?蘇云金芽孢桿菌篩選及其對(duì)蚊科幼蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性?

馬琪琪 鐘肖 馮佩 胡宗偉 王香萍 張建民

摘 要：從四川劍閣、湖北天門、湖南吉首等地采集了100份土樣，通過(guò)高溫法進(jìn)行蘇云金芽孢桿菌的分離純化，采用PCR法對(duì)菌株的殺蟲(chóng)基因進(jìn)行鑒定，以期篩選對(duì)蚊科幼蟲(chóng)有殺蟲(chóng)活力的蘇云金芽孢桿菌菌株，并以蚊科幼蟲(chóng)孑孓為材料對(duì)篩選菌株的殺蟲(chóng)活性進(jìn)行了鑒定。 結(jié)果表明：100份土樣中共篩選到20個(gè)蘇云金芽孢桿菌菌株，其中7個(gè)菌株含有以蚊科幼蟲(chóng)為靶標(biāo)的殺蟲(chóng)基因;其中S4-2菌株的殺蟲(chóng)活性最高，在伴孢晶體濃度為2.00 mg/mL時(shí)，校正死亡率為96.67%。

關(guān)鍵詞：蘇云金芽孢桿菌;蚊科幼蟲(chóng);菌株鑒定;基因型;殺蟲(chóng)活性

中圖分類號(hào)：S476+9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1006-060X（2020）02-0049-04

Abstract： One hundred soil samples were collected from Jiange of Sichuan Province， Tianmen of Hubei Province and Jishou of Hunan Province. Bacillus thuringiensis was isolated and purified by high temperature method. The insecticidal gene of Bacillus thuringiensis was identified by PCR method in order to screen Bacillus thuringiensis strains with insecticidal activity to mosquito larvae， and the insecticidal activity of the screened strains was evaluated by using mosquito larvae as material. The results show that 20 Bacillus thuringiensis strains are screened from 100 soil samples， 7 of which contain insecticidal genes targeting mosquito larvae; among them， S4-2 strain has the highest insecticidal activity， and at the concentration of parasporal crystal of 2.00 mg/mL， the corrected mortality is 96.67%.

Key words： Bacillus thuringiensis; mosquito larva; strain identification; genotype; insecticidal activity

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，簡(jiǎn)稱Bt）是一種全球廣泛存在的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，可產(chǎn)芽孢和由不同的cry基因編碼的伴孢晶體（cry protein）[1-2]。

蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)品具有對(duì)人類無(wú)毒害，對(duì)環(huán)境無(wú)污染且對(duì)靶標(biāo)害蟲(chóng)高效的特點(diǎn)，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[3]。目前，發(fā)現(xiàn)并克隆的殺蟲(chóng)Bt基因已超過(guò)300 種，分別對(duì)鱗翅（Lepidoptera）、雙翅目（Diptera）、鞘翅目（Coleoptera）、膜翅目（Hymenoptera）、同翅目（Homoptera）、直翅目（Orthoptera）、食毛目（Mallophaga）等昆蟲(chóng)具有殺蟲(chóng)活性[4]。自1901年發(fā)現(xiàn)以來(lái)，蘇云金芽孢桿菌受到世界各國(guó)的普遍關(guān)注，已成為研究最深入、應(yīng)用最廣泛的生物殺蟲(chóng)劑[5]。蘇云金芽孢桿菌的最適生長(zhǎng)溫度為24～28℃，除了溫度以外，陽(yáng)光輻射、pH值等對(duì)其田間作用效果的穩(wěn)定性有較大影響[6]。而太陽(yáng)輻射為較難控制的環(huán)境因素，因此該因素也成為限制蘇云金芽孢桿菌活性的最主要因素。由于Bt制劑殺蟲(chóng)譜窄，毒效較化學(xué)藥劑低，加上某些害蟲(chóng)對(duì)Bt制劑已產(chǎn)生抗性等原因[7]，Bt制劑的發(fā)展受到一定限制。近年來(lái)，各國(guó)紛紛加大研發(fā)力度，以期通過(guò)Bt菌株分離鑒定、δ-內(nèi)毒素組成研究和cry基因型鑒定分類等手段篩選出新型、高效的殺蟲(chóng)菌株和特異性基因。

雙翅目蚊科昆蟲(chóng)是常見(jiàn)的衛(wèi)生害蟲(chóng)之一，人類許多疾病都可通過(guò)蚊科昆蟲(chóng)傳播，如登革熱、瘧疾、黃熱病、絲蟲(chóng)病、日本腦炎等[8]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)，全球每年有 3億～5億瘧疾的病例，死亡300萬(wàn)～500萬(wàn)人;每年登革熱的病例有數(shù)千萬(wàn)，在我國(guó)每年瘧疾的報(bào)告病例為3萬(wàn)～5萬(wàn)[9]。而目前還沒(méi)有疫苗和有效的藥物來(lái)預(yù)防瘧疾和登革熱，且在除南極洲外，世界各大洲均有蚊蟲(chóng)分布，因此必須控制媒介蚊蟲(chóng)的數(shù)量來(lái)阻斷蚊媒病的暴發(fā)和流行，降低其對(duì)人類的危害[10]。目前，對(duì)蚊蟲(chóng)的防治主要是針對(duì)成蟲(chóng)，多用蚊香、滅蚊噴劑及電蚊拍等滅蚊。但長(zhǎng)期使用蚊香和滅蚊噴劑對(duì)人體有一定的危害。此外，因?yàn)槲孟闶褂貌划?dāng)造成的火災(zāi)事故年年都有發(fā)生。因此，探尋消滅蚊類幼蟲(chóng)的方法更為可取。

Bt生物農(nóng)藥在防治鱗翅目昆蟲(chóng)方面已取得了顯著成效，但關(guān)于其對(duì)雙翅目昆蟲(chóng)的防效研究相對(duì)較少[11]。蘇云金芽孢桿菌對(duì)雙翅目昆蟲(chóng)具有毒殺作用，且其伴孢晶體多為球形，也鑒定了多個(gè)殺蟲(chóng)cry基因，這為蘇云金芽孢桿菌防治雙翅目昆蟲(chóng)的菌株篩選奠定了良好的基礎(chǔ)[12]。試驗(yàn)從四川劍閣、湖北天門、湖南吉首等地采集了100份土樣，通過(guò)高溫法進(jìn)行蘇云金芽孢桿菌的分離純化，采用PCR法對(duì)菌株的殺蟲(chóng)基因進(jìn)行鑒定，以期篩選對(duì)蚊科幼蟲(chóng)有殺蟲(chóng)活力的蘇云金芽孢桿菌菌株，并以蚊科幼蟲(chóng)孑孓為材料對(duì)篩選菌株的殺蟲(chóng)活性進(jìn)行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 土樣采集與菌株分離

從四川劍閣、湖北天門、湖南吉首等地采集土樣共計(jì)100份。具體采樣方法為：選取無(wú)農(nóng)事操作土地，去掉5 cm深的表層土壤;用無(wú)菌藥勺采集5 g土樣裝于無(wú)菌采樣袋中[13];將土樣帶回實(shí)驗(yàn)室于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。菌株分離方法為：取1 g土樣懸浮于10 mL無(wú)菌水中，65 ℃水浴加熱30 min，震蕩混勻;吸取10 μL溶液，稀釋100倍;取100 μL稀釋液，加入900 μL無(wú)菌水稀釋成1 000倍稀釋液;分別吸取10 μL的100倍稀釋液和1 000倍稀釋液，涂布在NA培養(yǎng)基[14]上，置于30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3 d;挑取菌落在顯微鏡下觀察，標(biāo)記呈蘇云金芽孢桿菌菌落形狀的菌落;將標(biāo)記菌落進(jìn)行純化，將純化菌落置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 供試?yán)ハx(chóng)

供試蚊科幼蟲(chóng)孑孓飼養(yǎng)于長(zhǎng)江大學(xué)西校區(qū)植物園固定水桶內(nèi)。試驗(yàn)時(shí)先用小號(hào)塑料水桶舀取固定水桶內(nèi)含孑孓的水，然后用紗布分離，再用小毛筆將紗布上獲得的孑孓置于新的小桶內(nèi)水中，小桶內(nèi)加有少許酵母粉進(jìn)行飼養(yǎng)[15]。

1.3 伴孢晶體觀察及收集

伴孢晶體觀察：取一干凈載玻片，滴一滴清水;取出保存的菌株，用無(wú)菌槍頭挑取菌落于載玻片上的水滴中，用槍頭將菌體在水滴之中涂布均勻，置于烘箱中烘干;用移液槍吸取100 μL石碳酸，滴在有菌體部分，靜置染色1 min左右;用無(wú)菌水沖洗滴有石碳酸復(fù)紅染液的玻片3～4次，用紙巾擦干菌株以外的水漬，蓋上蓋玻片，做成蘇云金芽孢桿菌玻片;在100倍油鏡下觀察蘇云金芽孢桿菌及其伴孢晶體，判斷蘇云金芽孢桿菌類型，并拍照[16]。

伴孢晶體收集：將純化的蘇云金芽孢桿菌菌株接種至裝有50 mL LB 培養(yǎng)液的離心管中，220 r/min，30 ℃培養(yǎng)48～72 h;待菌株產(chǎn)生大量伴孢晶體后，將培養(yǎng)好的菌液放入離心機(jī)，4 500 r/min，4℃冷凍離心20 min，棄上清;用20 mL 0.1% Triton-x100生理鹽水重懸菌體，重懸菌液，4 500 r/min，4 ℃離心20 min，棄上清;無(wú)菌水洗滌沉淀3次，低溫風(fēng)干后稱量沉淀物重量;加入一定量無(wú)菌水，配置成固定濃度的懸浮液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 蘇云金芽孢桿菌基因型的鑒定

采用PCR的方法對(duì)分離出來(lái)的蘇云金芽孢桿菌菌株進(jìn)行基因型鑒定，鑒定中所用cry1、cry2、cry4等引物是根據(jù)文獻(xiàn)[17]設(shè)計(jì)。反應(yīng)條件：94℃ 5 min;94℃ 1 min，退火1 min，72℃1 min，35個(gè)循環(huán);72℃10 min。其中，根據(jù)不同引物設(shè)定不同退火溫度。

1.5 伴孢晶體對(duì)蚊科幼蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性鑒定

（1）初步篩選。取100 mL滅菌錐形瓶，向其中加入一定量蘇云金芽孢桿菌晶體懸浮液，對(duì)照組加入等量無(wú)菌水，然后向錐形瓶中加入飼養(yǎng)幼蟲(chóng)水體，定容至50 mL，配制成晶體濃度為1 mg/mL的溶液，每個(gè)菌株設(shè)3組平行。在飼養(yǎng)的幼蟲(chóng)中選擇3～4齡幼蟲(chóng)，用小毛筆挑至錐形瓶中，每個(gè)錐形瓶中10只，用封口膜將錐形瓶封口。記錄幼蟲(chóng)接入時(shí)間，于第二日相同時(shí)間統(tǒng)計(jì)死亡幼蟲(chóng)及存活幼蟲(chóng)數(shù)量，共統(tǒng)計(jì)5 d，記錄其總存活數(shù)，死亡數(shù)量。

（2）復(fù)篩。挑選初步篩選中表現(xiàn)出的高毒菌株，按照上述步驟進(jìn)行不同濃度的殺蟲(chóng)性試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選結(jié)果

經(jīng)過(guò)分離篩選，從100份土樣中共獲得蘇云金芽孢桿菌菌株20株，篩選率為20%。其中，從四川劍閣篩選出蘇云金芽孢桿菌8株，從湖北天門篩選出蘇云金芽孢桿菌6株，從湖南石首篩選出蘇云金芽孢桿菌6株，其對(duì)應(yīng)地點(diǎn)和編號(hào)見(jiàn)表2。

2.2 伴孢晶體的形態(tài)觀察

將分離出來(lái)的菌株經(jīng)石碳酸復(fù)紅染色后在光學(xué)顯微鏡（10×目鏡，100×油鏡）下進(jìn)行觀察，鏡檢結(jié)果如圖1所示，菌株包含的伴孢晶體類型均為圓球形（圖1B），從而可初步判斷它們可能對(duì)雙翅目蚊科幼蟲(chóng)具有殺蟲(chóng)活性。

2.3 Bt菌株cry 基因型的鑒定

cry1、cry2和cry4是對(duì)雙翅目昆蟲(chóng)具有殺蟲(chóng)活性的蘇云金芽孢桿菌的主要?dú)⑾x(chóng)基因，故可采用PCR方法對(duì)所篩選的蘇云金芽孢桿菌菌株的基因型進(jìn)行鑒定。由圖2可知，從獲得的蘇云金芽孢桿菌中分離出含cry1基因的蘇云金芽孢桿菌3株，分別為S4-1、S20-1、HB8-1;含cry2基因的蘇云金芽孢菌株2株，為HB2-1和HN10-1;含cry4基因的蘇云金菌株4株，分別為S4-1和S4-2和S12-1、HN10-1。

2.4 毒力菌株的初步篩選

利用飼養(yǎng)的雙翅目蚊科3～4齡幼蟲(chóng)對(duì)分離的20株蘇云金芽孢桿菌菌株伴孢晶體進(jìn)行殺蟲(chóng)生物活性測(cè)定，結(jié)果如表3所示，對(duì)蚊科幼蟲(chóng)有殺蟲(chóng)作用的菌株共計(jì)3株，分別為S4-2、S12-1、HN10-1;其中殺蟲(chóng)效果最好的是S4-2，在1.00 mg/mL 濃度下校正死亡率為82.76%，差異達(dá)到顯著水平。

2.5 高毒菌株的復(fù)篩

選擇初步篩選中表現(xiàn)出顯著殺蟲(chóng)活性的S4-2菌株和表現(xiàn)出一定殺蟲(chóng)活性的S12-1、HN10-1菌株進(jìn)行了不同晶體濃度的梯度殺蟲(chóng)試驗(yàn)，結(jié)果如表4所示，S4-2菌株在伴孢晶體濃度為2.00 mg/mL時(shí)殺蟲(chóng)活性最強(qiáng)，校正死亡率達(dá)到96.67%，差異達(dá)到顯著水平，而同濃度的S12-1、HN10-1菌株，校正死亡率分別只有53.33%和63.33%，殺蟲(chóng)效果較差，可能需要更高的濃度才能獲得較好的效果。

3 討 論

高效殺蟲(chóng)活性的蘇云金芽孢桿菌的篩選是一項(xiàng)長(zhǎng)期不懈的任務(wù)。該研究從四川劍閣、湖北天門、湖南吉首3地采集土樣100份，共篩選蘇云金芽孢桿菌菌株20株，篩選率只有50%。不同地方的土樣，因?yàn)槠涞乩憝h(huán)境及土壤酸堿性等生化特性不同，含有的蘇云金芽孢桿菌菌株種類與數(shù)量存在差異。相較于四川劍閣和湖南吉首采集的土樣，湖北天門采集到的土樣中分離出的蘇云金芽孢桿菌菌株種類數(shù)量相對(duì)較少。劍閣、吉首都為山區(qū)，天門屬于江漢平原，與大洪山區(qū)毗鄰，自然環(huán)境的差異導(dǎo)致山區(qū)與平原地區(qū)的蘇云金芽孢桿菌菌株內(nèi)所含基因及其對(duì)不同目科昆蟲(chóng)的防治效果存在一定差異[18]。在分離出的20株蘇云金芽孢桿菌中，含cry1基因的菌株有3株，含cry2基因的菌株有2株，含cry4基因的有4株。理論上含有cry4基因的蘇云金桿菌對(duì)雙翅目昆蟲(chóng)有較強(qiáng)的毒殺作用，但試驗(yàn)結(jié)果顯示，各菌株的具體毒力強(qiáng)弱存在差異[19]。

對(duì)20株蘇云金芽孢桿菌菌株進(jìn)行蚊科幼蟲(chóng)殺蟲(chóng)試驗(yàn)，篩選出一株殺蟲(chóng)活性相對(duì)較高的菌株S4-2，當(dāng)伴孢晶體濃度為2.00 mg/mL時(shí)，對(duì)蚊科幼蟲(chóng)孑孓的校正死亡率高達(dá)96.67%。但是，筆者只進(jìn)行了室內(nèi)試驗(yàn)，與蚊蟲(chóng)類幼蟲(chóng)生活環(huán)境存在一定的差異，故該菌株對(duì)蚊科幼蟲(chóng)的防治在理論上是可行的。戶外使用該種蘇云金芽孢桿菌是否會(huì)產(chǎn)生室內(nèi)同樣的效果，尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。試驗(yàn)選擇的蚊科幼蟲(chóng)對(duì)象為孑孓的3～4齡，該齡期孑孓可能相較于其低齡幼蟲(chóng)有較高的抗藥性，故在低齡幼蟲(chóng)期進(jìn)行蚊科幼蟲(chóng)的防治，應(yīng)有更好的防治效果。此外，按蚊屬、伊蚊屬和搖蚊屬蚊科幼蟲(chóng)在自然界中多混合生活于水中，而該試驗(yàn)所選擇的對(duì)象為蚊科的幼蟲(chóng)，并未區(qū)分是按蚊、伊蚊還是搖蚊的幼蟲(chóng)[20]。有研究表明，不同屬種的蚊類幼蟲(chóng)在不同環(huán)境條件下對(duì)蘇云金芽孢桿菌的響應(yīng)存在一定的差異，但該研究的試驗(yàn)條件與自然條件十分接近，因此其結(jié)果更具參考價(jià)值。

蘇云金芽孢桿菌作為生物殺蟲(chóng)劑相對(duì)于化學(xué)農(nóng)藥有許多優(yōu)點(diǎn)，如對(duì)人畜安全無(wú)害、對(duì)環(huán)境無(wú)污染等。此外，蚊科昆蟲(chóng)主要通過(guò)成蟲(chóng)傳播各種疾病，若能將蚊科昆蟲(chóng)消滅于幼蟲(chóng)，必將大大減少人類疾病的傳播與發(fā)生。如果能得到一種高效的防蚊蘇云金芽孢桿菌菌株，必將大大減少蚊蟲(chóng)給人們帶來(lái)的危害。因此，不斷加強(qiáng)蘇云金芽孢桿菌菌株的篩選，積極探索其對(duì)蚊類幼蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性，具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

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（責(zé)任編輯：成 平）