白酒糟制備高純度微晶纖維素工藝優(yōu)化及其結(jié)構(gòu)表征

任海偉 邢雪曄 張湘越 沈佳莉 張丙云 李志忠* 王治業(yè)

（1 蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院 蘭州 730050 2 甘肅省科學(xué)院生物研究所 蘭州 730000）

中國是白酒生產(chǎn)和消費大國，白酒釀造過程中會產(chǎn)生大量固體殘渣，這些固體殘渣即廢棄酒槽，因其屬于釀酒工業(yè)副產(chǎn)品，故被稱為丟糟[1]。由于釀酒工藝添加稻殼等因素，所以白酒糟含有大量纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組分，是一種極具開發(fā)前景的木質(zhì)纖維生物質(zhì)[2]。

微晶纖維素（Microcrystalline cellulose，MCC）是通過化學(xué)或生物處理水解、純化天然植物纖維，使其部分解聚至極限平衡聚合度（Levelling-off degree of polymerization，LODP）的一種白色結(jié)晶狀粉末。MCC 是天然植物纖維的衍生物，具有無臭、無味、可自由流動的特點，在食品、醫(yī)藥、化工、醫(yī)療等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[3]。

本文以廢棄白酒糟為原料，先通過硝酸-乙醇法提取粗纖維素，再利用鹽酸水解和漂白提純法制備高純度微晶纖維素，以得率和純度為響應(yīng)變量，通過響應(yīng)面法優(yōu)化制備參數(shù)。在此基礎(chǔ)上，利用掃描電鏡（SEM）、傅里葉變換紅外光譜（FTIR）、X-射線衍射（XRD）和熱重分析（TGA）手段表征白酒糟提取制備微晶纖維素的結(jié)構(gòu)特性變化，以期為白酒糟制備食品添加劑MCC 的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白酒糟，甘肅金徽酒股份有限公司，纖維素和半纖維素的質(zhì)量分數(shù)分別為22.24%和17.37%（以干基計）。商品微晶纖維素（Lowa?PH101），山東聊城阿華制藥有限公司。其余試劑均為分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

D/max-2400 粉末X-射線衍射儀，日本理學(xué)公司；JSM-5600LV 掃描電子顯微鏡，日本電子光學(xué)公司；Nexus 670 傅里葉變換紅外光譜儀，美國Nicole 公司；STA409C/PC 熱重分析儀，德國Netzsch 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 白酒糟中粗纖維的提取 準確稱取2.000 g 酒糟原料（105 ℃烘干至恒重）于200 mL 磨口錐形瓶中，加入一定體積的硝酸乙醇溶液（硝酸∶乙醇=1∶3，體積比）恒溫加熱回流3 次，抽濾、水洗至中性后用乙醇洗滌2 次濾渣，冷凍干燥至恒重后得到粗纖維。

1.3.2 酒糟微晶纖維素（GSMCC）制備參數(shù)優(yōu)化將1.3.1 節(jié)中提取的粗纖維以一定液固比（10∶1，15∶1，20∶1，25∶1，30∶1，35∶1 mL/g）與不同質(zhì)量分數(shù)鹽酸溶液（3%，5%，7%，9%，11%，13%）混合，混勻后在密閉反應(yīng)器中加熱至所需溫度（50，60，70，80，90，100 ℃），達到預(yù)定溫度后水解反應(yīng)一定時間（0.5，1，1.5，2，2.5，3 h）。水解完成后，將離心過濾得到的微晶纖維素樣品用蒸餾水洗滌至中性，冷凍干燥72 h 后獲得GSMCC 粉末。固定其中3 個變量，考察某一因素對GSMCC 得率、純度和聚合度等指標的影響。

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以GSMCC 的純度和得率為響應(yīng)變量，選取鹽酸濃度、反應(yīng)溫度和時間3 個因素進行3 因素3 水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗，通過方差分析和因素交互作用對GSMCC 得率和純度的影響，優(yōu)化制備參數(shù)。GSMCC 的得率可由公式（1）計算得出。

1.3.3 酒糟微晶纖維素（GSMCC）的漂白與提純將1.3.2 節(jié)中優(yōu)化制備得到的GSMCC 樣品與體積分數(shù)為6%的次氯酸鈉溶液以1∶20（g/mL）料液比混合，然后60 ℃漂白處理1 h，抽濾、洗滌至中性、干燥得到近白色GSMCC 粉末[4]。

1.3.4 分析方法

1.3.4.1 純度 參考GB 1886.103-2015 方法，稱取125.0 mg 試樣置于裝有25 mg 水的錐形燒瓶中，依次加入50.0 mL 重鉻酸鉀溶液和100 mL 硫酸，混勻后加熱至沸騰，快速冷卻后稀釋定容至250 mL。從中吸取50.0 mL 稀釋液，加2～3 滴1，10-菲羅啉-亞鐵指示液，用0.1 mol/L 硫酸亞鐵銨標準滴定溶液滴定，記錄所耗量，同時進行空白試驗。純度按公式（2）計算。

式中，V1——空白試驗消耗硫酸亞鐵銨標準滴定溶液的體積，mL；V2——試樣消耗硫酸亞鐵銨標準滴定溶液的體積，mL；338——換算系數(shù)；m——試樣的質(zhì)量，mg。

1.3.4.2 聚合度（DP）用移液管吸取25 mL 蒸餾水注入溶解瓶中，加入2～3 塊紫銅片，搖蕩溶解至試樣完全分解，再吸取25 mL 銅三乙二胺（CED）溶液于溶解瓶中，并排除全部殘留空氣，不斷振蕩直至試樣完全溶解，將溶解瓶浸入（25±0.1）℃恒溫水浴中。將一份試樣溶液置于粘度計中，用秒表計算溶液流出時長，測量CED 溶液中的樣品黏度來確定聚合度[5]。DP 計算公式見式（3）。

式中，w——所取GSMCC 的干重，g；c——0.5 mol/L CED 溶液中的GSMCC 質(zhì)量濃度，g/mL；[η]——溶液的特性黏度，mL/g。

1.3.5 結(jié)構(gòu)特性表征

1.3.5.1 掃描電子顯微鏡（SEM） 將樣品粉末分散在雙面導(dǎo)電膠帶上，用噴金儀噴金40 s，噴金電流為10 mA；將噴金后的樣品置于掃描電鏡載物臺上進行形貌觀察，加速電壓為3.0 kV[6]。

1.3.5.2 傅里葉變換紅外光譜（FTIR） 測試前先對樣品粉末進行KBr 壓片處理，并通過測量背景光譜消除空氣、水分和氧氣中的二氧化碳。在分辨率4 cm-1條件下記錄光譜帶，掃描范圍400～4 000 cm-1，分析樣品的官能團結(jié)構(gòu)[7]。

1.3.5.3 X 射線衍射（XRD）采用高分辨率Rigaku X 射線衍射儀，使用鎳濾光器，Cu-Kα 射線（波長1.541 A）為靶材，在掃描速率1°/min，加速電壓40 kV，電流100 mA 條件下測試，掃描范圍（2θ）為10°～60°。相對結(jié)晶度指數(shù)（Crystallinity index，CrI）根據(jù)Segal 公式（4）計算。

式中，I002——002 晶格平面（約2θ=22°）的峰值強度；Iam——形態(tài)相的峰值強度，對應(yīng)于約2θ=18°的峰值[8-9]。

晶粒尺寸參考公式（5）計算。

式中，λ——入射X 射線的波長，nm；θ——衍射hkl 的布拉格角，rad；βhkl——衍射hkl 的半峰寬，弧度。

1.3.5.4 熱重分析（TGA） 采用熱重分析儀在氮氣氣氛下以40 mL/min 的流速，從25 ℃加熱到900 ℃對樣品進行熱穩(wěn)定性研究，樣品質(zhì)量約為6 mg，加熱速率為10 ℃/min[7]。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析 試驗分析結(jié)果均表示為平均值±標準差，采用SPSS 20.0 軟件進行ANOVO 和Duncan 分析，了解單因素試驗過程中不同處理組之間的差異性。用Design-Expert.V8.0.6 軟件進行響應(yīng)面優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒糟微晶纖維素（GSMCC）制備的單因素試驗

2.1.1 液固比對制備效果的影響 固定鹽酸質(zhì)量分數(shù)7%，酸解溫度80℃，反應(yīng)時間1 h，考察液固比對得率和純度的影響。如圖1 所示，在10∶1～25∶1 試驗范圍內(nèi)，GSMCC 得率隨著液固比的增加而下降；純度變化趨勢剛好相反，隨著液固比的增加呈增加趨勢。這是由于鹽酸對木質(zhì)素等雜質(zhì)的去除作用增強導(dǎo)致酒糟MCC 的純度上升。當(dāng)液固比高于25∶1 時，二者趨于恒定。這是因為當(dāng)液固比較低（鹽酸溶液體積較小）時，由于粉末狀纖維素吸水量較大而無法充分接觸纖維素，導(dǎo)致其無定形區(qū)得不到充分降解[10]。當(dāng)液固比繼續(xù)增大時，鹽酸體積增加，降低了反應(yīng)體系的黏度，使酸更容易滲透進纖維素?zé)o定形區(qū)，H+對半纖維素和木質(zhì)素等雜質(zhì)的去除作用增強使得GSMCC 純度升高。綜合考慮GSMCC 得率和純度以及成本因素，確定液固比為25∶1（mL/g）為宜。

圖1 液固比對GSMCC 得率和純度的影響Fig.1 Effect of liquid-solid ratio on the yield and purity of GSMCC

2.1.2 水解時間對制備效果的影響 在鹽酸質(zhì)量分數(shù)7%，酸解溫度80 ℃，液固比25∶1 mL/g 的固定條件下，考察水解時間對得率和純度的影響。如圖2 所示，反應(yīng)初期（＜1.5 h），隨著水解反應(yīng)的進行，GSMCC 得率和純度均顯著升高；反應(yīng)1.5～2.5 h 期間，得率顯著下降，而純度維持恒定不變；反應(yīng)末期（＞2.5 h），得率保持不變而純度反而顯著降低。這是因為隨著酸水解時間的延長加劇了纖維素的酸性水解反應(yīng)，導(dǎo)致纖維素分子中的β-1，4糖苷鍵斷裂的數(shù)目增加，反應(yīng)生成葡萄糖的量也在增加，所以制備得到的GSMCC 得率降低[11]。另一方面，隨著時間的繼續(xù)延長，由于纖維素內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生一系列變化，纖維素降解成葡萄糖等小分子，導(dǎo)致純度下降[12]。綜合考慮，確定水解時間為1 h 為宜。

圖2 水解時間對GSMCC 得率和純度的影響Fig.2 Effects of hydrolysis time on the yield and purity of GSMCC

2.1.3 水解溫度對制備效果的影響 在鹽酸質(zhì)量分數(shù)7%，酸解時間1 h，液固比25∶1 mL/g 的固定條件下，考察水解溫度對得率和純度的影響。如圖3 所示，得率和純度均隨著水解溫度的升高而總體呈先升高后下降的趨勢。這是因為當(dāng)溫度低于70 ℃時，半纖維素的糖苷鍵在酸性介質(zhì)中發(fā)生斷裂，很容易被熱的無機酸水解成單糖，使GSMCC得率和純度呈上升趨勢。當(dāng)溫度過高時（＞70 ℃），鹽酸對于半纖維素等雜質(zhì)的去除作用趨于飽和，剩下的雜質(zhì)在試驗條件下已經(jīng)很難被除去，此時鹽酸主要作用于纖維素β-1，4-葡萄糖苷鍵的斷裂，纖維素的水解效應(yīng)增強，導(dǎo)致纖維素片段降解為小分子糖，從而使得率驟降[13]，純度也隨之降低。綜合考慮，酸解溫度以80 ℃為宜。

2.1.4 鹽酸質(zhì)量分數(shù)對制備效果的影響 在液固比25∶1 mL/g，溫度80 ℃，時間1 h 的固定條件下，研究鹽酸質(zhì)量分數(shù)對GSMCC 得率和純度的影響。由圖4 可知，當(dāng)鹽酸質(zhì)量分數(shù)低于7%時，得率和純度均隨著鹽酸質(zhì)量分數(shù)的增加而顯著上升；當(dāng)鹽酸介于7%～9%（質(zhì)量分數(shù)）時，得率和純度均維持恒定不變；當(dāng)鹽酸質(zhì)量分數(shù)繼續(xù)增加高于9%時，得率和純度均顯著下降。這是由于鹽酸不僅能水解纖維素制備微晶纖維素，還能使半纖維素的糖苷鍵斷裂，水解去除半纖維素等雜質(zhì)。鹽酸質(zhì)量分數(shù)升高使其水解作用逐步加強，纖維素?zé)o定形區(qū)的β-1，4-葡萄糖苷鍵持續(xù)被斷裂，使得GSMCC的純度和得率都有所提升；當(dāng)質(zhì)量分數(shù)過高（大于9%）時，GSMCC 會進一步水解成小分子糖，使其得率顯著下降。綜合考慮，鹽酸以質(zhì)量分數(shù)7%為宜。

圖3 溫度對GSMCC 得率和純度的影響Fig.3 Effects of temperature on the yield and purity of GSMCC

圖4 鹽酸質(zhì)量分數(shù)對GSMCC 得率和純度的影響Fig.4 Effects of hydrochloric acid mass fraction on the yield and purity of GSMCC

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化制備工藝參數(shù)

2.2.1 二次響應(yīng)面回歸模型的建立與分析 根據(jù)2.1 節(jié)中單因素試驗結(jié)果，以GSMCC 得率和純度為響應(yīng)值，選取鹽酸質(zhì)量分數(shù)、溫度和時間3 個因素，采用Box-Behnken 模型進行響應(yīng)面優(yōu)化。試驗方案與結(jié)果如表1 所示。通過Design-Expert.V8.0.6 軟件得到純度和得率的方差分析結(jié)果（表2 和表3）；并對響應(yīng)值與因素進行回歸擬合，擬合后的二次多項方程為：

得率=67.47636-12.48967A+0.57945B+1.34251C+0.18005AB+0.24598AC+0.057507BC+0.67739A2-8.77166E-003B2-0.40763C2

純度=24.28361+32.97077A+0.99687B+1.30919C-0.16224AB-0.022533AC+0.013520BC-6.22821A2-5.88120E-003B2-0.14140C2

表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計與結(jié)果Table 1 Experimental design and results based on response surface method

表2 得率的回歸模型方差分析Table 2 Variance analysis of regression model for the yield

表3 純度的回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model for purity

（續(xù)表3）

從表2 和3 可知，兩個指標的模型均達到極顯著水平且失擬項均不顯著，說明試驗設(shè)計可靠，可用該模型對微晶纖維素的提取進行分析和預(yù)測。另一方面，一次項A（時間）對得率和純度均表現(xiàn)出高度顯著（P＜0.01），二次項C2對得率也有顯著影響（P＜0.05）；二次項A2對純度有高度顯著影響（P＜0.01）。3 個因素對GSMCC 得率的影響程度順序依次為時間＞溫度＞質(zhì)量分數(shù)，對純度影響程度的順序依次為時間＞質(zhì)量分數(shù)＞溫度，可見水解時間對GSMCC 的制備效果至關(guān)重要。

2.2.2 因素間交互作用分析 通過對建立的回歸模型進行響應(yīng)面分析，得到AB、AC、BC 交互作用的等高線圖和三維響應(yīng)面。從圖5 和圖6 可直觀看出，各因素交互作用對GSMCC 得率和純度的影響，若曲線越陡峭，則表明該因素對GSMCC 得率和純度的影響越大[3]。水解時間對GSMCC 得率影響最大，與表2 回歸分析結(jié)果吻合，水解時間的P 值小于0.01，達到極顯著水平；水解時間對GSMCC 純度影響最大，與表3 回歸分析結(jié)果吻合。

2.2.3 最優(yōu)條件的預(yù)測及驗證試驗 經(jīng)過軟件分析預(yù)測得到GSMCC 的最優(yōu)制備參數(shù)為時間105.3 min，溫度72.3 ℃，鹽酸質(zhì)量分數(shù)7.5%，最高理論得率和理論純度分別為89.24%和92.01%。在該條件下進行5 次平行驗證試驗，得到GSMCC 的制備得率為89.25%，純度為92.57%，理論值誤差分別為0.01%和0.60%，此時聚合度為276.39，驗證試驗結(jié)果可靠有效。最優(yōu)條件得到的GSMCC 經(jīng)次氯酸鈉溶液漂白后，純度增加至93.31%，聚合度降至255.86，得率也略有下降，降至88.47%。

2.3 結(jié)構(gòu)表征分析

2.3.1 表觀形貌 如圖7a 所示，酒糟原料細胞的天然纖維束含有一些表面雜質(zhì)。圖7b 中的纖維素產(chǎn)品較原材料粗糙，有剝離現(xiàn)象。這可能是因為從白酒糟中去除了纖維素表面的雜質(zhì)，暴露出了纖維素內(nèi)部的結(jié)構(gòu)。圖7c 為鹽酸水解粗纖維后所得的GSMCC，表面有裂縫，呈不規(guī)則顆粒狀。圖7d表明GSMCC 經(jīng)漂白后顆粒呈不規(guī)則顆粒狀，有少量纖維碎片。圖7e 顯示商業(yè)微晶纖維素Lowa?PH101 呈堆疊的棒狀結(jié)構(gòu)。GSMCC 與商業(yè)微晶纖維素Lowa?PH101 存在形態(tài)差異的原因可能是由于原料來源和制備工藝不同所致。董鳳霞等[14]認為棉漿經(jīng)不同預(yù)處理方法制得的纖維素納晶形態(tài)有明顯差異。Agblevor 等[15]研究發(fā)現(xiàn)以玉米芯和軋棉廢料為原料制得的MCC 形態(tài)也存在差異。

2.3.2 紅外光譜 如圖8 FTIR 圖所示，從酒糟原料到GSMCC 的整個制備過程中均表現(xiàn)出相似的紅外光譜，說明制備工藝并未改變化學(xué)官能團結(jié)構(gòu)。在2 800 cm-1～3 500 cm-1和500 cm-1～1 800 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)有兩個明顯吸光度區(qū)域；3 416 cm-1處寬吸收帶表示-OH 基團的拉伸[16]，GSMCC制備過程中這一譜帶寬度有減小趨勢，意味著受到纖維素鏈水解和斷裂影響，游離基團-OH 數(shù)量有所不同；2 927 cm-1代表纖維素-CH2-中的C-H伸縮振動。吸收峰1 739 cm-1與半纖維素中的乙?；蛱侨┧狨セ鶊F有關(guān)，制備GSMCC 過程中此峰變?nèi)跽f明半纖維部分被去除，而仍有殘留的痕跡。1 648 cm-1處的吸收峰對應(yīng)于纖維-水強相互作用而吸水[17]；粗纖維在1 500 cm-1附近的吸收峰減弱，說明部分木質(zhì)素被去除。1 167 cm-1和1 033 cm-1處是纖維素分子的特征峰，分別為糖苷鍵振動峰和吡喃糖環(huán)C=O=C 骨架的振動?？梢?，白酒糟制得的微晶纖維素產(chǎn)品依然顯示典型的纖維素官能團結(jié)構(gòu)。

圖5 各因素交互作用對GSMCC 得率的影響Fig.5 Effects of interaction for various factors on the yield of GSMCC

圖6 各因素交互作用對GSMCC 純度的影響Fig.6 Effects of interaction for various factors on the purity of GSMCC

圖7 GSMCC 制備過程中的SEM 圖比較Fig.7 Comparison of SEM images during preparation of GSMCC

2.3.3 X 衍射 圖9 中2θ 在15°和22°附近的兩個主要吸收峰表示纖維素Ⅰ的101 和002 晶面，2θ=34°附近較小的衍射峰為纖維素Ⅰ的004 晶面。此外，GSMCC 制備過程中各樣品XRD 相似，說明化學(xué)處理未改變纖維素的結(jié)構(gòu)，這與FTIR 結(jié)果一致。各樣品的相對結(jié)晶度如表3 所示，酒糟原料、粗纖維、GSMCC 和漂白GSMCC 的結(jié)晶度分別為40.20%，49.21%，54.95%和67.49%，說明結(jié)晶度隨著GSMCC 的制備和純化而升高。這是由于預(yù)處理作用除去了酒糟中的非纖維成分；酸水解導(dǎo)致纖維素的β-1，4 糖苷鍵斷裂，部分無定形區(qū)被去除，釋放出單個微晶；次氯酸鈉漂白使殘留的木素去除，從而使MCC 結(jié)晶度提高。而Lowa?PH101的結(jié)晶度為71.58%，這可能由于原料來源或制備條件不同所致[18]。

圖8 GSMCC 制備過程中的FTIR 圖譜比較Fig.8 Comparison of FTIR spectra during preparation of GSMCC

圖9 GSMCC 制備過程中的XRD 圖譜比較Fig.9 Comparison of XRD patterns during preparation of GSMCC

表4 GSMCC 制備過程中的結(jié)晶度比較Table 4 Comparison of crystallinity during preparation of GSMCC

2.4 熱學(xué)性質(zhì)

圖10 顯示5 個樣品的TG 曲線和DTG 曲線有兩個主要重量變化階段。由于水分蒸發(fā)，110 ℃以下產(chǎn)生第一個降解階段，此時失重率分別為4.71%，7.88%，6.78%，8.50%和3.69%。第二階段降解開始溫度分別為154.88，267.68，279.96，208.11℃和319.76 ℃；此外，最大失重率所處溫度分別為308.81，329.29，335.43，321.10 ℃和354.98 ℃，此時代表產(chǎn)品可耐受的最高溫度，相應(yīng)重量損失分別為49.68%，68.36%，68.16%，64.67%和59.74%。

GSMCC 制備過程中各樣品的降解溫度逐漸升高，可能是由于硝酸-乙醇和酸水解去除了纖維素的無定形區(qū)，結(jié)晶區(qū)比例增大后需要更高的溫度才能將其破壞。當(dāng)GSMCC 進一步漂白后，降解溫度又有所降低，一方面可能是由于MCC 的尺寸在次氯酸鈉的作用下減小，分解為較多的納米結(jié)構(gòu)，從而增大了比表面積，使其更易于被分解，熱穩(wěn)定性降低；另一方面，可能是因為次氯酸鈉氧化在一定程度上破壞了MCC 分子間的氫鍵作用，分子間作用力降低，更容易受熱分解[10]。據(jù)Sanchez-Silva 等[19]報道，木質(zhì)素在450 ℃時開始降解，白酒糟TG 曲線沒有在450 ℃時出現(xiàn)失重峰，說明白酒糟中木質(zhì)素含量較低，這與成分測定結(jié)果一致。此外，白酒糟粗纖維與GSMCC 的降解行為相似，失重率幾乎一致，可見酸水解只是降低了纖維素鏈的聚合程度；最后一個階段5 個樣品的失重逐漸趨于平緩，完全降解溫度分別為347.84，343.82，351.85，355.86 ℃和373.12 ℃?？傊?，本研究制備得到的微晶纖維素?zé)岱€(wěn)定性明顯高于酒糟原料。

圖10 白酒糟制備MCC 過程中不同樣品的TG 和DTG 曲線Fig.10 TG and DTG curves of different samples in the preparation of MCC from liquor distillate

3 結(jié)論

白酒糟制備微晶纖維素的最佳工藝參數(shù)為：時間105.3 min，溫度72.3 ℃，鹽酸質(zhì)量分數(shù)7.5%，液固比25∶1 mL/g，該優(yōu)化條件制備的微晶纖維素純度為92.57%，得率為89.25%，聚合度為276.39。經(jīng)漂白提純后純度為93.31%，聚合度為255.86。酒糟微晶纖維素為Ⅰ型纖維素，結(jié)晶度為67.49%，呈不規(guī)則顆粒狀，具有良好的熱穩(wěn)定性。