基于NOTA 的重金屬鉛人工抗原的合成與鑒定

翟 璐 郭建軍 桑麗雅 金仁耀* 廖 杰

（1 浙江工商大學海洋食品研究院 杭州 310012 2 浙江省水產品加工技術研究聯(lián)合重點實驗室 杭州 310012 3 海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 浙江工商大學 杭州 310012 4 杭州南開日新生物技術有限公司 杭州 310051 5 浙江華才檢測技術有限公司 浙江諸暨 311800）

隨著工業(yè)化發(fā)展水平的不斷提升，向環(huán)境中排放的工業(yè)污染物不斷增多，重金屬就是其中的重要污染物之一。由于重金屬具有易富集、難降解等特性，對環(huán)境和食品質量的安全風險越來越大[1]。重金屬分布廣泛、難以降解，并且可以經(jīng)空氣、水和食物鏈等途徑在人體中富集，當超過人體耐受極限值后容易引起嚴重的急慢性中毒，具有明顯的致癌、致畸及致突特性，并有很強的生殖和遺傳毒性[2-3]。隨著人們對重金屬危害認識的提升，如何有效控制重金屬的危害成為目前研究的重點，特別是開展如何減少重金屬的污染、提高重金屬的降解和治理效果等更是研究的熱點。為了摸清環(huán)境中重金屬殘留和降解的動態(tài)分布規(guī)律，準確評價重金屬污染的危害程度，有必要加強重金屬的研究，特別是開展重金屬的快速、準確和高靈敏檢測技術研究，可為今后開展重金屬污染監(jiān)控和治理提供有力的技術支撐。

當前針對重金屬檢測最常用的技術主要是陽極溶出伏安法（ASV）[4]、原子吸收光譜分析（AAS）[5-6]、電感耦合等離子發(fā)射光譜（ICP-AES）[7-8]、液相色譜法[9-10]和其它色譜-質譜等聯(lián)用技術。雖然這些手段技術成熟，市場應用廣泛，但這些分析技術也存在一些明顯的不足，主要表現(xiàn)為分析儀器貴重，檢測成本高，操作人員要求專業(yè)培訓，樣品前處理過程中常使用強酸、強堿等試劑，樣品分析時間長，不能大批量同時檢測，只能在專業(yè)實驗室中分析檢測等，不能滿足現(xiàn)場的快速、大批量檢測需求。免疫分析技術具有儀器簡便，人員操作簡單，樣品前處理簡單，分析時間短，可高通量現(xiàn)場檢測，檢測成本低及分析靈明度和準確率理想等優(yōu)勢，已成為目前最具競爭性和市場前景的檢測分析技術之一，并得到廣泛開發(fā)和推廣應用。

國外針對重金屬離子的免疫分析技術研究最早要追溯到20 世紀80 年代，如1985 年Reardan等[11]首次將重金屬In3＋和EDTA 螯合物制備完全抗原，并成功制備多克隆抗體，開啟了重金屬免疫檢測技術研究。隨后國內快速興起了采用免疫分析技術進行重金檢測的研究，先后合成制備了重金屬Hg2+、Pb2+、Cd2+和Pb2+的人工抗原和特異性抗體，并在此基礎上建立了相應的免疫分析方法[12-16]。

重金屬離子結構極其簡單，且沒有活性基團，只有與雙功能螯合劑螯合后，再與載體蛋白連接制備的復合物才具有免疫活性，才能篩選制備相應的抗重金屬抗體。從現(xiàn)有研究報道來看，在制備重金屬離子制備人工抗原過程中涉及的雙功能螯合劑主要為DTPA、EDTA 和ITCBE 等的結構衍生物[17-20]，這些螯合物在結構上屬于直鏈開環(huán)結構，螯合劑結構中的多齒配體端與重金屬離子螯合形成螯合復合物，氨基或羧基等活性基團端與載體蛋白偶聯(lián)后制備人工抗原，并在此基礎上制備多克隆或單克隆抗體，后續(xù)建立免疫分析方法用于重金屬檢測。

與所述研究報道不同，本研究選用的雙功能螯合劑2-S-（4-氨基苯）-1，4，7 三氮雜環(huán)壬烷-1，4，7-三乙酸（P-NH2-Bn-NOTA，以下簡稱NOTA）在結構上屬于閉環(huán)結構，以重金屬鉛為研究對象，采用半抗原、完全抗原和多克隆抗體的制備技術，參考本實驗室前期發(fā)表的論文中相關技術路線和手段[21]，通過合成重金屬Pb2+人工抗原，制備兔克隆抗體，建立免疫分析方法來評價人工抗原和抗體特性，研究閉環(huán)結構雙功能螯合劑在制備重金屬離子抗體中的效果，為今后優(yōu)化重金屬離子人工抗原技術方案和完善重金屬抗體制備體系提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HRP 標記羊抗兔酶標二抗、雞卵清蛋白（OVA）、牛血清白蛋白（BSA），美國Sigma 公司；四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、硝酸鉛水合物（99.99%）、Cu2+標準溶液、Zn2+標準溶液、Cd2+標準溶液、Fe2+鐵離子標準溶液、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、吐溫-20，上海阿拉丁公司；2-S-（4-氨基苯）-1，4，7 三氮雜環(huán)壬烷-1，4，7-三乙酸（P-NH2-Bn-NOTA），美國AREVA MED 公司；超濾離心管（Amicon Ultra-15，30KD），美國密理博公司；Bardford 蛋白濃度測定試劑盒，江蘇碧云天；96 孔酶標板，廣州潔特；其它試劑市售所得，均為AR 級。

1.2 儀器與設備

Fresco 21 型離心機、紫外分光度計，美國熱電公司；萬分之一分析天平，德國賽多利斯公司；超純水制備儀，美國密理博公司；移液器，德國艾本德公司；自動洗板機，美國分子設備公司；電泳儀、酶標儀，美國伯樂公司。

1.3 動物實驗

動物飼養(yǎng)、動物免疫和采血等在浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心完成。

1.4 方法

1.4.1 人工抗原的合成 采用戊二醛法[21]合成免疫原Pb-NOTA-BSA。技術路線見圖1。具體試驗步驟如下：

配制NOTA 螯合劑溶液，稱取7.5 mg NOTA，用0.01 mol/L，pH 7.4 N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸（HEPES）溶液2 mL 充分溶解，此反應液為A液；

配制7.5×10-2mol/L 的硝酸鉛溶液，稱取124.2 mg 硝酸鉛，用5 mL 超純水充分溶解，此反應液為B 液；

吸取上述配制好的硝酸鉛溶液170 μL 逐滴加入到NOTA 螯合劑溶液中，室溫避光緩慢攪拌4 h 后逐滴加入20 mmol/L 的戊二醛溶液600 μL，室溫避光條件下攪拌反應12～14 h 為重金屬螯合劑復合物；

稱取30 mg BSA 溶解于3 mL HEPES 中，逐滴加入反應好的重金屬螯合劑復合物，室溫下避光攪拌反應24 h，反應結束后將反應液裝入8 ku的透析袋，用0.01 mol/L，pH 7.4 HEPES 透析1 d。期間更換透析液4 次，然后反應液再用30 ku的超濾離心管8 000 r/min 離心4 次，后用0.01 mol/L，pH 7.4 的HEPES 溶液5 mL 充分溶解分裝后置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。包被原Pb-NOTA-OVA的合成方法與合成步驟同上，區(qū)別在于BSA 代替OVA。

圖1 鉛人工抗原合成路線Fig.1 Reaction schemes of synthesis for artificial antigen of heavy metal Pb2+

1.4.2 人工抗原的鑒定 金屬-螯合劑復合物及人工抗原的合成效果鑒定采用紫外掃描法和SDS-PAGE 法進行。紫外掃描方案：將Pb-NOTA、OVA、BSA、包被抗原Pb-NOTA-OVA 和免疫抗原Pb-NOTA-BSA 先在不同濃度下進行預掃描，后配制合適濃度的溶液在紫外分光光度計中測定200～400 nm 波長范圍內的吸光度，根據(jù)不同波長的吸光值建立吸收曲線，通過對比最大吸收峰所在的波長數(shù)值位移變化程度來判定合成試驗效果。SDS-PAGE 電泳方案：濃縮膠選擇體積分數(shù)5%，濃縮膠電壓75 V，分離膠選擇體積分數(shù)10%，分離膠電壓100 V，樣品上樣量為每孔10 μL，考馬斯亮藍染色1 h，在搖床上脫色4 次后，將電泳膠放入凝膠成像儀中拍照分析。

1.4.3 人工抗原結合比的測定 將制備好的人工抗原分別測定其載體蛋白濃度和重金屬離子濃度，然后將測定含量轉化為摩爾濃度后進行比較，即可測定出每個載體蛋白偶聯(lián)的重金屬離子數(shù)量。蛋白濃度采用商品化的BCA 蛋白測定試劑盒測定，Pb2+離子濃度采用電感耦合等離子質譜（ICP-MS）測定。

1.4.4 多克隆抗體的免疫 選取3 只體重為2.5 kg 左右的新西蘭大白兔，以Pb-NOTA-BSA 為免疫原免疫兔子。免疫方案和免疫劑量見表1。

表1 免疫原Pb-NOTA-BSA 免疫方案Table 1 The immune protocol of immunogen Pb-NOTA-BSA

從第2 次加強免疫7 d 的兔耳靜脈采1 mL血吸入EP 管中，在6 000 r/min 條件下離心10 min 后取上清10 μL 加入到2 mL 的pH 7.4，0.01 mol/L 的PBS 緩沖液中，后繼續(xù)用該緩沖液進行倍比稀釋抗體效價，陰性對照則選用未免疫兔子血清或初免之前采集的兔子血清，選擇檢測血清與陰性對照血清OD450值的比值大于2.1 所在最大稀釋倍數(shù)為效價指標。當抗體效價與前次免疫檢測效價值變化不明顯則表明可以進行末次免疫?？贵w效價測定采用ELISA 方法進行，具體步驟如下：

1）包被：pH 9.6，0.05 mol/L CBS 為包被緩沖液，包被原Pb-NOTA-OVA 質量濃度為10 μg/mL，包被量為100 μL/孔，37 ℃包被2 h，洗板4次，吸水紙上拍干；

2）封閉：每孔加入2%脫脂牛奶300 μL，置于37 ℃培養(yǎng)箱中反應30 min，洗板4 次，吸水紙上拍干；

3）加一抗：一抗起始濃度為200 倍稀釋液，后倍比稀釋11 個梯度和1 個陰性對照，每孔加100 μL，每濃度4 孔，置于37 ℃培養(yǎng)箱中反應1 h，洗板4 次，吸水紙上拍干；

4）加酶標二抗：每孔加入10 000 倍稀釋的HRP 標記的羊抗兔二抗100 μL，37 ℃反應1 h，洗板4 次，吸水紙上拍干；

5）加底物顯色：每孔加入100 μL TMB 底物緩沖液，37 ℃反應20 min；

6）加硫酸終止反應：在底物液基礎上加入2 mol/L 硫酸50 μL/孔，后讀取OD450值并進行計算分析。

1.4.5 多克隆抗體的提取與純化 采血收集的抗血清按照辛酸-硫酸銨法[22]純化，具體純化步驟為：

1）抗血清用60 mmol/L pH 4.0 的醋酸鹽緩沖溶液稀釋，其血清與醋酸鹽緩沖液稀釋體積比為1∶4，混勻后再用0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液調pH 值至4.5；

2）按照每1 mL 血清滴加75 μL 辛酸的比例逐滴加入，室溫下磁力攪拌反應30 min，置于4 ℃冰箱2 h，10 000 r/min 離心30 min；

3）離心后上清用定性濾紙過濾，上清用10倍體積的0.1 mol/L PBS 稀釋，攪拌混勻后用1 mol/L 氫氧化鈉溶液調節(jié)pH 值至7.4，置于4 ℃冰箱中30 min 預冷；

4）按照每1 mL 混合液加入0.277 g 硫酸銨比率在磁力攪拌下分批加入，加完后繼續(xù)攪拌反應30 min，置于4 ℃冰箱中靜置3 h，12 000 r/min 離心30 min，棄上清；

5）剩余沉淀用5～10 mL 0.01 mol/L PBS 溶解后裝入8 ku 透析袋中透析以去除辛酸、硫酸銨等，透析液選用pH 7.4，0.01 mol/L 的PBS，在4℃冰箱中透析2 d，中間更換透析液4～6 次，透析完全后將透析袋內溶液分裝后置于-20 ℃冷凍，冷凍干燥制備抗體凍干粉。

1.4.6 多克隆抗體的效價測定 效價測定方法與1.4.4 節(jié)所述一致，不同點在于將抗體凍干粉代替抗血清。

1.4.7 抗體標準曲線的建立 通過正交試驗確定抗原抗體最佳工作濃度，采用間接競爭-ELISA 試驗建立標準曲線，具體試驗步驟如下：

1）包被：用pH 9.6，0.05 mol/L CBS 稀釋適當濃度的包被原Pb-NOTA-OVA 后加入酶標板，每孔100 μL，置于37 ℃培養(yǎng)箱中反應2 h，洗板4 次后拍干；

2）封閉：每孔加入250 μL，2%脫脂牛奶封閉，置于37 ℃培養(yǎng)箱中反應30 min，洗板4 次后拍干；

3）樣品前處理：不同濃度梯度重金屬鉛離子標樣與5 mmol/L NOTA 按照1∶1 比例預混均勻，置于37 ℃培養(yǎng)箱中反應2 h；

4）加樣：每孔分別加入50 μL 預混好的樣品和2 倍工作濃度一抗，微量振蕩器上混勻后置于37 ℃培養(yǎng)箱中反應1 h，洗板4 次后拍干；

5）加酶標二抗：每孔加入10 000 倍稀釋的羊抗兔HRP 標記二抗100 μL，置于37 ℃培養(yǎng)箱中反應1 h，洗板4 次后拍干；

6）加底物顯色：每孔加入100 μL TMB 底物緩沖液，置于37 ℃培養(yǎng)箱中反應15 min；

7）加硫酸終止反應：每孔加入2 mol/L 硫酸50 μL，讀取OD450值進行計算分析。

1.4.8 抗體特異性測定 采用間接競爭-ELISA法進行交叉反應率測定。具體試驗步驟與1.4.5 節(jié)所述一致，不同點在于用其它重金屬離子代替銅離子進行ic-ELISA 檢測，建立標準曲線，并計算IC50值，然后根據(jù)公式：CR（%）=IC50（銅離子）/IC50（待測重金屬）×100，測定交叉反應率結果，評價抗體的特異性。

2 結果與分析

2.1 人工抗原合成的鑒定

根據(jù)圖2 的紫外掃描結果顯示，制備的包被抗原（Pb-NOTA-OVA）和免疫抗原（Pb-NOTABSA）最大吸收波長發(fā)生位移改變，初步說明載體蛋白上成功偶聯(lián)上了雙功能螯合劑和鉛離子。

人工抗原SDS-PAGE 電泳結果如圖3 所示。從圖中可知，與BSA 和OVA 相比，免疫抗原（Pb-NOTA-BSA）與包被抗原（Pb-NOTA-OVA）電泳條帶出現(xiàn)明顯滯后現(xiàn)象，說明制備的2 種人工抗原的分子質量均分別比BSA 和OVA 大，說明一定數(shù)量的重金屬螯合物連接到載體蛋白上，進一步證明偶聯(lián)成功。

2.1.1 人工抗原結合比的測定 制備的人工抗原進行結合比測定，蛋白濃度測定采用Bradford 法試劑盒進行檢測，重金屬離子含量采用ICP-MS法進行測定，通過測定蛋白濃度和重金屬離子濃度計算免疫原和包被原的結合比分別為9∶1 和7∶1，說明人工抗原合成成功。

圖2 鉛人工抗原紫外掃描圖Fig.2 UV spectrum of Pb artificial antigen

圖3 鉛人工抗原的SDS-PAGE 電泳圖Fig.3 The SDS-PAGE of Pb artificial antigen

2.1.2 抗體效價測定 經(jīng)ic-ELISA 方法測定，免疫的3 只兔子所制備的多克隆抗體的效價從低到高分別為16 000∶1、32 000∶1 和45 000∶1，說明制備的抗原效果好，動物免疫應答強烈，制備獲得理想的多克隆抗體，選用45 000∶1 效價的多克隆抗體進行后續(xù)試驗。

2.1.3 標準曲線的建立 經(jīng)測定，包被抗原和一抗的工作質量濃度分別為1.5 μg/mL 和2.2 μg/mL，并在此工作質量濃度下建立ic-ELISA 標準曲線（圖4），經(jīng)擬合曲線回歸方程為y=12.127ln（x）-11.386（R2=0.9961），其IC50和IC20值分別為157.89 ng/mL 和13.30 ng/mL。

2.1.4 抗體交叉反應率測定 用間接競爭ELISA檢測其它重金屬離子的IC50值（表2），除了與Cd2+的交叉反應率達到12.3%外，與其它重金屬離子的CR 值均低于5.3%，說明制備的抗重金屬鉛離子多克隆抗體的特異性較理想。

圖4 間接競爭ic-ELISA 抑制率標準曲線Fig.4 Inhibition reaction of indirect competitive ELISA

3 結論

本試驗以NOTA 和Pb2+為研究對象，采用戊二醛法成功制備了免疫抗原（Pb-NOTA-BSA）與包被抗原（Pb-NOTA-OVA），通過動物免疫，抗血清的采集、純化和鑒定獲得優(yōu)質抗重金屬鉛的兔多克隆抗體，并在此基礎上建立了ic-ELISA 分析方法，線性回歸方程為y=12.127ln（x）-11.386（R2=0.9961），IC50和IC20分別為157.89 ng/mL 和13.30 ng/mL。除與Cd2+的CR 值達到12.3%外，與其它重金屬離子的CR 值均較低，說明成功制備了抗重金屬鉛的多克隆抗體，試驗結果為閉環(huán)結構雙功能螯合劑在重金屬制備抗體中的可行性提供了技術參考，為后續(xù)開展重金屬離子單、多克隆抗體制備及免疫分析技術研究提供技術依據(jù)。

表2 多克隆抗體與重金屬離子的交叉反應Table 2 Cross reactivity of polyclonal antibody for heavy metal ion