醋兩頭尖飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

趙 凌，付 要，蔡廣知*

（長春中醫(yī)藥大學(xué)·吉林長春·130117）

中藥原藥材大多都是未經(jīng)過加工處理的藥材，只有經(jīng)過加工處理和炮炙后，才能更好的發(fā)揮增效減毒的作用。因此，在原藥材符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的情況下，對其進(jìn)行炮制，并制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對臨床而言，尤其重要[1～2]。

兩頭尖為毛茛科植物多被銀蓮花 （Anemone raddeana RegeL）的干燥根莖。夏季采挖，除去須根，洗凈，干燥[3]。兩頭尖含有大量復(fù)雜的化學(xué)成分,迄今為止，從兩頭尖中已經(jīng)分離并獲得的化合物包括皂苷類、內(nèi)酯類、揮發(fā)油類、油脂類、生物堿類及糖類等[4～9]。其性味辛、熱，有毒，歸脾經(jīng)，有祛風(fēng)濕、消癰腫的功效，用于治療風(fēng)寒濕痹、四肢拘攣、骨節(jié)疼痛、癰腫潰爛等，為治療風(fēng)濕病的要藥[10～13]。醋兩頭尖飲片源自《再造丸》方劑，在2008版《北京市中藥飲片炮制規(guī)范》[14]中被收載?，F(xiàn)今，對醋兩頭尖飲片的研究較少，這對醋兩頭尖飲片的質(zhì)量控制十分不利。因此，制定醋兩頭尖飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對規(guī)范炮制飲片質(zhì)量和保證臨床療效具有重要意義。

根據(jù)課題組前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[15]：醋兩頭尖飲片最佳炮制工藝為加20%米醋，悶潤2 h，在120℃下進(jìn)行翻炒，炒制 10 min。本實(shí)驗(yàn)采用最佳醋制工藝參數(shù)[16～17]，對10批不同來源的兩頭尖原藥材進(jìn)行炮制，制備炮制樣品，并對其進(jìn)行測定。根據(jù)研究結(jié)果，制定醋兩頭尖飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-2030型高效液相色譜儀 (島津科技有限公司)，AB135-S型1/10萬電子天平，AL204型 1/1萬電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)，KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；HH-S24電熱恒溫水浴鍋（金壇市大地自動(dòng)化儀器廠）。

1.2 試劑與試藥

米醋（市售，總酸≥90.0 g/L，以乙酸計(jì)）；乙腈、甲醇〔色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司〕；正丁醇、乙酸乙酯、甲酸、乙醇、濃硫酸、三氯甲烷（北京化工廠）；冰醋酸（西隴化工股份有限公司）；乙醚（天津天泰精細(xì)化學(xué)品有限公司）；水（屈臣氏蒸餾水）；竹節(jié)香附素A（RDA）標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111712-201702，純度≥98%）。10批兩頭尖來源信息見表1。

表1 10批兩頭尖來源信息

2 方法

2.1 醋兩頭尖飲片樣品的制備

取10批不同來源的兩頭尖原藥材，凈制，除去雜質(zhì)，稱取適量，加米醋20%，均勻攪拌，悶潤2 h，置于炒鍋內(nèi)，設(shè)置炒制溫度為120℃，翻炒10 min，取出，晾涼，即得。

2.2 性狀外觀

對10批醋兩頭尖飲片樣品進(jìn)行外觀性狀觀察，觀察結(jié)果如圖1-2所示。

2.3 顯微鑒別

分別取10批醋兩頭尖飲片樣品，依次用粉碎機(jī)粉碎過四號篩。取少量醋兩頭尖飲片樣品粉末于載玻片上，加入2～3滴水合氯醛溶液，蓋上蓋玻片。于顯微鏡下觀察，觀察結(jié)果如圖3-6所示。

2.4 薄層色譜鑒別

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱定RDA標(biāo)準(zhǔn)品5.00mg，置于5ml量瓶中，加甲醇溶解，并定容至5ml，制成每1ml含1mol RDA的溶液，得到標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.4.2 供試品溶液的制備

取本品粉末(過三號篩)約5g，精密稱定，置索氏提取器中，加甲醇適量，加熱回流提取3h，提取液回收溶劑至干，殘?jiān)铀?0ml溶解，用乙醚振搖提取2次(20ml、10ml)，棄去乙醚液。用水飽和的正丁醇振搖提取5 次(20ml，20ml，15ml，15ml，15ml)，合并正丁醇液，減壓回收溶劑至干。殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.3 薄層色譜方法

照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液和對照品溶液各2μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（7∶3∶1）的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱5min，于日光下檢視。結(jié)果見圖7-9。

2.5 水分、總灰分、酸不溶性灰分及浸出物測定

參照2015版《中國藥典》，對10批醋兩頭尖飲片樣品的水分、總灰分、酸不溶性灰分及浸出物進(jìn)行測定，結(jié)果見表4。

2.6 含量測定

2.6.1 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈為流動(dòng)相A，以0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B，按表2中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長為206nm。進(jìn)樣量為5μl，理論板數(shù)按竹節(jié)香附素A峰計(jì)算應(yīng)不低于4000。

表2 梯度洗脫

2.6.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

按“2.4.1”項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備方法制備。

2.6.3 供試品溶液的制備

按“2.4.2”項(xiàng)供試品溶液制備方法制備。

2.6.4 線性

分別精密吸取濃度為4mg/ml的RDA標(biāo)準(zhǔn)品溶液依次稀釋，各置于1ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，得濃度分別為 4、2、1、0.5、0.25mg/ml的一系列溶液。分別吸取5μl進(jìn)樣測定，以峰面積（A）為縱坐標(biāo)，樣品濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程：Y=1746613.9780 x-83681.6667 （r=0.9994），在0.25～4.00mg/ml濃度的RDA與峰面積線性關(guān)系良好。

2.6.5 精密度實(shí)驗(yàn)

取“2.4.2”項(xiàng)下供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次5μl，按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算6次RDA峰面積RSD=0.89%，表明儀器精密度良好。

2.6.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

按“2.4.2”項(xiàng)供試品溶液制備方法制備，分別放置0、4、8、12、24h 后進(jìn)樣，進(jìn)樣量 5μl，按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算RDA峰面積RSD=1.49%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

稱取同批樣品6份，按“2.4.2”項(xiàng)供試品溶液制備方法制備，分別進(jìn)樣 5μl，按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算RDA峰面積RSD=1.26%，表明方法重復(fù)性良好。

2.6.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取已知含量的供試品溶液9份，按 1.0∶0.5、1.0∶1.0、1.0∶1.5加入相當(dāng)于兩頭尖提取液中含有量的RDA標(biāo)準(zhǔn)品，各平行3次，按“2.4.2”項(xiàng)供試品溶液制備方法制備，按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件測定，分別進(jìn)樣 5μl，結(jié)果如表3所示。計(jì)算平均回收率為100.03%，RSD=2.73%，結(jié)果表明本法回收率良好。

表3 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6.9 樣品測定

取10批醋兩頭尖飲片粉末5g，精密稱定，每批樣品平行稱取2份，按照“2.4.2”項(xiàng)供試品溶液制備的方法制備，每一份樣品進(jìn)樣2次進(jìn)行測定。對10個(gè)批次的醋兩頭尖飲片樣品進(jìn)行測定，測定結(jié)果見表5。

3 結(jié)果

3.1 外觀性狀

觀察10批醋兩頭尖飲片，得出結(jié)論：醋兩頭尖飲片呈類長紡錘形，兩端尖細(xì)，微彎曲，其中近一端處較膨大，長1～3cm，直徑2～7mm。外皮棕褐色至棕黑色，具微細(xì)縱皺紋，膨大部位常有1～3個(gè)支根痕呈魚鰭狀突起，偶見不明顯的3～5環(huán)節(jié)。質(zhì)硬而脆，易折斷。切面棕色或棕紅色，略平坦。稍具醋酸氣味。

圖1 -2醋兩頭尖外觀性狀照片

3.2 顯微鑒別

粉末灰褐色。淀粉粒眾多，單粒類圓形或橢圓形，直徑2～11μm，臍點(diǎn)點(diǎn)狀或短縫狀，層紋不明顯；復(fù)粒由2～4分粒組成。表皮細(xì)胞紅棕色、黃色或亮黃色，外壁木栓化增厚，常呈脊?fàn)罨蛄鰻钔蝗爰?xì)胞內(nèi)。網(wǎng)紋導(dǎo)管、螺紋導(dǎo)管或梯紋導(dǎo)管多見，直徑10～33μm，少有具緣紋孔導(dǎo)管。

圖3 醋兩頭尖淀粉粒

圖4 醋兩頭尖薄壁細(xì)胞

圖5 醋兩頭尖導(dǎo)管（螺紋導(dǎo)管）

圖6 醋兩頭尖導(dǎo)管（具緣紋孔導(dǎo)管）

3.3 薄層色譜鑒別

10批醋兩頭尖薄層色譜鑒別結(jié)果如圖7-9所示，該方法可以很好的鑒別醋兩頭尖飲片。

圖7 -9醋兩頭尖飲片薄層色譜圖（從左至右依次為RDA標(biāo)品、S1-S10）

3.4 水分、總灰分、酸不溶性灰分及浸出物限度制定

根據(jù)10批醋兩頭尖飲片實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果，如表4所示。按平均值的±20%作為限度制定幅度。規(guī)定醋兩頭尖飲片水分不得過10.2%，總灰分不得過4.0%，酸不溶性灰分不得過0.7%，浸出物不得低于11.8%。

表4 水分、總灰分、酸不溶性灰分及浸出物結(jié)果

3.5 含量測定限度制定

根據(jù)本品10批醋兩頭尖飲片含量測定結(jié)果，如表5所示。10批樣品平均值為0.22%，并參照2015版《中國藥典》中規(guī)定的含量限度，下浮20%。因此，RDA的含量不得少于0.18%。

表5 含量測定結(jié)果

4 討論

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)課題組前期實(shí)驗(yàn)方法和最佳工藝參數(shù)的基礎(chǔ)上，對收集的10批兩頭尖藥材進(jìn)行炮制加工，對制備的醋兩頭尖飲片進(jìn)行外觀性狀、顯微鑒別、薄層色譜鑒別實(shí)驗(yàn)；對水分、總灰分、酸不溶性灰分及浸出物進(jìn)行測定，制定限度，規(guī)定醋兩頭尖飲片水分不得過10.2%，總灰分不得過4.0%，酸不溶性灰分不得過0.7%，浸出物不得低于11.8%；對有效成分RDA含量進(jìn)行測定，制定限度，規(guī)定RDA含量不得少于0.18%。本研究可以為建立醋兩頭尖飲片的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)[18～19]。