LCST 型離子液體-鹽雙水相體系提取蝦青素

張莉莉 高 靜，2，3* 魏媛儀 聶芳紅 吉宏武，2，3 劉書(shū)成，2，3 毛偉杰，2，3

（1 廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院 廣東湛江 524088 2 水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東湛江 524088 3 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東湛江 524088）

蝦青素（3，3′-二羥基-4，4′-二酮基-β，β′-胡蘿卜素）分子結(jié)構(gòu)紫羅酮環(huán)上的羥基和酮基使其具有突出的抗氧化活性[1-2]。此外，蝦青素還具有抗脂質(zhì)過(guò)氧化[3-4]，免疫調(diào)節(jié)[5]，抗癌變[6-7]及心血管疾病預(yù)防[8]等生理功能。然而，化學(xué)合成的蝦青素存在生產(chǎn)成本高、安全風(fēng)險(xiǎn)大以及潛在的環(huán)境問(wèn)題。從生物資源中獲取天然蝦青素的研究日益受到重視。雨生紅球藻富含蝦青素，然而，其細(xì)胞壁對(duì)外界的生物或化學(xué)作用具有一定抵抗力，使得蝦青素的提取難度增大[9]。常見(jiàn)的提取方法包括油溶法[10]、有機(jī)溶劑法[11]以及超臨界流體法[12]。油溶法提取蝦青素耗時(shí)長(zhǎng)且提取溫度高，不利于保持蝦青素的穩(wěn)定性。有機(jī)溶劑法存在較大的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，而超臨界萃取操作復(fù)雜，對(duì)設(shè)備要求高。從雨生紅球藻中獲取蝦青素往往采用機(jī)械破壁或化學(xué)破壁，之后采用有機(jī)試劑提取[13-14]。分步提取法不僅工藝復(fù)雜，而且不利于操作者的健康。探索一步法實(shí)現(xiàn)對(duì)雨生紅球藻的高效破壁和蝦青素的提取十分重要。

離子液體（Ionic liquids，ILs）通常由不對(duì)稱的有機(jī)陽(yáng)離子和有機(jī)或無(wú)機(jī)陰離子組成，具有溶解能力強(qiáng)、熔點(diǎn)低、熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)，離子液體作為有機(jī)溶劑（丙酮等）的助劑已成功應(yīng)用于蝦青素的提取[15-18]。如何減少使用或者不使用有機(jī)試劑，建立更加綠色的蝦青素提取技術(shù)和理論，是提取天然蝦青素及其應(yīng)用研究亟待解決的基礎(chǔ)科學(xué)問(wèn)題。雙水相體系利用生物分子在互不相溶的兩水相間分配系數(shù)的差異進(jìn)行萃取[19-20]。近年來(lái)，離子液體參與構(gòu)筑的新型雙水相體系因具有環(huán)境友好，分離條件溫和，能耗低且生物相容性高等優(yōu)點(diǎn)，在生物分子萃取領(lǐng)域得到廣泛關(guān)注[21-24]。

離子液體的結(jié)構(gòu)、鹽離子的水合吉布斯自由能、溶液pH 值和環(huán)境溫度是影響離子液體-鹽雙水相體系形成及生物分子在兩相間遷移的重要因素[25-27]。其中，溫度對(duì)離子液體-鹽雙水相體系的作用復(fù)雜，始終存在爭(zhēng)議。一方面，以Zafarani-Moattar 等[28]為代表的學(xué)者認(rèn)為溫度對(duì)離子液體-鹽雙水相體系的作用并不顯著，有關(guān)離子液體-鹽雙水相的許多萃取研究是在恒定溫度下進(jìn)行的[29-30]。另一方面，Sadeghi 等[31]指出，離子液體-鹽雙水相的成相能力隨溫度的升高而減弱，表現(xiàn)出具有高臨界共熔溫度（Upper critical solution temperature，UCST）的相轉(zhuǎn)變行為。這一結(jié)論在其它相關(guān)研究中得到普遍支持[27，32]。然而，本課題組最新研究發(fā)現(xiàn)，由四辛基膦溴鹽（[P4448]Br）和磷酸鉀（K3PO4）構(gòu)成的離子液體-鹽雙水相的成相能力隨著溫度的升高而增強(qiáng)，表現(xiàn)出具有低臨界共熔溫度（Lower critical solution temperature，LCST）的相轉(zhuǎn)變行為[33]。UCST 型離子液體雙水相體系已在分離蛋白質(zhì)[34-35]、酶[36]等方面獲得廣泛肯定。然而，以蝦青素作為類胡蘿卜素的模型，對(duì)其在離子液體-鹽雙水相體系中分配特性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本文以K2HPO4/KH2PO4替代K3PO4，以季銨鹽和季膦鹽離子液體替代咪唑鹽離子液體，進(jìn)一步構(gòu)建pH 值和溫度均可調(diào)控的新型LCST 型離子液體-鹽雙水相體系，系統(tǒng)考察該體系相行為規(guī)律，以及蝦青素在兩相間的遷移特性，并從雨生紅球藻中提取天然蝦青素，旨在為采用雙水相分離技術(shù)從生物資源中提取天然蝦青素提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雨生紅球藻粉（蝦青素含量2%），西安天象生物工程有限公司；蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%），上海源葉生物科技有限公司。

三水合磷酸氫二鉀K2HPO4·3H2O（純度＞99%），廣州市金華化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鉀KH2PO4（純度＞99%），天津市百世化工有限公司；甲醇（純度＞99.9%），廣州金華化學(xué)試劑有限公司；辛基三丁基溴化膦（[P4448]Br）、辛基三丁基氯化膦（[P4448]Cl）、四丁基溴化膦（[P4444]Br）、四丁基氯化膦（[P4444]Cl）、四丁基三氟乙酸膦（[P4444]CF3COO）、四丁基溴化銨（[N4444]Br）、四丁基氯化銨（[N4444]Cl）、1-丁基-3-甲基咪唑溴鹽（[C4mim]Br）、1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽（[C4mim]Cl）（純度均＞99%），蘭州中科科特工貿(mào)有限公司；蝦青素和離子液體的陽(yáng)離子結(jié)構(gòu)如圖1 所示。

圖1 離子液體陽(yáng)離子和蝦青素的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of ionic liquid cations and astaxanthin

1.2 儀器與設(shè)備

LD-20AD 凝膠滲透液相色譜儀，日本島津公司；KQ-300 超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；HH-6 數(shù)顯電子恒溫水浴鍋，常州國(guó)華電器有限公司；AW120 電子天平，日本島津公司；DNP-9025 電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海鴻都電子科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 離子液體-K2HPO4/KH2PO4雙水相體系相圖繪制 雙水相體系相圖繪制采用“濁點(diǎn)”法[33]。準(zhǔn)確稱取0.2 g 離子液體于試管，置于恒溫水浴鍋（25，35，45，55 ℃），隨后向試管中逐滴加入K2HPO4/KH2PO4緩沖溶液（pH 5～9），至混合體系由澄清變?yōu)榛鞚幔?jì)算并記錄各組分的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)，再逐滴加入水至體系變澄清，如此反復(fù)操作，繪制雙水相體系相圖。

1.3.2 蝦青素含量測(cè)定 色譜柱：C18；柱溫：30℃；流動(dòng)相：甲醇；流速：1.00 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：477 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

1.3.3 蝦青素分配系數(shù)（KAst）通過(guò)高效液相色譜法分別測(cè)得雙水相體系各相中蝦青素濃度，按公式（1）計(jì)算KAst。

式中，[Ast]IL、[Ast]Salt——離子液體富集相和鹽富集相中的蝦青素濃度，mg/g。

1.3.4 從雨生紅球藻提取蝦青素 向[P4448]Br-K2HPO4/KH2PO4雙水相體系中加入0.01 g 雨生紅球藻粉，于75 W 超聲輔助萃取60 min，隨后將其置于恒溫培養(yǎng)箱中靜置12 h，分別取上下相的蝦青素溶液于棕色容量瓶中定容，過(guò)0.45 μm 有機(jī)膜，用高效液相色譜法測(cè)定。為了與有機(jī)試劑提取蝦青素的結(jié)果相比較，采用丙酮、乙醇作為提取劑，在相同條件下提取。蝦青素提取量按公式（2）計(jì)算。

式中，X——蝦青素提取量，mg/g；c——由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的蝦青素質(zhì)量濃度，mg/mL；V——提取液體積，mL；N——稀釋倍數(shù)；m——雨生紅球藻粉質(zhì)量，g。

蝦青素提取率按公式（3）計(jì)算。

式中，ω——蝦青素提取率，%；X——蝦青素提取量，mg/g；Y——雨生紅球藻粉中總蝦青素含量，mg/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

所有試驗(yàn)平行測(cè)定3 次，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。采用JMP 軟件（SAS 公司）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（One-way anova），P＜0.05 時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Excel 軟件回歸擬合試驗(yàn)數(shù)據(jù)，Origin 8.0 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 LCST 型離子液體-K2HPO4/KH2PO4 雙水相體系的構(gòu)建及其相行為規(guī)律

2.1.1 離子液體種類對(duì)相行為的影響 生物分子在液-液萃取體系中的分配關(guān)系往往與該萃取體系的相行為密切關(guān)聯(lián)。首先研究9 種離子液體-K2HPO4/KH2PO4雙水相體系在25 ℃下的相平衡規(guī)律，其雙節(jié)線相圖如圖2 所示。由相同陰離子和不同陽(yáng)離子構(gòu)成的離子液體與K2HPO4/KH2PO4形成雙水相的能力表現(xiàn)為：[P4448]+＞[P4444]+≈[N4444]+＞[C4mim]+。與[P4444]+相比，[P4448]+具有更長(zhǎng)的側(cè)鏈，且摩爾體積較大，疏水性更強(qiáng)，因此成相能力最好[37]。與四元鹽相比，咪唑基離子液體陽(yáng)離子具有電荷擴(kuò)散，使得陽(yáng)離子與水分子之間的相互作用更強(qiáng)。因此，[P4444]+和[N4444]+比咪唑基離子液體具有更強(qiáng)的疏水性，其成相能力也更好。

另一方面，離子液體陰離子形成雙水相體系的能力，與其氫鍵接受強(qiáng)度或電子對(duì)貢獻(xiàn)下降密切相關(guān)[38]。從圖2 可以看出，不同陰離子的離子液體與K2HPO4/KH2PO4形成雙水相的能力大小為：[CF3COO]-＞[Br]-＞[Cl]-。[CF3COO]-具有較高電荷密度，成相能力較強(qiáng)。Br-可形成較強(qiáng)的庫(kù)侖力，而且與Cl-相比，其從水中接受質(zhì)子能力較弱，促使離子液體對(duì)水分子親和力較低，而利于相分離[23，39]。

圖2 25 ℃下離子液體-K2HPO4/KH2PO4（pH 8）雙水相體系雙節(jié)線相圖Fig.2 Phase diagrams of IL-K2HPO4/KH2PO4（pH 8）ABSs at 25 ℃

2.1.2 溫度對(duì)相行為的影響 溫度是決定離子液體雙水相形成能力的重要因素之一。研究表明，大多數(shù)咪唑鹽離子液體-水二元體系表現(xiàn)出UCST型相變行為[27]。2011 年，Kohno 等[40]首次提出[P4444]CF3COO-H2O 二元體系為L(zhǎng)CST 型相轉(zhuǎn)變。前期研究證明，[P4444]CF3COO-K3PO4和[P4448]Br-K3PO4雙水相體系也表現(xiàn)為L(zhǎng)CST 型相轉(zhuǎn)變行為[33]。在此，進(jìn)一步探討不同溫度下的9 種離子液體-K2HPO4/KH2PO4-水混合物體系的相行為特征。由表1 可知，[P4448]Br、[P4448]Cl、[P4444]Br、[P4444]Cl、[P4444]CF3COO以及[N4444]Br 這6 種離子液體可以與K2HPO4/KH2PO4形成LCST 型雙水相體系。圖3 為L(zhǎng)CST型離子液體-K2HPO4/KH2PO4雙水相體系隨溫度變化的雙節(jié)線相圖。

圖3 不同溫度下LCST 型離子液體-K2HPO4/KH2PO4（pH 8）雙水相體系雙節(jié)線相圖Fig.3 Phase diagrams of LCST-type IL-K2HPO4/KH2PO4（pH 8）ABSs at different temperatures

表1 離子液體-K2HPO4/KH2PO4-水混合物體系的相行為特征Table 1 Phase behavior of IL-K2HPO4/KH2PO4-water mixture system

2.1.3 pH 值對(duì)相行為的影響 K3PO4電荷密度高，比K2HPO4、KH2PO4對(duì)水的結(jié)合能力更強(qiáng)[38，41]，然而，由緩沖鹽引起的pH 值變化對(duì)雙水相的形成以及對(duì)生物分子的提取作用，均不容忽略。Ferreira等[42]發(fā)現(xiàn)[P4444]Cl-K3C6H5O7/C6H8O7雙水相體系隨pH 值的升高成相能力呈增大趨勢(shì)。然而，在pH 5～8 的范圍內(nèi)，[P4448]Br-K2HPO4/KH2PO4雙水相體系隨pH 值的變化并不顯著（圖4），這可能是因?yàn)閇P4448]Br 疏水性強(qiáng)，溶液體系電荷密度在該pH 值范圍內(nèi)未發(fā)生顯著變化。

圖4 25 ℃下不同pH 值的[P4448]Br-K2HPO4/KH2PO4雙水相體系雙節(jié)線相圖Fig.4 Phase diagrams of[P4448]Br-K2HPO4/KH2PO4 ABSs at different pH value

2.2 蝦青素在LCST 型離子液體-K2HPO4/KH2PO4 雙水相體系中的分配規(guī)律

2.2.1 離子液體種類對(duì)蝦青素分配系數(shù)的影響由于萃取體系的表面性質(zhì)、電荷作用和其它作用力（如憎水鍵、氫鍵和離子鍵等）的存在，使生物分子在上、下相的濃度有所差異，分配系數(shù)大于1 表明兩相的疏水性差異利于目標(biāo)提取物的分離[19]。圖5 為蝦青素在不同離子液體-K2HPO4/KH2PO4雙水相體系中的分配系數(shù)。蝦青素在[P4448]Br、[P4448]Cl、[P4444]Br、[P4444]Cl、[P4444]CF3COO 以及[N4444]Br 參與構(gòu)筑的雙水相體系中的KAst均大于1，表明蝦青素主要遷移到這6 種離子液體富集相中。這主要由于蝦青素紫羅酮環(huán)上的羥基與離子液體陽(yáng)離子上的氫原子之間形成氫鍵作用，其中[P4448]Br 陽(yáng)離子中氫原子最多，與蝦青素氫鍵作用最強(qiáng)。因此，[P4448]Br-K2HPO4/KH2PO4雙水相體系在25 ℃，pH 8，離子液體質(zhì)量濃度0.26 g/g 的條件下獲得最大蝦青素分配系數(shù)（KAst=6.44）。與此相反，[C4mim]Cl和[C4mim]Br 雙水相體系具有UCST 型相轉(zhuǎn)變行為，在此條件下，KAst小于1。由此可見(jiàn)，LCST 型離子液體雙水相體系比UCST 型離子液體雙水相體系具有更強(qiáng)的蝦青素提取能力，而且離子液體形成雙水相的能力與蝦青素的分配系數(shù)存在密切相關(guān)。

2.2.2 離子液體濃度對(duì)蝦青素分配系數(shù)的影響離子液體與蝦青素的相互作用是蝦青素遷移到離子液體富集相的內(nèi)在動(dòng)力。如圖6 所示，KAst隨[P4448]Br 質(zhì)量濃度的增加呈先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)[P4448]Br 質(zhì)量濃度為0.25 g/g 時(shí)，KAst最大為14.59。這是因?yàn)殡S著[P4448]Br 初始質(zhì)量濃度的增加，體系各相疏水性差異不斷增加，蝦青素與離子液體的相互作用增強(qiáng)，利于蝦青素向離子液體富集相轉(zhuǎn)移。然而，過(guò)量的離子液體會(huì)導(dǎo)致離子液體富集相中水分含量減少，相體積減小，黏度增加，因此不利于蝦青素的遷移。

圖5 蝦青素在不同IL-K2HPO4/KH2PO4 雙水相體系中的分配系數(shù)（25 ℃，pH 8，cIL=0.26 g/g）Fig.5 KAst in different IL-K2HPO4/KH2PO4 ABS（25 ℃，pH 8，cIL=0.26 g/g）

圖6 [P4448]Br 質(zhì)量濃度對(duì)蝦青素分配系數(shù)的影響（25 ℃，pH 8）Fig.6 Effect of[P4448]Br mass concentrations on the KAst（25 ℃，pH 8）

2.2.3 溫度對(duì)蝦青素分配系數(shù)的影響 離子液體在雙水相各相中的濃度不僅受離子液體自身陰、陽(yáng)離子種類的影響[26]，而且受到溫度的影響[31，33]。對(duì)于LCST 型離子液體雙水相體系，升高溫度使得離子液體的疏水性增強(qiáng)，其在兩相中的濃度差異增加[43]。這種由溫度變化而引起的離子液體濃度差異最終會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)提取物在兩相間分配系數(shù)的變化。由圖7 可知，[P4444]CF3COO-K2HPO4/KH2PO4雙水相中KAst隨溫度的升高而增大，說(shuō)明高溫利于蝦青素向[P4444]CF3COO 富集相遷移。此結(jié)果與圖6 所示[P4448]Br 質(zhì)量濃度對(duì)蝦青素分配系數(shù)的影響規(guī)律結(jié)果相吻合。值得注意的是，升高溫度利于蝦青素向[P4448]Br 富集相遷移。35 ℃時(shí)，KAst達(dá)到最大值23.41。然而，進(jìn)一步生高溫度反而使KAst降低。這可能因?yàn)槔^續(xù)升高溫度加速了相分離，[P4448]Br 質(zhì)量濃度的增加使離子液體相的黏度增大，不利于蝦青素的遷移。另一方面，高溫可能引起蝦青素穩(wěn)定性下降，不利于其分離提取[6]。

2.2.4 pH 值對(duì)蝦青素分配系數(shù)的影響 雖然[P4448]Br-K2HPO4/KH2PO4雙水相體系的成相能力受pH 值的影響不顯著，但是蝦青素在該雙水相體系中的分配系數(shù)隨pH 值的變化情況不容忽視。由圖8 可見(jiàn)，堿性環(huán)境更利于蝦青素的提取。可能因?yàn)樵趬A性條件下離子液體富集相具有較高的電荷密度，與蝦青素作用更強(qiáng)。與此相近，通過(guò)加入KOH 以調(diào)節(jié)體系pH 值，促使1-丁基-1-甲基哌啶鎓氯化物與檸檬酸鉀和檸檬酸混合物所構(gòu)成的雙水相體系，從果糖中分離羥甲基糠醛[44]。因此，利用LCST 型離子液體雙水相體系從生物資源中提取天然蝦青素，必須控制適當(dāng)?shù)臏囟群蚿H范圍。綜上所述，[P4448]Br-K2HPO4/KH2PO4雙水相體系成相能力最佳，表現(xiàn)為具有LCST 型特點(diǎn)的相轉(zhuǎn)變行為，并且在[P4448]Br 質(zhì)量濃度為0.25 g/g，溫度35 ℃，pH 9 時(shí)，蝦青素分配系數(shù)達(dá)到最大。

圖7 不同溫度下蝦青素在IL-K2HPO4/KH2PO4雙水相體系中的分配系數(shù)（pH 8，cIL=0.25 g/g）Fig.7 KAst in IL-K2HPO4/KH2PO4 ABS at different temperatures（pH 8，cIL=0.25 g/g）

圖8 不同pH 值下蝦青素在[P4448]Br-K2HPO4/KH2PO4雙水相體系中的分配系數(shù)（25 ℃，cIL=0.25 g/g）Fig.8 KAst in[P4448]Br-K2HPO4/KH2PO4 ABS at different pH value（25 ℃，cIL=0.25 g/g）

2.3 [P4448]Br-K2HPO4/KH2PO4 雙水相體系從雨生紅球藻中提取蝦青素

以雨生紅球藻為原料，利用[P4448]Br-K2HPO4/KH2PO4雙水相體系（pH 9），在超聲功率75 W、超聲時(shí)間60 min 輔助條件下提取蝦青素，結(jié)果見(jiàn)表2。[P4448]Br 雙水相體系從雨生紅球藻中提取蝦青素的能力遠(yuǎn)高于丙酮和乙醇，提取量達(dá)到19.22 mg/g，提取率高達(dá)96.09%。此外，本研究所采用的LCST 型雙水相體系具有環(huán)境友好，操作簡(jiǎn)單，分離條件溫和，蝦青素提取率高的優(yōu)點(diǎn)。

3 結(jié)論

本文構(gòu)建了新型離子液體-鹽雙水相體系，考察了其相行為規(guī)律及蝦青素的分配特性，并從雨生紅球藻中提取蝦青素。結(jié)果表明，[P4448]Br、[P4448]Cl、[P4444]Br、[P4444]Cl、[P4444]CF3COO 以及[N4444]Br 這6 種離子液體可與K2HPO4/KH2PO4形成LCST 型雙水相體系。與UCST 型離子液體-鹽雙水相體系相比，LCST 型離子液體-鹽雙水相體系的成相能力隨著溫度升高而增強(qiáng)，利于蝦青素的分離。蝦青素與離子液體陽(yáng)離子之間的相互作用使其主要分配于離子液體富集相，不同離子液體雙水相的KAst規(guī)律為[P4448]Br＞[P4444]CF3COO＞[P4444]Br＞[N4444]Br＞[P4448]Cl＞[P4444]Cl。當(dāng)pH 9，超聲功率75 W，超聲時(shí)間60 min 時(shí)，[P4448]Br-K2HPO4/KH2PO 雙水相體系從雨生紅球藻中可獲得蝦青素的萃取率為96.09%，優(yōu)于丙酮和乙醇。研究結(jié)果為設(shè)計(jì)對(duì)蝦青素具有良好萃取效果的液-液萃取體系提供了重要理論依據(jù)。

表2 [P4448]Br 雙水相體系與其它體系萃取蝦青素的比較Table 2 Comparison of[P4448]Br-based ABS with some published method for astaxanthin extraction