維生素C在急性大劑量乙醇攝入后顱腦損傷中作用的研究

伍宵 高飛 董金千 茆翔 劉佰運(yùn)

在發(fā)達(dá)和發(fā)展中國(guó)家，顱腦損傷（traumatic brain injury，TBI）仍然是導(dǎo)致死亡和殘疾的主要原因之一[1-3]。研究證實(shí)，飲酒是加重TBI后繼發(fā)性腦損傷的重要危險(xiǎn)因素[4-6]。眾所周知，TBI后活性氧（reactive oxygen species，ROS）與腦水腫密切相關(guān)，而TBI前的乙醇攝入會(huì)產(chǎn)生更多的ROS并降低抗氧化活性。這些研究均表明，抗氧化劑可能會(huì)預(yù)防或延緩攝入乙醇后的TBI引起的繼發(fā)腦損傷，而維生素C（vitamin C，VitC）的抗氧化作用在許多體外實(shí)驗(yàn)中已得到證實(shí)[7-9]。本課題組的前期工作證實(shí)，急性乙醇攝入會(huì)通過水通道蛋白-4抗體（aquaporin-4，AQP-4）的過表達(dá)加劇細(xì)胞毒性腦水腫，并且VitC在治療急性TBI中起保護(hù)作用[4]。已知細(xì)胞色素P450（cytochrome，CYPs）可代謝肝臟中的乙醇，并且細(xì)胞色素P4502E1抗體（cytochrome P4502E1，CYP2E1）在乙醇相關(guān)的神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激中也起著重要作用[10]。本實(shí)驗(yàn)使用VitC對(duì)乙醇后的TBI大鼠進(jìn)行干預(yù)，以期探究VitC的作用及其可能存在的機(jī)制。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

VitC（純度＞99%，Sigma，美國(guó)），溶解于生理鹽水中。于注射前配制注射用藥；10%水合氯醛；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（北京碧云天科技有限公司）；AQP-4（ab9512，Abcam公司，英國(guó)）；基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）抗 體（ab38899，Abcam公司，英國(guó)）；緊密連接蛋白Occludin抗體（ab31721，Abcam公司，英國(guó)）；CYP2E1（ab28146，Abcam公司，英國(guó)）。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：40只成年雄性SD大鼠（285～305 g/只）購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.實(shí)驗(yàn)分組：所有的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理都得到了安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的授權(quán)，符合動(dòng)物倫理。實(shí)驗(yàn)大鼠自由飼養(yǎng)在動(dòng)物籠中，室溫為24℃。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分成4組，每組10只，于打擊前1 h分別腹腔注射3 g/kg乙醇（10 mL/kg）或同等劑量的生理鹽水：打擊+生理鹽水組（TBI+only）、打擊+乙醇+生理鹽水組（TBI+EtOH）、打擊+VitC組（TBI+VitC）、打擊+乙醇+VitC組（TBI+EtOH+VitC）。本課題組前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)VitC對(duì)假手術(shù)組大鼠不產(chǎn)生影響，并且VitC具有量效關(guān)系，因此假手術(shù)組的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并未列出[9]。本實(shí)驗(yàn)的VitC劑量為600 mg/kg。于打擊后24 h測(cè)定神經(jīng)功能評(píng)分、腦水腫、血腦屏障完整性，以及AQP-4、MMP-9和Occludin表達(dá)量。

2.可控性皮層打擊：實(shí)驗(yàn)大鼠用10%的水合氯醛麻醉（400 mg/kg），并使用本課題組實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)的CCI打擊器[11]。連續(xù)監(jiān)測(cè)直腸內(nèi)溫度保持實(shí)驗(yàn)大鼠體溫為37℃±0.5℃。實(shí)驗(yàn)大鼠固定于立體定向儀上。正中剪開皮毛，在右側(cè)冠狀縫前，中線旁1 mm，磨開一大小為6 mm×6 mm的骨窗。打擊儀（PCI 3000，Hatteras Instruments，Inc.，美國(guó)）使用的打擊參數(shù)為：速度：2.0 m/s，打擊深度：2.5 mm，接觸時(shí)間：150 ms，使用的打擊頭直徑為4 mm。打擊后，使用骨蠟將骨瓣回納（圖1），絲線縫合頭皮。不同實(shí)驗(yàn)組在打擊后15 min和6 h給藥，腹腔內(nèi)注射生理鹽水或VitC。

圖1 打擊區(qū)域示意圖及骨蠟封閉骨瓣示意圖

3.神經(jīng)功能評(píng)估：神經(jīng)功能評(píng)估實(shí)施于打擊后24 h。使用通用的16分神經(jīng)功能評(píng)分量表。

4.腦水腫的測(cè)定：測(cè)定腦的含水量。利用干濕稱質(zhì)量法測(cè)量打擊側(cè)大鼠大腦半球的含水量從而測(cè)定腦水腫程度。大鼠在打擊后24 h處死，右側(cè)大腦半球測(cè)量質(zhì)量獲得濕質(zhì)量。腦組織置于120℃烤箱中烘烤24 h，獲得干質(zhì)量。腦組織含水量的計(jì)算公式：（濕質(zhì)量-干質(zhì)量）/濕質(zhì)量×100%。

5.血腦屏障完整性的測(cè)定：通過測(cè)定伊文氏藍(lán)在腦內(nèi)的含量而測(cè)定血腦屏障完整性，2%的伊文氏藍(lán)在打擊后22 h通過大鼠股靜脈注射入體內(nèi)，劑量為4 mg/kg，平衡2 h之后，實(shí)驗(yàn)大鼠被灌注處死，分離左右大腦半球。打擊側(cè)大腦半球放置于5 mL的甲酰胺中室溫下萃取3 d。萃取液在12 000 g下離心15 min，清液上機(jī)利用分光光度計(jì)測(cè)量，激發(fā)光波長(zhǎng)為620 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為680 nm。腦組織置于120℃烤箱中烘烤24 h。伊文氏藍(lán)含量表達(dá)單位為μg/g。

6.免疫印跡：分離打擊側(cè)的皮層組織，使用RIPA裂解液勻漿（50 mmol/L Tris，pH 7.0，150 mmol/L NaCl，1%Triton X-100）。在4℃勻漿30 min，12000 g離心20 min。加入等量的蛋白，SDS-PAGE膠孔中，以80 V恒壓電泳，至蛋白Marker跑至凝膠下緣時(shí)停止，并轉(zhuǎn)膜。洗膜，5%牛奶封閉2 h，4℃過夜孵育抗體：抗AQP-4抗體（1∶500；Abcam，Cambridge，英國(guó)），抗MMP-9抗體（1∶1000；Abcam，Cambridge，英國(guó)），抗Occludin抗體（1∶250；Abcam，Cambridge，英國(guó)），抗Cytochrome P4502E1抗體（1 ∶5000；Abcam，Cambridge，英國(guó)）。TBST洗膜3次，每次15 min；室溫下孵育二抗1 h。而后TBST洗膜3次，每次15 min；使用Bio-Rad Quantity One成像系統(tǒng)化學(xué)發(fā)光成像。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graphpad8.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，3組間比較采用單因素方差分析（F檢驗(yàn)）；組間兩兩比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、4組大鼠TBI后24 h的神經(jīng)功能損傷評(píng)分、腦含水量及伊文氏藍(lán)含量

打擊24 h后，相比TBI-only組，TBI+EtOH組的神經(jīng)功能損傷評(píng)分、腦含水量和伊文氏藍(lán)含量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而與TBI+EtOH組相比，TBI+VitC組、TBI+EtOH+VitC組的神經(jīng)功能損傷評(píng)分、腦含水量和伊文氏藍(lán)含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與TBI+VitC組相比，TBI+EtOH+VitC組的腦含水量和伊文氏藍(lán)含量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1）。伊文氏藍(lán)在腦組織中大體病理學(xué)示意圖見圖2。

表1 顱腦損傷24 h后各組大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分、腦含水量及伊文氏藍(lán)含量的表達(dá)水平比較

圖2 顱腦損傷后24 h伊文氏藍(lán)在腦組織中大體病理學(xué)示意圖

二、4組 大 鼠TBI后24 h的MMP-9、AQP-4、CYP2E1及Occludin的含量

打擊24 h后，與TBI-only組相比，TBI+EtOH組的MMP-9和AQP-4蛋白表達(dá)量明顯升高，Occludin蛋白表達(dá)量明顯減少；而TBI+VitC組和TBI+EtOH+VitC組MMP-9和AQP-4蛋白表達(dá)量明顯減少，Occludin蛋白表達(dá)量明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與TBI+EtOH組相比，TBI+EtOH+VitC組MMP-9和AQP-4蛋白表達(dá)量明顯降低，Occludin蛋白表達(dá)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與TBI+EtOH組相比，TBI+EtOH+VitC組CYP2E1表達(dá)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。詳細(xì)信息見圖3。

圖3 MMP-9、AQP-4、CYP2E1和Occludin在不同分組中的蛋白表達(dá)量

討論

TBI的致殘和致死率在各類創(chuàng)傷中居第一位，給社會(huì)帶來了巨大的負(fù)擔(dān)，尤其乙醇后相關(guān)的TBI，治療效果差，死亡率高，預(yù)后差，社會(huì)負(fù)擔(dān)較重。目前國(guó)際對(duì)此類研究還偏重于臨床研究，基礎(chǔ)研究較少，尤其很少涉及有關(guān)乙醇后相關(guān)的TBI干預(yù)的系統(tǒng)性基礎(chǔ)性研究。醉酒容易情緒激動(dòng)，易發(fā)生酒后駕車、挑釁斗毆等傷害性事件，醉酒患者受傷后因缺乏自我保護(hù)，可能導(dǎo)致二次傷害造成合并傷，即使是較輕的TBI也將導(dǎo)致顱內(nèi)不可逆的嚴(yán)重?fù)p傷。因此研究乙醇后TBI后的繼發(fā)性腦損傷及保護(hù)作用就顯得尤為重要[5,11,12]。

本課題組的前期實(shí)驗(yàn)已表明VitC在治療TBI中有保護(hù)作用[8,9]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，打擊24 h后，TBI+EtOH組的神經(jīng)功能損傷評(píng)分、腦含水量和伊文氏藍(lán)含量明顯增加，VitC干預(yù)后，各項(xiàng)指標(biāo)明顯減少，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與TBI+EtOH組相比，TBI+EtOH+VitC組的CYP2E1表達(dá)減少，AQP-4和MMP-9的含量降低，Occludin含量增高，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此實(shí)驗(yàn)采用各種行為學(xué)及指標(biāo)，系統(tǒng)地闡述了VitC在治療此類復(fù)雜TBI患者中的潛在優(yōu)勢(shì)。前期工作已表明急性攝入高劑量乙醇后，TBI大鼠中AQP4的表達(dá)水平顯著上調(diào)，乙醇加劇了TBI后的細(xì)胞毒性腦水腫，與缺氧誘導(dǎo)因子-1的表達(dá)量增加有關(guān)[4]。

VitC是一種抗氧化劑，可以保護(hù)其他抗氧化劑，防止自由基對(duì)人體的傷害[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，急性乙醇攝入加劇了TBI后細(xì)胞毒性腦水腫，CYP2E1表達(dá)明顯增加，而在給予VitC后，大鼠的CYP2E1表達(dá)減少。基于以上結(jié)果，可以猜測(cè)VitC中可能含有CYP2E1抑制物，可通過P450減少AQP-4和MMP-9的激活，增加Occludin蛋白的表達(dá)，降低血腦屏障緊密連接的分解及完整性的破壞，減少血腦屏障的開放及減輕腦水腫。MMP-9是一種可以選擇性降解細(xì)胞外基質(zhì)的內(nèi)肽酶以及細(xì)胞基底層等細(xì)胞外基膜的蛋白酶體，其過表達(dá)不僅加劇血腦屏障的破壞，而且加劇腦水腫程度[6,12-14]。AQP-4的表達(dá)量與腦水腫的產(chǎn)生及程度密切相關(guān)。AQP-4蛋白的增加，不僅加重了腦水腫，而且導(dǎo)致血腦屏障結(jié)構(gòu)進(jìn)一步被破壞，加重繼發(fā)性腦損傷[4,12]。Occludin蛋白是一種存在于腦內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接跨膜蛋白，作用是維持緊密連接復(fù)合體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，而這種緊密連接復(fù)合體也是血腦屏障的核心結(jié)構(gòu)[12,13,15]。在TBI中，CYP2E1的存在導(dǎo)致產(chǎn)生更多的氧自由基，進(jìn)一步加重了繼發(fā)性腦損傷。乙醇和TBI均能加重這一系列破壞過程[16]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，給予VitC治療后，通過干擾CYP2E1的表達(dá)，從而改變了乙醇相關(guān)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少了血腦屏障的破壞，減少了腦水腫，減緩了神經(jīng)元的死亡，減輕了乙醇后TBI后繼發(fā)性腦損傷的進(jìn)一步發(fā)展，最終促進(jìn)了神經(jīng)功能的恢復(fù)。

綜上所述，急性乙醇攝入加劇了TBI后細(xì)胞毒性腦水腫，而VitC可通過P450減少AQP-4和MMP-9的激活，增加Occludin蛋白的表達(dá)，減少血腦屏障緊密連接的分解及完整性的破壞，降低血腦屏障的開放及減輕腦水腫，最終改善神經(jīng)功能，這將對(duì)乙醇如何增強(qiáng)TBI后腦水腫并確定潛在治療靶點(diǎn)提供了更好的理解，并發(fā)現(xiàn)了VitC在治療這一系列急重癥中的前景。