木聚糖高溫自水解和醇沉分離制備低聚木糖

連之娜, 王艷娥, 羅 京， 勇 強(qiáng)， 余世袁

(南京林業(yè)大學(xué) 林木遺傳與生物技術(shù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；江蘇省林業(yè)資源 高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心；化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210037)

木聚糖是由若干個(gè)木糖單元聚合而成，習(xí)慣上將低聚合度(聚合度2～6)的木聚糖稱為低聚木糖(XOS)。XOS是一種功能性低聚糖，在人體消化道內(nèi)不會(huì)被代謝，到達(dá)大腸后能顯著增加有益菌數(shù)量，對(duì)改善腸道微生態(tài)環(huán)境、潤(rùn)腸通便和治療腹瀉等效果明顯，近年來(lái)在國(guó)內(nèi)外備受關(guān)注[1-2]。XOS還具有增強(qiáng)免疫力、促進(jìn)鈣吸收、降低結(jié)直腸癌變、抗氧化性和降低血壓等多種功效[3]，且相比于其它功能性低聚糖，其有效用量最少，耐酸耐熱，極具市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，因而被廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥、食品、保健品、飼料等領(lǐng)域[3-4]。工業(yè)上的XOS通常為木質(zhì)纖維原料中的木聚糖酶水解所得，然而在酶水解過(guò)程中僅有一部分木聚糖能夠被降解為XOS，剩余的難被降解的木聚糖則成為木聚糖酶水解殘?jiān)Ｈ裟軐⑦@部分木聚糖酶水解殘?jiān)咧祷?，將?huì)大大提高木聚糖的利用率和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值。高溫自水解是一種得率高，無(wú)化學(xué)試劑添加、綠色環(huán)保的XOS生產(chǎn)方法[5-7]，但是高溫自水解液中的木聚糖聚合度分布范圍較廣，除了XOS，還含有較高聚合度(聚合度大于6)的高聚木糖[8-9]。不同聚合度的木聚糖對(duì)益生菌的對(duì)比增殖效果研究報(bào)道較少，益生效果并不明確。因此，需要采用一定的分離手段將不同聚合度范圍的木聚糖進(jìn)行分離，并探究其益生效果。乙醇沉淀分離聚糖工藝成熟，操作簡(jiǎn)便，適合大批量操作，且乙醇少量殘存對(duì)食品級(jí)產(chǎn)品無(wú)影響，在聚糖分離中應(yīng)用較多[10-11]。本研究對(duì)木聚糖酶水解殘?jiān)M(jìn)行高溫自水解，通過(guò)乙醇兩步沉淀分離，獲得XOS和聚合度較高的3種木聚糖組分，以這3種木聚糖組分作碳源增殖青春雙歧桿菌，對(duì)比評(píng)價(jià)其增殖益生效果，以期為進(jìn)一步擴(kuò)大木聚糖的利用提供有效的理論依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

木聚糖酶水解殘?jiān)?，由某生產(chǎn)低聚木糖的公司提供，是玉米秸稈經(jīng)堿抽提、酶水解后未被降解的高聚合度木聚糖，即難被酶水解的高聚木糖。木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)于Megazyme公司；纖維二糖標(biāo)準(zhǔn)品、無(wú)水醋酸鈉、50%氫氧化鈉和木糖標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)于Sigma-Aldrich公司；葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品、糠醛、羥甲基糠醛，均購(gòu)于Fluca公司；甲酸、乙酸、乳酸、丙酸、丁酸和乙醇(純度99.7%)，均為市售分析純。

青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)真空冷凍干燥菌種凍干粉(嚴(yán)格厭氧菌株)，由中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CICC)提供，編號(hào)6070?；罨霸鲋撑囵B(yǎng)基：大豆蛋白胨5 g/L，胰蛋白胨5 g/L，酵母提取物10 g/L，CaCl20.008 g/L，NaCl 0.08 g/L，K2HPO40.04 g/L，KH2PO40.04 g/L，NaHCO30.4 g/L，MgSO40.019 g/L，0.05%L-半胱氨酸鹽酸鹽作為還原劑加入滅過(guò)菌的培養(yǎng)基中。

高壓反應(yīng)釜，大連自控設(shè)備廠；高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Eppendorf公司；Bug Box厭氧培養(yǎng)箱，英國(guó)Ruskinn公司；Agilent 1260型高效液相色譜(HPLC)儀，帶有示差檢測(cè)(RID)，美國(guó)Agilent公司；色譜柱CarboPac PA200(250 mm×3 mm)，色譜保護(hù)柱CarboPac PA200(50 mm×3 mm)，色譜柱Bio-Rad Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm)，色譜保護(hù)柱Bio-Rad Cation H Refill Cartridges(30 mm×4.6 mm)， Chromeleon 6.80色譜工作站，Dionex ICS-3000離子色譜儀，帶有四電位脈沖安培檢測(cè)器(PAD)，美國(guó)Thermo Fisher公司； Ultrahydrogel 120 (300 mm×7.8 mm) 色譜柱和Ultrahydrogel 250 (300 mm×7.8 mm)色譜柱，美國(guó)Waters公司。

1.2 木聚糖酶水解殘?jiān)母邷刈运?/h3>

將131 g木聚糖酶水解殘?jiān)?含木聚糖100 g)與水按1 ∶50(g ∶mL)混合，加入1.0 L高壓反應(yīng)釜，分別在170、180、190和200 ℃條件下保溫20、30、40和50 min。反應(yīng)結(jié)束后在高速冷凍離心機(jī)中于8 000 r/min下離心10 min，取上清液，即為高溫自水解液。

1.3 水解液的乙醇沉淀分離

1.3.1不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇 向高溫自水解液中加入一定量的乙醇，使乙醇最終體積分?jǐn)?shù)分別達(dá)到10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%和90%，置于搖床上，于20 ℃下150 r/min混合15 min，再放于搖床上，20 ℃靜置15 min，于8 000 r/min、20 ℃下離心10 min，收集上清液。沉淀再次分別使用對(duì)應(yīng)沉淀分離時(shí)的乙醇潤(rùn)洗，并重復(fù)上述操作，于8 000 r/min、20 ℃下離心10 min，將沉淀置于凍干機(jī)中去除殘余的乙醇，最后用蒸餾水溶解沉淀并定容至10 mL。

1.3.2兩步沉淀分離 向高溫自水解液中加入乙醇，使乙醇終體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60%，置于搖床上，于20 ℃ 下150 r/min混合15 min，再按1.3.1節(jié)方法得到沉淀及上清液，所得沉淀用蒸餾水溶解，記為樣品S1；向60%乙醇沉淀高溫自水解液離心分離所得上清液中繼續(xù)加入乙醇，使乙醇終體積分?jǐn)?shù)達(dá)到90%，置于搖床上，于20 ℃下150 r/min混合15 min，再按1.3.1節(jié)方法得到沉淀及上清液，所得沉淀用蒸餾水溶解，記為樣品S2，上清液記為樣品S3。

1.4 檢測(cè)分析

1.4.1木聚糖含量的測(cè)定 向木聚糖溶液中加入H2SO4，使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到4%，置于121 ℃高溫滅菌鍋中反應(yīng)1 h，木聚糖降解為木糖[12]。采用帶有示差檢測(cè)(RID)的HPLC儀分析木糖含量，色譜條件：色譜柱Bio-Rad Aminex HPX-87H，色譜保護(hù)柱Bio-Rad Cation H Refill Cartridges，流動(dòng)相0.005 mol/L的H2SO4，流速0.6 mL/min，柱溫55 ℃，上樣量10 μL，外標(biāo)法測(cè)定。

低聚木糖(XOS，聚合度2～6)采用高效陰離子交換色譜法測(cè)定，色譜條件：色譜柱CarboPac PA200(250 mm×3 mm)，色譜保護(hù)柱CarboPac PA200(50 mm×3 mm)，流動(dòng)相100 mmol/L的NaOH與500 mmol/L 的NaAc配比梯度洗脫[13]，流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃，pH-Ag/AgCl復(fù)合參比電極，Chromeleon 6.80色譜工作站。XOS以木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖為外標(biāo)分別測(cè)定其含量，聚合度較高(聚合度大于6)的高聚木糖根據(jù)色譜柱CarboPac PA200的分離原理，按照保留時(shí)間逐漸延遲，可監(jiān)測(cè)各成分的存在及變化情況。各聚糖質(zhì)量濃度分別按以下公式計(jì)算：

C(木聚糖)=(C2-C1)×0.88

C(XOS)=C(木二糖)+C(木三糖)+C(木四糖)+C(木五糖)+C(木六糖)

C(高聚木糖)=C(木聚糖)-C(XOS)

式中：C1—酶解前木糖的質(zhì)量濃度，g/L；C2—酶解后木糖的質(zhì)量濃度，g/L。

1.4.2降解副產(chǎn)物含量的測(cè)定 木聚糖高溫自水解液中甲酸、乙酸、羥甲基糠醛和糠醛的含量采用帶有示差檢測(cè)(RID)的HPLC儀分析，外標(biāo)法測(cè)定，色譜條件同1.4.1節(jié)。

1.4.3低聚木糖聚合度的測(cè)定 乙醇沉淀分離后的樣品S1、S2和S3組分采用Agilent 1260型HPLC儀，以Ultrahydrogel 120和Ultrahydrogel 250色譜柱串聯(lián)，采用相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)342纖維二糖以及Mr分別為1 000、5 000、12 000、25 000和50 000的葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)樣品，測(cè)定各分離組分Mr。色譜條件：流動(dòng)相為去離子水，流速0.6 mL/min，柱溫60 ℃，示差檢測(cè)。低聚木糖的聚合度(Dp)按下式計(jì)算：

五是通過(guò)微博推廣。憑借內(nèi)容短小、發(fā)布快捷的特點(diǎn)，微博成為互聯(lián)網(wǎng)極具影響力的信息發(fā)布平臺(tái)。微博運(yùn)營(yíng)門檻低、信息發(fā)布迅速，是鄉(xiāng)村旅游推廣的有效手段。

Dp=Mr/150

1.5 青春雙歧桿菌的體外增殖

向Bug Box厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)通入混合氣(10%H2、5%CO2及85%N2)以除去箱體內(nèi)的氧氣，在厭氧條件下活化青春雙歧桿菌并進(jìn)行體外增殖?；罨瘯r(shí)以10 g/L葡萄糖為碳源，增殖時(shí)分別以乙醇沉淀分離得到的S1、S2和S3組分為碳源，初始碳源質(zhì)量濃度3 g/L木聚糖。將活化36 h的青春雙歧桿菌種母液轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)初始pH值7.0，控制培養(yǎng)溫度37 ℃，在增殖0、2、4、8、12、24和36 h時(shí)取樣分析。

1.6 增殖效果分析

1.6.1菌體濃度的測(cè)定 吸取青春雙歧桿菌活化36 h的種母液，于3 000 r/min條件下離心10 min，所得菌體先用生理鹽水洗滌3次，再加入無(wú)菌水洗滌2次，最終加入無(wú)菌水混勻，配制不同濃度梯度的菌液，用分光光度計(jì)在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，同時(shí)用紅外水分測(cè)定儀測(cè)定不同濃度菌液烘干后的菌體干質(zhì)量，根據(jù)吸光度和菌體干質(zhì)量繪制菌體質(zhì)量濃度與吸光度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

定時(shí)取樣青春雙歧桿菌增殖液，于8 000 r/min條件離心10 min，所得菌體用生理鹽水洗滌3次，混勻，于600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算增殖后青春雙歧桿菌的菌體質(zhì)量濃度。

1.6.2有機(jī)酸產(chǎn)量的測(cè)定 青春雙歧桿菌增殖過(guò)程代謝產(chǎn)生的乳酸、乙酸、丙酸和丁酸等有機(jī)酸含量采用Agilent 1260型HPLC儀分析，色譜分析條件同1.4.1節(jié)。其中，總有機(jī)酸的含量即為4種有機(jī)酸含量之和。

2 結(jié)果與討論

2.1 高溫自水解液的組分分析

所用原料木聚糖酶水解殘?jiān)煞譃椋耗揪厶?6.61%，葡聚糖10.79%，阿拉伯聚糖3.45%，木質(zhì)素7.26%，灰分0.61%。經(jīng)不同高溫自水解條件所得自水解液中各糖組分及降解副產(chǎn)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)如表1所示。

表1 工藝條件對(duì)高溫自水解液成分的影響Table 1 Effect of process conditions on the composition of autohydrolysate

從表1可以看出，隨著高溫自水解溫度的升高，水解液中XOS和木聚糖含量均呈先上升后下降的趨勢(shì)，然而降解副產(chǎn)物甲酸、乙酸、羥甲基糠醛和糠醛含量則呈逐漸升高的趨勢(shì)。溫度180 ℃，保溫時(shí)間40 min條件下，自水解液中XOS質(zhì)量分?jǐn)?shù)26.54%，木聚糖46.27%，在此條件下所產(chǎn)降解副產(chǎn)物甲酸、乙酸、羥甲基糠醛、糠醛和木糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2.37%、1.08%、0.17%、2.58%和6.64%。繼續(xù)升溫，當(dāng)溫度為190 ℃，保溫時(shí)間30 min時(shí)，自水解液中XOS質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最高，為54.72%，但在此條件下所產(chǎn)降解副產(chǎn)物含量卻增加很多，表明增加反應(yīng)溫度使得XOS含量增加，同時(shí)降解副產(chǎn)物含量也大幅度增加。因此，劇烈的自水解條件將增加降解副產(chǎn)物含量，為后續(xù)產(chǎn)品提純帶來(lái)困難[8-9]。

木糖雖對(duì)雙歧桿菌無(wú)毒害作用，但卻很難被雙歧桿菌所利用，木糖含量高影響低聚木糖產(chǎn)品的純度和品質(zhì)[14]。選擇自水解條件時(shí)，希望得到的XOS含量較高，降解副產(chǎn)物(有害物質(zhì)和木糖)較少，同時(shí)溫度及相應(yīng)的水蒸氣壓力在工業(yè)操作中易于實(shí)現(xiàn)。因此，溫度180 ℃和保溫時(shí)間40 min為合適的自水解條件，此時(shí)高溫自水解液中XOS水解得率為26.54%(基于原料中木聚糖計(jì)算)，XOS占水解液中總木聚糖的57.36%，剩下的42.64%可認(rèn)為是Dp大于6高聚木糖。由此可見(jiàn)，木聚糖經(jīng)高溫自水解所得水解液中低Dp的木聚糖(即XOS)及高Dp的木聚糖含量都比較高，此結(jié)果與Xiao等[12]高溫自水解竹子的研究結(jié)果類似，因此需采取措施進(jìn)一步分離。

2.2 乙醇沉淀分離對(duì)水解液組成的影響

2.2.1乙醇體積分?jǐn)?shù) 將木聚糖酶水解殘?jiān)?80 ℃、40 min高溫自水解，制得的1 L高溫自水解液中含6.03 g XOS和10.52 g木聚糖，通過(guò)不同體積分?jǐn)?shù)乙醇沉淀分離，測(cè)得沉淀和上清液中XOS及木聚糖質(zhì)量如圖1所示。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)自水解液中糖得率的影響Fig.1 Effects of ethanol volume fraction on saccharides yield in autohydrolysates

采用乙醇沉淀多聚糖過(guò)程中，Mr大的聚糖比Mr小的聚糖更難溶解，Song等[15]采用不同濃度的乙醇溶液沉淀分離杉樹(shù)中多聚糖時(shí)也得到相似的結(jié)果，原因可能在于Mr大的聚糖所含單位羥基數(shù)量比Mr小的聚糖所含單位羥基數(shù)量少[16]。為了將Dp范圍廣的高溫自水解液分離為不同Dp范圍的木聚糖組分，一步乙醇沉淀很難實(shí)現(xiàn)，需采用兩步乙醇沉淀的方法。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用乙醇兩步沉淀法對(duì)高溫自水解液進(jìn)行分離。

2.2.2乙醇兩步沉淀分離 分析樣品S1、S2、S3中各糖組分含量及Dp范圍，1 L高溫自水解液中各成分的質(zhì)量可見(jiàn)表2。

表2 乙醇兩步沉淀分離對(duì)高溫自水解液成分的影響(1 L高溫自水解液)Table 2 Effects of two-step ethanol precipitation on the components from autohydrolysates(1 L autohydrdysates)

采用乙醇兩步沉淀分離Dp分布范圍廣的高溫自水解液(Dp為1～146)，得到Dp范圍分別為24～122、7～19和1～6的S1、S2和S3這3種組分，其中木聚糖質(zhì)量各占高溫自水解液中木聚糖質(zhì)量的18.16%、30.70%和51.14%，S3中XOS得率最高，達(dá)87.61%，純度高達(dá)95.91%?？梢?jiàn)分離所得S3的Dp低、得率和純度很高，適于作為產(chǎn)品級(jí)低聚木糖。因此，乙醇兩步沉淀分離能夠很好地實(shí)現(xiàn)不同Dp范圍木聚糖的分離。Swennen等[17]也采用乙醇兩步沉淀方式分離麥粉酶解液獲得不同Dp范圍的木聚糖。

2.2.3離子色譜分析 高溫自水解液及乙醇兩步沉淀分離所得樣品S1、S2和S3的分析譜圖如圖2所示。根據(jù)CarboPac PA200陰離子色譜柱分離聚糖的特性，低聚木糖先出峰，隨著出峰時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，高聚木糖隨后逐漸出峰[18-19]。由圖2(a)可見(jiàn)，高溫自水解液中可檢測(cè)到XOS組分(即圖中X2、X3、X4、X5和X6)，圖中25.351 min及之后出現(xiàn)的色譜峰可推測(cè)為Dp>6的高聚木糖組分。

圖2(b)～圖2(d)顯示，經(jīng)乙醇兩步沉淀分離所得S1、S2和S3樣品中各木聚糖組分的分布情況不同。樣品S3中糖組分主要為XOS，還有一定量的木糖(X1)，出峰時(shí)間較遲、Dp>6的木聚糖組分在S3中幾乎未檢測(cè)到；樣品S2中糖組分出峰時(shí)間主要位于25～31 min，其中27 min附近的色譜峰可認(rèn)為是中等Dp的木聚糖，XOS在S2中含量非常低，只有少量木五糖和木六糖被檢測(cè)到；樣品S1中組分出峰時(shí)間主要位于30 min左右，可認(rèn)為是高聚木糖組分。由此可見(jiàn)，Dp分布范圍廣的高溫自水解液通過(guò)乙醇兩步沉淀分離可得到3種不同的木聚糖組分，分別為XOS(S3)、中等Dp木聚糖(S2)和高Dp木聚糖(S1)，實(shí)現(xiàn)不同Dp范圍木聚糖組分的分離。

X1.木糖xylose； X2.木二糖xylobiose； X3.木三糖xylotriose； X4.木四糖xylotetraose； X5.木五糖xylopentaose； X6.木六糖xylohexaose a.高溫自水解液 autohydrolysates; b.S1; c.S2; d.S3圖2 不同樣品的高效陰離子離子色譜圖Fig.2 HPAEC-PAD chromatograms of different samples

2.3 青春雙歧桿菌的體外增殖效果對(duì)比

葡萄糖是雙歧桿菌最容易利用的碳源，然而葡萄糖進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)到達(dá)消化道時(shí)就被消化酶降解而到達(dá)不了大腸中，其對(duì)存在于大腸內(nèi)的益生菌起不到任何增殖作用，但可用于比較其它木聚糖組分的增殖效果。眾多研究表明，XOS很難被消化道中的消化酶降解而能直接進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)腸道中，在腸道中具有顯著增殖雙歧桿菌的效果[20-22]。將乙醇兩步沉淀分離所得不同聚合度的木聚糖對(duì)青春雙歧桿菌進(jìn)行增殖效果的研究，結(jié)果如表3和圖3所示。

表3 不同碳源增殖青春雙歧桿菌所產(chǎn)有機(jī)酸的含量Table 3 Contents of organic acids in the incubation of B. adolescentis with different carbon sources

續(xù)表3

碳源carbon source增殖時(shí)間/hincubation time乳酸/(g·L-1)lactate acid乙酸/(g·L-1)acetate acid丙酸/(g·L-1)propionate acid丁酸/(g·L-1)butyrate acidS10000.01020.040.030.02040.080.050.02080.110.070.030120.100.060.040240.110.070.040360.110.070.040S20000020.040.030.02040.060.040.02080.080.060.030120.140.070.040240.160.080.040360.170.080.040S30000020.050.050.02040.100.160.04080.210.320.050120.320.670.060240.640.880.090360.900.950.110

從表3可以看出，青春雙歧桿菌代謝葡萄糖、S1、S2和S3所產(chǎn)各有機(jī)酸中，乳酸和乙酸含量都較高，丙酸含量較少，丁酸在發(fā)酵過(guò)程中含量幾乎不變。報(bào)道顯示，益生菌代謝低聚糖產(chǎn)生的乳酸、乙酸、丙酸和丁酸等是主要的短鏈脂肪酸，對(duì)人體的生理功能起重要調(diào)節(jié)作用，具有改善腸功能、促進(jìn)Ca2+吸收、促進(jìn)脂肪代謝和減少患腸癌的風(fēng)險(xiǎn)，其中乙酸影響機(jī)體膽固醇的產(chǎn)生，丙酸和丁酸是機(jī)體能量的重要來(lái)源并調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)[23]。

如圖3所示，葡萄糖增殖青春雙歧桿菌效果最明顯，36 h菌體質(zhì)量濃度達(dá)0.35 g/L，菌體增殖倍數(shù)達(dá)6.60倍，此時(shí)葡萄糖全部被消耗完。S1和S2增殖青春雙歧桿菌效果不明顯，36 h菌體質(zhì)量濃度分別為0.06 和0.08 g/L，菌體增殖倍數(shù)分別為1.13和1.51倍，殘?zhí)橇枯^多，分別為97.16%和93.39%，表明S1和S2較難被青春雙歧桿菌所利用。S3增殖青春雙歧桿菌效果明顯，36 h菌體質(zhì)量濃度為0.25 g/L，菌體增殖倍數(shù)達(dá)4.72倍，殘?zhí)橇繛?3.48%，與增殖效果最優(yōu)的碳源葡萄糖相比，S3增殖效果也很顯著，是一種很好的增殖青春雙歧桿菌的益生元。S1和S2的木聚糖Dp范圍分別為24～122和7～19，Dp較高，難以被青春雙歧桿菌利用，而S3的木聚糖Dp范圍為1～6，Dp較低，很容易被雙歧桿菌利用。Gullón等[24]指出低聚糖的Dp對(duì)益生菌增殖效果起主要作用，Dp越低益生效果越好。這可能與雙歧桿菌能夠分泌β-木糖苷酶但不分泌內(nèi)切木聚糖酶的原因有關(guān)[25]，因而限制了對(duì)高Dp木聚糖的降解和利用。

不同碳源增殖青春雙歧桿菌所產(chǎn)總有機(jī)酸含量不同。葡萄糖為碳源所產(chǎn)總有機(jī)酸含量最高，36 h總有機(jī)酸質(zhì)量濃度達(dá)3.26 g/L，此時(shí)pH值為4.31；乙醇兩步沉淀分離所得組分S1、S2和S3中，低聚合度的S3增殖青春雙歧桿菌所產(chǎn)總有機(jī)酸含量最高，36 h總有機(jī)酸質(zhì)量濃度達(dá)1.96 g/L(pH值5.65)，雖然增殖效果不如葡萄糖，但其總有機(jī)酸產(chǎn)量、菌體增殖倍數(shù)、糖消耗量與以葡萄糖為碳源的產(chǎn)量基本相當(dāng)。聚合度較高的S1和S2增殖青春雙歧桿菌所產(chǎn)總有機(jī)酸質(zhì)量濃度較低，分別為0.22和0.29 g/L。由此可見(jiàn)，S3增殖青春雙歧桿菌效果明顯，而S1和S2幾乎起不到增殖青春雙歧桿菌的效果。

對(duì)比不同Dp范圍木聚糖對(duì)益生菌的增殖效果可以看出，木聚糖酶水解殘?jiān)?80 ℃、40 min條件下高溫自水解得到的水解液經(jīng)乙醇兩步沉淀分離后，上清液S3主要含Dp為2～6的XOS，能被青春雙歧桿菌有效利用，菌體增殖倍數(shù)高，有機(jī)酸產(chǎn)量高，是一種較好的益生元。Dp較高的S1和S2增殖青春雙歧桿菌效果不明顯，菌體濃度及各有機(jī)酸產(chǎn)量均較低。

a.殘?zhí)橇縭esidual sugar content; b.菌體質(zhì)量濃度biomass mass concn.; c.pH值pH value; d.總有機(jī)酸質(zhì)量濃度total organic acid mass concn.圖3 不同碳源對(duì)青春雙歧桿菌增殖效果的影響Fig.3 Effects on the proliferation with B. adolescentis by using different carbon sources

3 結(jié) 論

3.1木聚糖酶水解殘?jiān)诓煌瑮l件下進(jìn)行高溫自水解，選擇180 ℃、40 min為適合的條件，該條件下XOS含量高，降解副產(chǎn)物產(chǎn)量低，高溫自水解液中XOS占水解液中總木聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的57.36%，XOS水解得率為原料中木聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的26.54%，降解副產(chǎn)物(有害物質(zhì))甲酸、乙酸、羥甲基糠醛和糠醛分別為原料中木聚糖質(zhì)量的2.37%、1.08%、0.17%和2.58%。

3.2采用乙醇兩步沉淀方式對(duì)高溫自水解液進(jìn)行分離，得到S1、S2和S3這3種木聚糖組分，其聚合度范圍分別為24～122、 7～19和1～6。高效陰離子交換色譜分析顯示，乙醇兩步沉淀方式可將聚合度范圍廣的高溫自水解液有效地分離。S1為聚合度高的木聚糖組分；S2幾乎不含XOS，為中等聚合度的木聚糖組分；S3主要為聚合度2～6的低聚木糖組分，XOS純度高達(dá)95.91%。

3.3青春雙歧桿菌增殖結(jié)果表明：低聚合度的S3對(duì)青春雙歧桿菌增殖效果最明顯，36 h菌體質(zhì)量濃度為0.25 g/L，菌體增殖倍數(shù)達(dá)4.72倍，殘?zhí)橇繛?3.48%，總有機(jī)酸質(zhì)量濃度達(dá)1.96 g/L，乳酸、乙酸和丙酸質(zhì)量濃度分別為0.90、 0.95和0.11 g/L，丁酸未檢測(cè)到，此時(shí)pH值為5.65。中等聚合度木聚糖組分S2和高聚合度木聚糖組分S1很難被青春雙歧桿菌所利用，增殖效果不明顯。