前列消癥湯對前列腺癌DU-145細胞凋亡及周期的影響

祁雷磊，張麗娟，周冰瑩，宋豎旗，盧建新，尹學來，龐 然

前列腺癌是男性常見的惡性腫瘤，嚴重威脅患者健康。在世界范圍內該病目前已經(jīng)位居男性惡性腫瘤的第二位，并成為腫瘤所造成的男性死亡原因的第六位[1-2]。在中國前列腺癌的發(fā)病率和死亡率近年來均呈顯著上升趨勢[3]。隨著藥物研發(fā)和治療理念的進展，對于前列腺癌目前具有許多新型藥物和豐富的治療手段。然而，無論是手術治療，放、化療，或是內分泌治療均存在一定的治療副反應，嚴重影響患者的生活質量[4-6]。中醫(yī)藥在腫瘤治療中具有重要角色，前列消癥湯為中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院劉猷枋教授治療轉移性前列腺癌的經(jīng)驗方，前期研究結果顯示，該方不僅能夠顯著改善晚期前列腺癌患者的生活質量，還能夠延緩去勢抵抗性前列腺患者的臨床進展[7-8]。現(xiàn)為進一步探索前列消癥湯治療前列腺癌的療效機制進行了以下研究。

1 材料與方法

1.1 細胞株 DU-145細胞，購于國家實驗細胞資源中心，北京協(xié)和醫(yī)學院基礎所（STR信息：Amelogenin：X；CSF1PO：11；D13S317：11；D16S539：11；D18S51：14，15；D19S433：14；D21S11：29，31.2；D2S1338：18，20；D3S1358：16；D5S818：13；D7S820：8）。

1.2 主要實驗試劑 凱基細胞DNA含量檢測試劑盒購自中國凱基生物科技發(fā)展有限公司、Annexin V-FITC/PI試劑盒購自美國BD公司、MTT購置美國Sigma公司、磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS）購自中國碧云天生物技術研究所、DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司、二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司、胎牛血清（fetal calf serum，F(xiàn)BS）購自美國Hyclone公司、0.25%胰酶消化液+0.02%乙二胺四乙酸（Edetic acid disodium salt，EDTA）購自中國吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司。

1.3 主要實驗耗材及儀器 流式管購自美國 BD公司、Milli-Q Biocel超純水系統(tǒng)購自法國Millipore公司、FACSCalibur流式細胞儀購置美國BD公司、2020冰點滲透壓儀購自美國ADVANCED公司、PHS-2F酸度計購自中國上海雷磁儀器廠、DZF-6020真空干燥箱購自中國上海一恒科技有限公司、RE 52-05旋轉蒸發(fā)器購自中國上海亞榮生化儀器廠。

1.4 藥物制備 前列消癥湯（組方：黃芪20 g，生薏苡仁30 g，莪術10 g，土貝母10 g，豬苓10 g，白花蛇舌草20 g，黃精20 g）取上述中藥劑量的4倍，一半置煎煮容器內，量筒量取10倍劑量的雙蒸水浸泡半小時，然后煮沸，開小火熬2 h，過濾藥渣倒出藥液，然后將另一半中藥用10倍量乙醇煎煮，煎沸2 h，過濾藥渣倒出藥液，合并2次濾液。將藥液倒于旋轉蒸發(fā)器瓶內，旋轉蒸發(fā)制成膏劑，然后取出倒入盆內，置于真空干燥箱干燥48 h，進行真空干燥，然后將干燥的固體研磨成粉劑，用培養(yǎng)液分別配置成所需的濃度，低劑量組為10 mg·L-1，中劑量組為 30 mg·L-1，高劑量組為100 mg·L-1，用0.2 μm濾器過濾，分裝至50 mL離心管中保存。然后測定最大濃度的前列消癥湯培養(yǎng)液的pH值及滲透壓。

1.5 實驗方法

1.5.1 流式細胞術檢測前列消癥湯對前列腺癌DU-145細胞周期分布的影響 將處于快速生長期的DU-145細胞，更換培養(yǎng)液為高、中、低劑量含前列消癥湯藥物培養(yǎng)液以及正常培養(yǎng)液作為對照，置于培養(yǎng)箱中生長24 h；24 h后取出各組細胞，經(jīng)PBS潤洗、胰酶消化、離心處理后的細胞重懸于預冷的PBS緩沖液中，計數(shù)并調整濃度為1×105個/mL；各組分別取1 mL細胞懸液至流式管，將各組流式管置于震蕩器上部，然后在震蕩的同時緩緩滴入預冷的無水乙醇3 mL，-20℃過夜以充分固定；取出固定于-20℃冰箱的各組細胞后，于低速離心機800 r/min離心5 min；各組加入100 μL RNase酶，然后放置在37℃水浴中孵育30 min；水浴后取出試管，在避光條件下，各管加入400μL試劑盒中 PI染色液，振蕩器上搖勻后4℃避光孵育30 min；過目后，將上述樣本于流式細胞儀上檢測，記錄激發(fā)波長488 nm處熒光值。

1.5.2 流式細胞術檢測前列消癥湯對前列腺癌DU-145細胞凋亡的影響 將處于快速生長期的DU-145細胞，更換培養(yǎng)液為高、中、低劑量含前列消癥湯藥物培養(yǎng)液以及正常培養(yǎng)液作為對照，置于培養(yǎng)箱中生長24 h；24 h后取出各組細胞，用預冷PBS潤洗一遍，加入不含EDTA的酶消化液消化2 min，加入培養(yǎng)基（含10% FBS）1 mL以終止消化，吹勻后再次離心；向各組細胞中加入預冷1×Binding buffer （用超純水將l0× Binding buffer稀釋10倍）重懸，計數(shù)并調整細胞濃度為1×106個/mL，離心后，加入1mL 1×Binding buffer重懸，取l00μL細胞懸液至新流式管中。每個流式管中加入5μL AV避光孵育5 min，然后再分別向各流式管中加入5μL PI染色液，室溫避光孵育10 min；孵育完成后，分別向各管中補充l×Binding buffer 300μL，振蕩器上混勻避光保存，1 h內上流式細胞儀檢測細胞調亡情況（上機前用300目過濾）。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS18.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，結果以均數(shù)±標準差（）表示，計量資料采用單因素方差分析法（One-way ANOVA）。當方差分析結果存在顯著性差異時，進一步進行兩兩比較，當同時滿足正態(tài)性和方差齊性時，選用LSD-t法；同時滿足正態(tài)性和方差不齊選用 Dunnett' s 法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

MTT實驗中的最大劑量1920μg/mL藥液用酸度計及冰點滲透壓儀器測定三次，取平均值，結果顯示pH值為6.91±0.07，參考DMEM/F12（加入NaHCO2）說明書，在正常范圍6.6～7.2。滲透壓為：285.673±5.057，在正常范圍滲透壓274～302 mOsm/kgH2O 內。

MTT實驗方法均顯示前列消癥湯能夠抑制DU-145細胞增殖，其IC50大約為830μg/mL，因此本研究中的中劑量濃度均采用此濃度，高濃度采用2倍IC50，大約為1 660μg/mL，低濃度采用1/2倍IC50，大約為415μg/mL。

2.1 前列消癥湯各劑量組對DU-145細胞凋亡影響 前列消癥湯低劑量組在早期凋亡、晚期凋亡方面與對照組比較，無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。中劑量組在早期凋亡、晚期凋亡方面顯著高于對照組（P＜0.05）。此外，中劑量組早期+晚期凋亡與對照組相比，亦具有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。高劑量組在早期凋亡、晚期凋亡方面表現(xiàn)為進一步增加，與對照組比較，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。同時，高劑量組早期+晚期凋亡與對照組比較，也存在統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。見圖1、表1。

表1 不同濃度前列消癥湯對DU-145細胞凋亡的影響

圖1 各劑量組前列消癥湯對DU-145細胞凋亡的影響

2.2 前列消癥湯各劑量組對DU-145細胞周期的影響 對照組與低劑量組的S期細胞比例分別為（31.69±1.29）%、（31.51±2.61）%，無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；對照組與中劑量組的S期細胞比例分別為（31.69±1.29）%、（37.96±2.24）%，兩者差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；對照組與高劑量組的S期細胞比例分別為（31.69±1.29）%、（43.77±2.48）%，兩者差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖2、表 2。

表2 不同濃度前列消癥湯對DU-145細胞周期影響

圖2 各劑量組前列消癥湯對DU-145細胞周期的影響

3 討論

細胞凋亡也稱為細胞程序性死亡，在1972年由Kerr、Wyllie和Currie三人首次提出?，F(xiàn)已證實細胞凋亡在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及轉歸中具有重要的作用。細胞凋亡是個復雜的過程，受多種基因、蛋白、受體、激素以及信號通路共同調節(jié)[9]。目前研究細胞凋亡主要通過以下2條途徑實現(xiàn)：一條是通過死亡受體激活途徑。在這一途徑中，特異性配體FasL（CD95L）與Fas（CD95）結合后，可誘導細胞膜表面Fas分子聚集形成三聚體，啟動Caspase的級聯(lián)反應，從而降解胞內功能蛋白和結構蛋白，最終使靶細胞凋亡。另一條途徑是線粒體-細胞色素C途徑。當線粒體受到刺激后（如氧化劑、神經(jīng)酰胺、鈣離子、某些胱天酶、Bax等），可釋放出細胞色素C，從而活化Apaf-1?；罨腁paf-1可通過與CARD-CARD的相互作用而活化Caspase，從而啟動Caspase的級聯(lián)反應[10]。

細胞增殖是由細胞周期調控系統(tǒng)控制和調節(jié)，細胞增殖周期分為DNA合成前期（G0/G1期）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期（G2/M期）三個時期。惡性腫瘤具有的生物學特征之一是細胞周期調控紊亂，引起細胞惡性轉變和腫瘤失控性增殖。細胞周期蛋白（Cyclins）、細胞周期依賴性蛋白激酶（cyclin dpendent kinases，CDKs）以及其相應的抑制分子細胞周期激酶抑制劑（cyclin kinase inhibitors，CKIs）共同組成了細胞周期調控系統(tǒng)，基因突變、細胞周期蛋白、激酶的失常或者相應的抑制分子突變均可使細跑周期調控系統(tǒng)失控而引起細胞惡性增殖而形成腫瘤。因此細胞周期的調控機制對于腫瘤的發(fā)生以及進展尤其重要，在腫瘤發(fā)生過程中，許多抑癌基因如p15、p16、p53、BRCA1、Rb以及 p53、BRCA1的下游調控基因如p21、Gadd45發(fā)生突變而失活[11]，造成細胞周期監(jiān)測點功能缺陷，而引起細胞失控性增殖。

前列消癥湯是治療轉移性前列腺癌及去勢抵抗性前列腺癌的有效中藥方劑，在中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院泌尿外科臨床應用十余年。在“積之成者，正氣不足，而后邪氣踞之”、“久病傷氣”等中醫(yī)理論的指導下，中國中西醫(yī)結合泌尿外科奠基人劉猷枋教授通過不斷的臨床實踐，運用宏觀辨病和微觀辨證相結合的思維方式，將轉移性前列腺癌的核心病機概括為“正氣不足、濕毒內蘊”，采用益氣、解毒、利濕治法組方前列消癥湯。該方由薏苡仁、黃精、黃芪、白花蛇舌草、莪術、土貝母、豬苓組成。方中薏苡仁其味甘、淡，性微寒，歸脾、胃、肺經(jīng)，具有健脾利濕，舒筋除痹，清熱排膿的功效，為方中之君藥?，F(xiàn)代藥理研究證實其中所含薏苡仁多糖等成分不僅具有抗腫瘤活性，還具有免疫調節(jié)作用，能夠調節(jié)免疫功能低下小鼠的胸腺指數(shù)，提高小鼠巨噬細胞的吞噬能力[12]。黃芪與黃精兩藥益氣滋陰，共為臣藥，以助薏苡仁健脾益氣之功?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)黃芪中所含的黃芪多糖不僅能夠促進T淋巴細胞、樹突狀細胞及自然殺傷細胞的增殖，還能夠通過靶向調控腫瘤微環(huán)境的細胞因子，從而達到誘導腫瘤細胞凋亡的作用[13]。而黃精內所含有的黃精多糖則能夠抑制小鼠移植腫瘤Heps和Eac的生長，具有明確的抗腫瘤作用[14]。白花蛇舌草、土貝母、莪術、豬苓清熱解毒，破血消積，共為佐藥以祛邪。諸藥合用，共奏健脾益氣、解毒散結利濕之功，體現(xiàn)了中醫(yī)治療晚期腫瘤的扶正祛邪這一基本中醫(yī)治則。前期研究證實，前列消癥湯能夠顯著抑制裸鼠前列腺癌移植腫瘤的生長[15]，抑制前列腺癌PC-3細胞及PC-3干細胞的增殖[16-17]，并能下調PI3K/Akt信號通路中Akt、mTOR和NF-κ B 表達，上調PTEN 表達[18]。

本實驗結果說明前列消癥湯能夠誘導前列腺癌DU-145細胞的早期及晚期凋亡，并隨著劑量的增加，促進凋亡的作用似乎存在一定程度的增加。如果細胞生長被阻斷在細胞周期的任何一個時期，則腫瘤細胞增殖過程將被阻礙，因而腫瘤的生長將被抑制。一種有效治療腫瘤的篩選通常觀察其抑制腫瘤的周期。從上述前列消癥湯對DU-145細胞周期影響的實驗結果來看，前列消癥湯使DU-145細胞在G0/G1期的腫瘤細胞百分比下降，使S期腫瘤細胞百分比上升，G2/M 期腫瘤細胞百分比不變，說明前列消癥湯主要抑制前列腺癌DU-145細胞從 S期向G2期轉變。