小鼠肺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)線粒體結(jié)構(gòu)偶聯(lián)的分離與鑒定

董樹安，余劍波，吳建華

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體之間的膜接觸位點(diǎn)被稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)線粒體結(jié)構(gòu)偶朕（Endoplasmic reticulum–mitochondria contacts，ERMC），是細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路的共同結(jié)構(gòu)平臺(tái)，涉及參與調(diào)控Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、線粒體形態(tài)、脂質(zhì)代謝、炎性反應(yīng)和自噬等[1]。研究發(fā)現(xiàn)ERMC是不同疾病發(fā)生發(fā)展的重要影響因素，因此分離ERMC對(duì)于研究其在疾病發(fā)生和發(fā)展中的作用有重要意義[2]。本研究主要探討如何分離和鑒定肺組織內(nèi)ERMC，從而為研究其在內(nèi)毒素急性肺損傷中的作用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)獲得動(dòng)物倫理批準(zhǔn)（NKYY-DWLL-2019-027），取C57BL/6雄性小鼠(購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所，合格證號(hào)： SCXK(軍)2009-003）10只，周齡8～10周，體重25～30 g，于SPF屏障系統(tǒng)下，將小鼠每5只一籠分籠飼養(yǎng)于天津市中西醫(yī)結(jié)合急腹癥研究所動(dòng)物房，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，飼養(yǎng)室內(nèi)溫度控制在20～25 ℃，濕度控制在65%左右，保持小鼠晝夜節(jié)律規(guī)律，按時(shí)攝入食物及水分。

1.2 主要試劑及儀器 超速離心機(jī)，貝克曼超速離心機(jī)L-100XP，美國；電子分析天平，上海平軒科學(xué)儀器有限公司；兔抗三磷酸肌醇受體-Ⅰ（IP3R-1）抗體、兔抗Sigma-1受體分子伴侶（Sig-1R）抗體、鼠抗蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）抗體、鼠抗Cyto C抗體、鼠抗鈣連蛋白抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；二抗購自天津三箭生物技術(shù)有限公司。

1.3 小鼠肺組織內(nèi)ERMC的分離過程 由于肺組織線粒體提取較為困難，且與其他組織細(xì)胞相比，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)含量較少。既往Wieckowski等[3]方法是針對(duì)肝臟實(shí)體器官的分離提取，因此，在分離肺組織ERMC的過程中，本實(shí)驗(yàn)在預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不理想的基礎(chǔ)上做了相應(yīng)的修改，具體操步驟見圖1。

圖1 小鼠組織內(nèi)ERMC的提取分離和純化流程圖

1.3.1 組織提取 調(diào)整細(xì)胞懸液離心條件，將準(zhǔn)備好的肺組織細(xì)胞懸液在4 ℃以600 ×g離心10 min。收集上清液，沉淀?xiàng)壢ァＪ占锨逡?，將其離心條件調(diào)整為4℃以11 000×g離心10 min。離心后得到的上清液中含有細(xì)胞漿蛋白，沉淀中含有線粒體。進(jìn)一步分離內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，調(diào)整離心條件為4℃20 000×g離心30 min，離心結(jié)束后沉淀即為膜蛋白，此步分離所得上清繼續(xù)在4℃ 100 000×g離心60 min，最后這一步所得沉淀即為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。將線粒體重懸在預(yù)冷的MRB溶液中。

1.3.2 ERMC的純化 在15 mL離心管中加入8 mL percoll溶液，液面上加入提取好的粗提線粒體溶液2 mL，再加入3.5 mL MRB溶液，保持液面距離管口4～5 mm。將上述混合溶液的離心條件調(diào)整為4 ℃ 100 000 ×g離心30 min。離心結(jié)束后，離心管中間有一層白色條帶層，其內(nèi)含有ERMC，離心管底部沉淀含有純化的線粒體。分別用膠頭滴管小心吸取含有ERMC層溶液，向其中加入10倍體積的線粒體溶解溶液；此外，用另一膠頭滴管吸取含有線粒體層溶液，加入10倍體積的線粒體溶解溶液，調(diào)整離心條件為4 ℃ 100 000×g，將含純化線粒體的溶液離心30 min，沉淀內(nèi)含有純化線粒體。此外，為進(jìn)一步純化線粒體，可繼續(xù)用20 mL線粒體溶解溶液重懸，繼續(xù)在4 ℃10 000×g離心10 min，沉淀可用線粒體溶解液溶解。對(duì)于ERMC的純化，離心結(jié)束后將ERMC上清液取出，在4 ℃100 000×g離心60 min，沉淀即為純化ERMC，可用線粒體溶解液溶解。

1.4 鑒定提取分離的ERMC 將上述分離得到的粗體線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、純線粒體、ERMC各細(xì)胞內(nèi)亞結(jié)構(gòu)進(jìn)行Western blotting。采用BCA法對(duì)上述細(xì)胞器結(jié)構(gòu)進(jìn)行總蛋白測(cè)定，具體結(jié)果見表1。向每個(gè)加樣孔加入的蛋白質(zhì)量（蛋白質(zhì)混合物）為40 μg，進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)，陽性條帶以Quantity One 4.62凝膠光密度分析軟件進(jìn)行分析，測(cè)其累積光密度參考值（Integrated optical density，IOD），以各細(xì)胞器內(nèi)不同蛋白的表達(dá)程度與其在線粒體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)相應(yīng)蛋白的比值表示。

表1 肺組織內(nèi)各細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)的蛋白含量 （μg/μL）

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism8.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

小鼠肺臟細(xì)胞內(nèi)ERMC提取分離的結(jié)果見圖2A，中間一層白色條帶中含有ERMC，底層白色沉淀物為純化的線粒體。

對(duì)分離純化的ERMC和其他組分進(jìn)行鑒別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PDI主要表達(dá)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和ERMC中，在純化線粒體中幾乎不表達(dá)，細(xì)胞色素酶C表達(dá)于線粒體中，因此在純化線粒體和粗提線粒體內(nèi)其表達(dá)量較大；而鈣連蛋白主要表達(dá)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，在線粒體內(nèi)表達(dá)量較低。IP3R-1作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的鈣離子通道，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和ERMC均有表達(dá)，而在純化線粒體中幾乎不表達(dá)；此外，Sig-1R多表達(dá)在ERMC和線粒體中，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中幾乎不表達(dá)（圖2B、表 2）。

圖2 小鼠肺組織ERMC分離和鑒定結(jié)果

表2 細(xì)胞內(nèi)不同細(xì)胞器中不同蛋白分子表達(dá)情況的比較（n=10）

3 討論

1958年，Copeland等[4]首次描述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體之間存在聯(lián)系密切。隨后，到70年代早期，越來越多的研究人員在大鼠肝細(xì)胞中觀察到線粒體外膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間連接緊密，但并未對(duì)其進(jìn)行命名[5-6]，直到20年后，Vance等[7]首次成功分離了ERMC結(jié)構(gòu)并對(duì)其特點(diǎn)進(jìn)行了分析。研究者們通過免疫印跡法發(fā)現(xiàn)ERMC、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)三者之間的蛋白譜組成存在著明顯的差異性，但又有一定的相似性[1]。

ERMC中的蛋白分子能使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體選擇性地釋放和吸收Ca2+[8]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的IP3R能夠與線粒體上的低親和力Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)通道（Voltagedependent anion channel 1，VDAC1）組成 Ca2+轉(zhuǎn)移通道，使鈣離子由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移至線粒體[6]。因此，當(dāng)細(xì)胞受到刺激后，線粒體內(nèi)Ca2+濃度會(huì)明顯高于細(xì)胞質(zhì)[8]。目前研究發(fā)現(xiàn)，多種蛋白分子參與線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的相互作用，提示ERMC在生物能量學(xué)、細(xì)胞存活和細(xì)胞死亡中發(fā)揮重要作用[9]。目前，IP3R及線粒體外膜上與其聯(lián)系緊密的VDAC是近年來研究的熱點(diǎn)，IP3R-VDAC復(fù)合物的裝配過程往往需要多種分子伴侶參與[10-11]。Sig-1R在ERMC中富集，從而招募Ca2+結(jié)合分子GRP78、錨蛋白B和IP3R-3[12]。此外，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白75(GRP75)是聯(lián)系IP3R和VDAC之間的重要橋梁蛋白分子[10-11]。在ERMC中還發(fā)現(xiàn)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的能夠與Ca2+結(jié)合的分子伴侶，如鈣連蛋白、鈣網(wǎng)織蛋白和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白44（Endoplasmic reticulum resident protein 44，ERp44） 等[10-11]。PACS-2也是ERMC中的重要組成分子[10-11]。除此之外，ERMC中還包括與線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（Mitochondrial permeability transition pore，MPTP）功能類似的有腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位酶（Adenine nucleotide translocase，ANT）和環(huán)磷酰胺D，進(jìn)而使線粒體對(duì)Ca2+信號(hào)更加敏感[13]。

為研究ERMC在內(nèi)毒素急性肺損傷小鼠發(fā)病機(jī)制中的作用，本研究首先成功分離肺組織細(xì)胞內(nèi)的ERMC，為了驗(yàn)證分離方法的可行性，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，筆者按照Wieckowski等[3]的方法選取0.5 g肺組織，但是在驗(yàn)證ERMC組成的環(huán)節(jié)上，本研究發(fā)現(xiàn)肺組織中提取的蛋白質(zhì)濃度較少，不能用于后續(xù)的蛋白鑒定過程。因此，為了更好的分離和提純肺組織中的ERMC，本研究稱取的肺組織提高為1 g，按照試驗(yàn)流程對(duì)ERMC提取和純化后，經(jīng)BCA法測(cè)定肺組織和肝組織不同組分的蛋白濃度，結(jié)果提示蛋白濃度可用于后續(xù)的Western blotting檢測(cè)。而Wieckowski等[3]的方法主要針對(duì)肝臟實(shí)體臟器進(jìn)行分離，0.5 g肝組織所提取的蛋白能夠用于后續(xù)的蛋白鑒定過程，可能與肝組織質(zhì)地均勻，能夠提取出較多蛋白有關(guān)。

通過Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，本研究采用的分離提純ERMC方法合理可靠，能夠有效分離不同組織細(xì)胞中的ERMC；然后對(duì)分離純化的ERMC和其他組分進(jìn)行鑒別，筆者發(fā)現(xiàn)PDI平均分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和ERMC，Cyto C主要集中在線粒體內(nèi)，而鈣連蛋白主要集中在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，IP3R-1作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的鈣離子通道，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和ERMC中均有表達(dá)，此外Sig-1R多集中于ERMC和線粒體中，上述蛋白表達(dá)趨勢(shì)符合ERMC中相應(yīng)蛋白分布特征。為進(jìn)一步探討ERMC在內(nèi)毒素所致急性肺損傷過程中的變化提供了技術(shù)支持。