用數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紅藤湯對(duì)UC小鼠組織病理學(xué)的影響 大體觀察可見：C組小鼠結(jié)腸無(wú)損傷、出血、壞死和潰瘍癥狀；M組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度明顯縮短，黏膜有潰瘍形成；H組結(jié)腸長(zhǎng)度縮短減輕，充血，潰瘍程度較模型組有所改善。組織病理學(xué)損傷及評(píng)分如圖1所示： C組無(wú)組織病理學(xué)損傷；M組黏膜肌層明顯變薄，黏膜下層有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，組織病理學(xué)評(píng)分M組明顯升高（P＜0.01）；H組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，黏膜結(jié)構(gòu)完整，組織病理學(xué)損傷評(píng)分與M組對(duì)比顯著降低（P＜0.05）。

圖1 3組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)觀察和評(píng)分 (HE 染色，x 200)

2.2 紅藤湯對(duì)UC小鼠血清TNF-α和IL-6 含量的影響 如圖2 所示，與C組相比，M組小鼠血清中 TNF-α和IL-6含量顯著增加（P＜0.05）。與M組相比，H組小鼠血清中TNF-α和IL-6 含量顯著減少（P＜0.05）。

圖2 3組小鼠血清TNF-α和IL-6含量比較

2.3 紅藤湯對(duì)UC小鼠結(jié)腸組織MDA含量及SOD和GSH-Px活性的影響 如表2所示，與C組相比，M組小鼠結(jié)腸組織中MDA含量增加，SOD和GSH-Px活性降低（P＜0.05），與M組相比，H組小鼠結(jié)腸組織中MDA含量降低，SOD和GSH-Px活性升高（P＜0.05）。

2.4 紅藤湯對(duì)UC小鼠結(jié)腸組織JNK和ERK1/2表達(dá)的影響 如圖3所示，與C組相比，M組小鼠結(jié)腸組織中P-ERK1/2和P-JNK的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），與M組相比，H組小鼠結(jié)腸組織中P- ERK1/2和P-JNK的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。

圖3 3組小鼠結(jié)腸組織JNK和ERK1/2表達(dá)的變化

3 討論

采用4%DSS誘導(dǎo)小鼠UC模型，其病理學(xué)改變和臨床癥狀與人類相似，是目前最常用的方法[6]。本研究應(yīng)用DSS制作UC模型，造模后10天，小鼠體重出現(xiàn)不同程度的降低，并出現(xiàn)稀便和便血等癥狀。病理學(xué)可見結(jié)腸長(zhǎng)度明顯縮短，黏膜損傷及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增加，提示DDS誘導(dǎo)的UC模型成功。給予紅藤湯治療后，臨床癥狀和病理學(xué)改變都明顯減輕，證實(shí)紅藤湯對(duì)UC具有顯著的治療作用。

氧化應(yīng)激是引起結(jié)腸炎癥反應(yīng)的潛在致病因素，這一點(diǎn)已得到充分證實(shí)[7]。中性粒細(xì)胞產(chǎn)生大量的活性氧（ROS）造成黏膜組織蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA的氧化損傷。MDA是脂質(zhì)氧化的標(biāo)志物，高濃度的ROS可以攻擊和滅活SOD和GSHPx，以及其他抗氧化酶，阻止ROS的清除[8]。本研究發(fā)現(xiàn)紅藤湯有助于降低UC小鼠結(jié)腸組織中MDA含量，增加SOD和GSH-Px活性，提示紅藤湯通過(guò)抗氧化作用保護(hù)UC損傷。

雖然UC發(fā)病機(jī)制尚未闡明，但抗炎細(xì)胞因子（IL-10）與促炎細(xì)胞因子（IL-6和TNF-α）之間的不平衡在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[9]。研究報(bào)道DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎中促炎細(xì)胞因子IL-6和TNF-α水平都顯著升高，并參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和遷移及蛋白合成等信號(hào)通路[10-11]。TNF-α還能激活中性粒細(xì)胞，并導(dǎo)致腸黏膜的微循環(huán)障礙。IL-6活化STAT3信號(hào)通路，在UC發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[12]。本結(jié)果顯示，紅藤湯治療能降低UC小鼠血清中IL-6和TNF-α含量，提示紅藤湯還可通過(guò)抗炎作用保護(hù)UC損傷。

已有研究證實(shí)，JNK和EKR信號(hào)通路調(diào)控炎癥因子的表達(dá)和分泌[13]。抑制JNK和EKR信號(hào)分子的活化，可以顯著降低IL-6和TNF-α炎癥因子的分泌，減輕結(jié)腸損傷[14-15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DSS誘導(dǎo)的UC小鼠結(jié)腸組織中，JNK和ERK1/2蛋白的磷酸化水平都明顯高于正常組，提示JNK和ERK1/2信號(hào)通路被活化，參與了 UC的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。紅藤湯對(duì)UC 模型小鼠急性期JNK和ERK1/2信號(hào)通路都具有一定的抑制作用，這一結(jié)果提示紅藤湯的保護(hù)作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)JNK和ERK1/2信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，紅藤湯可以減輕結(jié)腸脂質(zhì)過(guò)氧化損傷、上調(diào)抗氧化酶及減少炎癥因子釋放，顯著改善UC小鼠結(jié)腸組織的病理?yè)p傷和臨床癥狀。其主要的作用機(jī)制可能與抑制JNK和ERK1/2信號(hào)通路有關(guān)。本研究為紅藤湯的藥理研究和臨床應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。