美洲南瓜枯萎病菌分離鑒定及其生物學(xué)特性

李金峰 劉佳 侯敏 張樹(shù)武 沈志彥 徐秉良 陳榮賢

摘 要： 通過(guò)采用病原菌形態(tài)學(xué)觀察、ITS分子鑒定、病原菌生物學(xué)特性測(cè)定，明確甘肅省武威地區(qū)美洲南瓜枯萎病的病原菌及其生物學(xué)特性。結(jié)果表明，引起甘肅省武威地區(qū)美洲南瓜枯萎病的病原為尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum）。該病原菌在25 ℃、12 h光暗交替，pH為8，以淀粉為碳源時(shí)生長(zhǎng)最好。以硝酸鈉和尿素為氮源時(shí)其生長(zhǎng)速率最快，以牛肉浸膏為氮源時(shí)最有利于產(chǎn)孢。美洲南瓜枯萎病的病原菌及生物學(xué)特性的明確，為后續(xù)的病害防治等方面提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 美洲南瓜;枯萎病;分離鑒定;尖孢鐮孢菌;生物學(xué)特性

Abstact： In this study， morphological observation of pathogens， molecular identification of ITS， and determination of biological characteristics of pathogens were used to determine the pathogens and biological characteristics of Cucurbita pepo Fusarium wilt in Wuwei area of Gansu province. The results showed that the pathogen causing Cucurbita pepo Fusarium wilt in Wuwei area of Gansu province was Fusarium oxysporum. The fungi was alternated in light and dark at 25 ℃， 12 h， pH 8 and grew best when starch was used as the carbon source. When sodium nitrate and urea were used as nitrogen sources， the growth rate was fastest， and when beef extract was used as nitrogen source， it was most conducive to spore production. The pathogens and biological characteristics of the Cucurbita pepo Fusarium wilt disease provide a theoretical basis for subsequent disease control.

美洲南瓜（Cucurbita pepo）屬于葫蘆科南瓜屬（Cucurbita），別名為西葫蘆、番瓜等，原產(chǎn)于北美洲南部地區(qū)。因其含有多種營(yíng)養(yǎng)成分，具有很高的食用和藥用價(jià)值，在我國(guó)大部分地區(qū)普遍栽培[1]。甘肅省武威市是美洲南瓜的重要育種研發(fā)和生產(chǎn)基地，也是當(dāng)?shù)刂匾慕?jīng)濟(jì)作物之一[2]。

瓜類枯萎病是瓜類生產(chǎn)上最難防治的土傳性病害之一[3]，其中，以西瓜發(fā)病最重，南瓜次之，一般可導(dǎo)致減產(chǎn)20%～30%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)50%～60%，其中連作地的發(fā)病情況最為嚴(yán)重，?？蓪?dǎo)致全田無(wú)收，加之近年來(lái)枯萎病對(duì)美洲南瓜的危害日益嚴(yán)重，但其防治較為困難。因此，枯萎病的危害是瓜類生產(chǎn)上急需解決的重要問(wèn)題[4]，也成為限制美洲南瓜生產(chǎn)的重要因素之一[5]。

研究表明，瓜類枯萎病的病原菌多為尖孢鐮孢菌[6]。引起甜瓜枯萎病的病原菌為尖孢鐮孢菌甜瓜?；虵usarium oxysporum f. sp. melonls[7]。徐彥剛等[8]研究表明，尖孢鐮孢菌黃瓜?；虵. oxysporum f. sp. cucumerinum是造成黃瓜枯萎病的病原菌。呂佩珂等[9]研究認(rèn)為，尖鐮孢菌西瓜?；?F. oxysporum f. sp. niveum為侵害西瓜的枯萎病病原菌。但是，關(guān)于近幾年來(lái)甘肅省武威地區(qū)美洲南瓜枯萎病病原菌的相關(guān)報(bào)道相對(duì)較少。

明確病原菌的種類及其生物學(xué)特性是進(jìn)行病害防治的基礎(chǔ)工作，因此，筆者對(duì)甘肅省武威地區(qū)的美洲南瓜枯萎病病原菌進(jìn)行分離鑒定，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，以期為美洲南瓜枯萎病的防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的美洲南瓜品種‘金蘋果12號(hào)‘金蘋果9號(hào)‘三星‘四星‘P3和‘P13均由甘肅省武威市金蘋果有限責(zé)任公司提供。

1.2 方法

1.2.1 病樣采集 2018年6月15日，在甘肅省武威市金蘋果有限責(zé)任公司種質(zhì)資源試驗(yàn)基地隨機(jī)采集美洲南瓜‘金蘋果12號(hào)‘金蘋果9號(hào)‘三星和‘四星品種的枯萎病發(fā)病植株共20株。將病樣帶回甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病毒與分子學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離鑒定。

1.2.2 美洲南瓜枯萎病病原菌分離與純化 供試培養(yǎng)基： PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖15 g，瓊脂粉（進(jìn)口）10 g，用水定容至1 000 mL，用于病原菌的分離純化培養(yǎng)。

CLA培養(yǎng)基：新鮮康乃馨葉片小塊滅菌后放入培養(yǎng)皿中，每皿5～10片，瓊脂粉（進(jìn)口）10 g，加水定容至1 000 mL，用于病原菌大小型分生孢子的觀察培養(yǎng)。

Czapek培養(yǎng)基：1 g KH2PO4、0.5 g MgSO4·7H2O、0.01 g FeSO4·7H2O、30 g蔗糖、0.5 g KCl、2 g NaNO3、瓊脂粉（進(jìn)口）10 g、用水定容至1 000 mL，用于不同碳氮源對(duì)美洲南瓜枯萎病菌的培養(yǎng)。

組織分離法：用無(wú)菌水將病株樣品莖基部和根部沖洗干凈，用無(wú)菌濾紙將水分吸干，在超凈工作臺(tái)中將發(fā)病莖基部和根部的病健交界處切成5 mm×5 mm的小塊，將處理好的小塊用75%乙醇浸潤(rùn)10 s，再用0.1%升汞溶液消毒2～3 min，然后用無(wú)菌水漂洗3次，用無(wú)菌濾紙吸干殘余水分。將此病健交界小塊采用五點(diǎn)法接于PDA平板上，然后將其放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約3～4 d，溫度25 ℃，16 h光照/8 h黑暗，及時(shí)挑取根段周圍長(zhǎng)出的菌落接種于新的PDA平板上，置于25 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)[10]。

待純化的菌落生長(zhǎng)5～10 d，用無(wú)菌水沖洗菌絲表面，收集孢子或菌絲懸浮液，采用稀釋法進(jìn)行單孢分離純化病原菌。待PDA平板上長(zhǎng)出單菌落，用接種針挑取少量菌絲或孢子至新的PDA平板上培養(yǎng)，即獲得單孢或單菌絲分離物。

1.2.3 致病性測(cè)定 病原菌孢子懸浮液的配制：將分離得到的病菌在PDA平板上培養(yǎng)7 d后，用0.025%的吐溫80溶液和無(wú)菌水洗下孢子，用無(wú)菌的玻棒攪拌均勻，血球計(jì)數(shù)板觀察計(jì)數(shù)。配制成濃度為 1×105 個(gè)·mL-1孢子懸浮液備用。

首先對(duì)美洲南瓜種子進(jìn)行催芽處理然后移入育種盤，等幼苗生長(zhǎng)7 d后在其根部和莖基部制造微傷口，在傷口處噴灑分離得到的濃度為1×105 個(gè)·mL-1的病菌孢子懸浮液后，在恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，溫度25 ℃，16 h光照/8 h黑暗，以無(wú)菌水處理為對(duì)照，觀察并記錄[10]。待發(fā)病后取莖基部發(fā)病組織再次進(jìn)行病原菌分離純化與鑒定。

1.2.4 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定 將病原菌在PDA平板上純化后用直徑為5 mm打孔器打取菌餅，接種于新的PDA平板和CLA平板上，每種病原菌6次重復(fù)，然后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。7 d后，觀察記錄培養(yǎng)于PDA平板上的病原菌菌落形態(tài)特征及培養(yǎng)皿背面著色情況。15 d后，挑取CLA平板上的菌絲在光學(xué)顯微鏡下觀察其大、小型分生孢子等，并進(jìn)行拍照。參照Leslie J.F等[11]的方法對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定。

1.2.5 病原菌的分子生物學(xué)鑒定 參照OMEGA公司的HP Plant DNA Kit試劑盒說(shuō)明書提取病原菌DNA，利用真核生物基因組中的rDNA-ITS區(qū)段通用引物ITS1（5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3）和ITS4 （5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）對(duì)病原菌基因組DNA 進(jìn)行PCR擴(kuò)增[12]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至西安擎科生物科技有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站的數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)測(cè)序結(jié)果，在線搜索同源性較高的已知序列，將序列信息導(dǎo)入MEGA 7軟件通過(guò)鄰接法（neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹(shù)，分析其親緣關(guān)系。根據(jù)比對(duì)結(jié)果，進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。

1.2.6 溫度對(duì)美洲南瓜枯萎病菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響 將美洲南瓜枯萎病菌接種于PDA培養(yǎng)基上，分別置于 5、15、20、25、30、35、40 ℃無(wú)光照保濕培養(yǎng)7 d，每處理5次重復(fù)。用十字交叉法每2 d測(cè)量1次菌落的直徑，取其平均值并計(jì)算菌絲平均生長(zhǎng)速度。在培養(yǎng)7 d后，用無(wú)菌水洗下孢子制作成孢子懸浮液并將體積定容到10 mL，取50 μL孢子懸浮液滴于血球計(jì)數(shù)板上進(jìn)行病原菌孢子計(jì)數(shù)[13]。

1.2.7 光照對(duì)美洲南瓜枯萎病菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響 將已接種美洲南瓜枯萎病菌的 PDA 培養(yǎng)基分為3組，25 ℃持續(xù)光照培養(yǎng)96 h;25 ℃持續(xù)黑暗培養(yǎng)96 h;25 ℃黑暗12 h與光照12 h交替培養(yǎng)96 h，每處理重復(fù)5次。按1.2.6中的方法測(cè)量菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量。

1.2.8 碳源對(duì)美洲南瓜枯萎病菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響 采用查彼（Czapek）培養(yǎng)基[14]作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將美洲南瓜枯萎病菌分別接入以相同質(zhì)量的麥芽糖、葡萄糖、淀粉、甘露醇和乳糖代替查彼培養(yǎng)基中的蔗糖的培養(yǎng)基中，并以不加碳源的培養(yǎng)基作為對(duì)照。室溫培養(yǎng)，每處理5次重復(fù)。7 d后觀察菌落形態(tài)和孢子形成情況并按照1.2.6中的方法測(cè)量菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量。

1.2.9 氮源對(duì)美洲南瓜枯萎病菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響 將美洲南瓜枯萎病菌分別接入以相同質(zhì)量氮的硝酸銨、尿素、氯化銨、硫酸銨和牛肉浸膏替代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的NaNO3的培養(yǎng)基中，并以不加氮源的培養(yǎng)基為對(duì)照。室溫培養(yǎng)，每處理5次重復(fù)。7 d后觀察菌落形態(tài)和孢子形成情況并按照1.2.6中的方法測(cè)量菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量。

1.2.10 pH對(duì)美洲南瓜枯萎病菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響 將美洲南瓜枯萎病菌接種于不同pH的PDA培養(yǎng)基上，設(shè)置5個(gè)處理，pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，每處理5次重復(fù)。在室溫下培養(yǎng)，按1.2.6中的方法測(cè)量菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量。

2 結(jié)果與分析

2.1 美洲南瓜枯萎病田間發(fā)病癥狀

美洲南瓜枯萎病初期表現(xiàn)為植株下層葉片下垂或萎蔫，葉片顏色稍有加深，向主葉脈輕微皺縮，似缺水狀（圖1-b），病株莖基部維管束、莖稈表皮變褐腐爛（圖1-c～d），出現(xiàn)初期癥狀后3～4 d植株死亡。

2.2 美洲南瓜枯萎病病原菌的分離鑒定

2.2.1 病原菌的分離 在PDA培養(yǎng)基上對(duì)20株美洲南瓜病株全部進(jìn)行分離與純化，共得到16種分離物，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征歸為Ng-6、Ng-7 和Ng-8三個(gè)不同的類群，其中Ng-6包含3個(gè)分離物，占總分離物的18.75%;Ng-7包含11個(gè)分離物，占總分離物的68.75%;Ng-8包含2個(gè)分離物，占總分離物的12.5%。分別選取三個(gè)類群中最具代表性的Ng-6-1、Ng-7-1和Ng-8-1用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.2 致病性測(cè)定 從2.2.1分離得到的 Ng-6-1、Ng-7-1和Ng-8-1進(jìn)行純化，分別用純化后的菌株回接到美洲南瓜相同品種健康幼苗（圖2），其中Ng-7-1的處理組美洲南瓜在7 d后發(fā)病且表現(xiàn)為葉片和莖稈萎蔫、失水，莖基部變褐，對(duì)照組均未發(fā)病且根系發(fā)達(dá)。根據(jù)柯赫氏法則，對(duì)接種病原菌后發(fā)病植株的病健交界處再次進(jìn)行組織分離和純化，得到的病原菌與Ng-7-1一致，故初次分離到的Ng-7-1為美洲南瓜枯萎病的致病菌。

2.2.3 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定 將純化后的Ng-7-1菌株在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)5～7 d 后可形成邊緣較整齊的圓形單菌落。菌落正面為白色或紫色，突起絮狀、絨毛狀，菌絲體纖細(xì)，背面產(chǎn)生紫色色素（圖3-a～b）;在CLA培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)15 d后觀察到病原菌菌株的分生孢子有兩種形態(tài)，小型分生孢子數(shù)量居多呈橢圓形、卵形，多為單孢，大小為：（5.5～15.0×3.0～6.8） ?m（圖3-c） ;大型分生孢子數(shù)量較少呈鐮刀形，中間略彎曲，兩端細(xì)胞稍尖，多數(shù)為3隔，大小為：（17.8～35.5×4.0～5.8）?m（圖3-c）。根據(jù)菌落特征及病原菌分生孢子的形狀，初步鑒定分離純化的美洲南瓜枯萎病的病原為尖孢鐮孢菌F. oxysporum。

2.2.4 分子生物學(xué)鑒定 將Ng-7-1菌株的ITS序列的測(cè)序結(jié)果提交至GenBank，獲得注冊(cè)號(hào)為MN814027。通過(guò)與NCBI網(wǎng)站的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示該序列與尖孢鐮孢菌F. oxysporum的相似性達(dá)到了99%。建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖4），結(jié)果表明，Ng-7-1菌株與尖孢鐮孢菌聚在同一分支，親緣關(guān)系最近，從而確定從甘肅省武威地區(qū)采集的美洲南瓜枯萎病病株的病原菌為尖孢鐮孢菌F. oxysporum。

2.3 溫度對(duì)美洲南瓜枯萎病菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響

不同的溫度對(duì)美洲南瓜枯萎病菌的菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量具有一定的影響（表1），菌株在10～35 ℃范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)產(chǎn)孢，在20～30 ℃的溫度范圍內(nèi)菌絲生長(zhǎng)較好，其中生長(zhǎng)最快，產(chǎn)孢量也最多的溫度為25 ℃，該菌在溫度低于5 ℃或高于40 ℃的條件下不生長(zhǎng)也不產(chǎn)生分生孢子。

2.4 光照對(duì)美洲南瓜枯萎病菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響

該菌在25 ℃條件培養(yǎng)24 h后進(jìn)行不同光照處理后，菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量呈現(xiàn)出一定的差異（表2）。其中12 h光暗交替培養(yǎng)96 h的菌絲生長(zhǎng)速率最快，產(chǎn)孢量最多，持續(xù)黑暗菌絲生長(zhǎng)速率最慢。持續(xù)光照產(chǎn)孢量最少。

2.5 不同碳源對(duì)美洲南瓜枯萎病菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響

該病原菌在不同的碳源培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，并且都與對(duì)照差異顯著（表3）。其中最適碳源為淀粉，病原菌生長(zhǎng)速率最快，產(chǎn)孢量最多，而該菌在葡萄糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速率最慢且產(chǎn)孢量最少。在對(duì)照培養(yǎng)基上菌絲幾乎不生長(zhǎng)。

2.6 不同氮源對(duì)美洲南瓜枯萎病菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響

該病原菌在不同的氮源培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)產(chǎn)孢，但不同氮源之間存在一定的差異（表4）。其中在硝酸鈉和尿素培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速率較快且無(wú)顯著性差異，在硫酸銨培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)最慢。在牛肉浸膏培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最多，與其他氮源差異顯著。在硫酸銨、尿素和硝酸銨培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量較少且無(wú)明顯差異。缺氮時(shí)菌絲生長(zhǎng)較快但只是稀疏的氣生菌絲，幾乎不產(chǎn)孢。

2.7 pH對(duì)美洲南瓜枯萎病菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響

該病原菌在pH為5.0～9.0范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)產(chǎn)孢（表5），其中pH為8.0時(shí)菌絲生長(zhǎng)最快產(chǎn)孢量最多，而pH為5.0時(shí)菌絲生長(zhǎng)速率最慢產(chǎn)孢量最少，說(shuō)明該菌在中性及偏堿性條件下生長(zhǎng)快，容易產(chǎn)孢。

3 討 論

研究表明，瓜類、香蕉、茄子、向日葵等植物的枯萎病均由尖孢鐮孢菌侵染所致[15-16]，該病菌具有不同的?；蚚17]。據(jù)報(bào)道，引起瓜類枯萎病的致病菌至少存在8個(gè)?；蚚18]，筆者對(duì)采集到的甘肅省武威地區(qū)美洲南瓜枯萎病進(jìn)行病原菌的分離、純化和鑒定，結(jié)合菌落形態(tài)特征、顯微特征及ITS 分子鑒定結(jié)果對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定，確定引起甘肅省武威地區(qū)美洲南瓜枯萎病的病原為尖孢鐮孢菌F. oxysporum。

病原菌的生物學(xué)特性研究是病原菌的基礎(chǔ)研究，尤其為抗病育種和生物防治研究提供理論依據(jù)，本研究結(jié)果表明該菌在10～35 ℃范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)產(chǎn)孢，25 ℃為最適生長(zhǎng)溫度。菌絲生長(zhǎng)最佳的光照條件為12 h光暗交替，最適碳源為淀粉。這與沈文淵[19]報(bào)道的尖孢鐮孢菌黃瓜?；汀⒓怄哏犳呔蠈；汀⒓怄哏犳呔鞴蠈；汀⒓怄哏犳呔喙蠈；偷淖钸m溫度，光照和碳源的研究結(jié)果相似。根據(jù)肖昌華等[20]的報(bào)道，苦瓜枯萎病病原菌的生長(zhǎng)最適pH為6.3，產(chǎn)孢最適pH為6.3～8.5，而本試驗(yàn)中病原菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢最適pH為8，分析原因可能是因?yàn)椴煌膶；途鷮?duì)生長(zhǎng)所需的酸堿度不同以及病原菌分離地的土壤酸堿度有關(guān)，但在總體上來(lái)看尖孢鐮孢菌適合在中性及偏堿性條件下生長(zhǎng)。在沈文淵[19]的報(bào)道中4種尖孢鐮孢菌?；偷淖钸m氮源都為蛋白胨，而本試驗(yàn)中病原菌生產(chǎn)速率最好的氮源為硝酸鈉和尿素，產(chǎn)孢量最多的是牛肉浸膏。分析原因可能是因?yàn)椴煌瑢；途g存在著對(duì)氮源的利用有一定的差異。同時(shí)說(shuō)明該菌在菌絲的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢過(guò)程中不同的氮源起著不同的作用。

筆者鑒定了甘肅省武威地區(qū)美洲南瓜枯萎病的病原菌為尖孢鐮孢菌F. oxysporum，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了測(cè)定，但美洲南瓜枯萎病病原菌是否存在專化型，以及該病原菌的傳播途徑等問(wèn)題有待于進(jìn)一步研究。

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