干酪乳桿菌/乳糖醇雙層合生元微膠囊制備及其在橙汁中的應(yīng)用

李洪波 李春爽 張?zhí)扃?韓翼宇 李紅娟 于景華

（天津科技大學食品科學與工程學院 天津 300457）

益生菌是指服用足夠量時，能對人體產(chǎn)生有益作用的一類活的微生物[1]。益生菌分布廣泛，種類繁多，常見的有乳桿菌、雙歧桿菌及部分革蘭氏陽性球菌[2-3]。益生菌對人體健康有多方面的積極作用，如提高人體免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)腸道功能，降低過敏反應(yīng)，降低膽固醇，維持腸道菌群平衡及防癌、抗癌等功能[4-5]。益生菌的這些功能使得它在食品中得到越來越多的應(yīng)用，使用范圍也日益擴大。

實現(xiàn)益生菌眾多功能的基礎(chǔ)是腸道中含有一定數(shù)量的益生菌。然而，傳統(tǒng)方法應(yīng)用時益生菌在生長過程中耐酸性差，對氧敏感，活性保持困難[6]。如何提高益生菌制品中的活菌數(shù)，提高菌體的耐酸性及膽汁的耐受性，成為亟待解決的問題。研究發(fā)現(xiàn)，一些低聚糖、微藻及某些天然植物進入人體后不易被機體消化，也不被有害菌利用，然而，可以選擇性刺激腸道中的一種或多種益生菌群的生長或增強益生菌的活性，使其成為腸道優(yōu)勢菌群，這種物質(zhì)被稱為益生元[7]。乳糖醇是由半乳糖和山梨醇組成的雙塘，具有β-半乳糖苷鍵[8]。乳糖醇在小腸內(nèi)不被消化，可以被結(jié)腸中的乳酸菌發(fā)酵。作為益生元，乳糖醇能夠促進益生菌，如雙歧桿菌和乳酸桿菌在結(jié)腸中的生長，也能選擇性地減少腐敗細菌的數(shù)量，從而降低腸道pH 值以及氨的產(chǎn)生和吸收；乳糖醇還可以促進腸道對鈣、鎂離子的吸收[9-10]。與其它多元醇類似，乳糖醇是安全的，聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織下的食品添加劑聯(lián)合專家委員會“未指定”其每日允許攝入量[10]。而合生元作為益生菌和益生元的混合制劑，不僅具有益生菌的生理功能，還可發(fā)揮益生元的生理作用[11]。

微膠囊為益生菌提供了一個相對適宜的微環(huán)境，使菌體與相對惡劣的外界環(huán)境隔離開，合生元的微膠囊化不僅可以提高益生菌在胃腸道中的存活率，還可以改善不同類型微生態(tài)制劑的貨架穩(wěn)定性[12-13]。內(nèi)源乳化法因制備的微膠囊粒徑小，易于實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用。蛋白質(zhì)，尤其是牛奶蛋白，因其食用的安全性和所形成的凝膠具有良好的pH 敏感性，可控的通透性和較高的凝膠強度，本身的自我組裝及離子結(jié)合能力，對于胃酸環(huán)境優(yōu)良的緩沖能力等特點，而受到越來越多的關(guān)注。通過酶、酸以及金屬離子的交聯(lián)作用，蛋白質(zhì)可在室溫下形成結(jié)構(gòu)致密的凝膠，同時反應(yīng)條件溫和，因此蛋白質(zhì)成為極具前景的益生元包埋壁材[14]。

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（Transglutaminase，TGase，EC 2.3.2.13）是一種催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的酶，它可以通過谷氨酰胺殘基的γ-羧酰胺基（氨基受體）和賴氨酸殘基的ε-氨基或其它伯胺基（氨基供體）之間的?；D(zhuǎn)移反應(yīng)形成ε-（γ-谷氨基）賴氨酸異肽鍵，從而實現(xiàn)蛋白質(zhì)分子內(nèi)、分子間的交聯(lián)[15]。這種交聯(lián)作用可以溫和地將蛋白/益生菌混合物液滴轉(zhuǎn)化為膠囊化的粒子[16]。利用海藻酸鈉進行二次包埋可以保護膠囊免受胃蛋白酶的作用，從而避免蛋白膠囊的崩解[17]。

黏玉米來源TGase（TGZ）是一種植物來源的TGase。目前本課題組將TGZ 在畢赤酵母中進行可溶性表達，產(chǎn)量達7.6 mg/L，并對其性質(zhì)進行初步研究[18]。研究表明，同微生物來源TGase（MTG）一樣，酪蛋白是TGZ 作用的良好底物[19]。本試驗以重組TGZ 為催化劑，以酪蛋白為壁材通過內(nèi)源乳化法包埋干酪乳桿菌/乳糖醇合生元制備微膠囊，并用海藻酸鈉進行微膠囊的二次包衣，通過微膠囊粒徑和益生菌在模擬胃腸液中的存活率考察包埋效果。最后，將制備的微膠囊添加到橙汁飲料中，對貯存條件下橙汁中干酪乳桿菌的存活量進行研究，為其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種、材料和試劑

干酪乳桿菌（Lactobacillus casei 28-2）為本實驗室自行分離與保存。TGZ 來自重組畢赤酵母，酶活性為1 078 mU/mL，產(chǎn)量為7.6 mg/L。

酪蛋白酸鈉，北京銀河路經(jīng)貿(mào)有限公司；乳糖醇，上海源葉生物科技有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶，Sigma-Aldrich；大豆油，當?shù)爻校黄渌噭┚鶠閲a(chǎn)分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

生化培養(yǎng)箱、潔凈工作臺、立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司；恒溫振蕩培養(yǎng)器，天津歐諾儀器股份有限公司；激光粒度分布儀，丹東百特儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌懸液的制備 活化好的干酪乳桿菌接種于MRS 液體培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)20 h 后，離心收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌2 次后分別重懸于0，5.0，10，15，20 g/100 mL 和25 g/100 mL 的乳糖醇溶液，制備菌懸液。

1.3.2 合生元的單層包埋 配制10 g/100 mL 的酪蛋白溶液，于4 ℃攪拌過夜達到完全水合。用1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH 至7.0。分別取2 mL 的濃縮菌液與18 mL 的酪蛋白溶液混合，使其菌數(shù)在1010CFU/mL，乳糖醇濃度分別在0，0.5，1.0，1.5，2.0 g/100 mL 和2.5 g/100 mL。加入TGZ，使其終濃度為15 U/g，混合均勻后，迅速倒入預(yù)熱（42 ℃）的大豆油中，并置于磁力攪拌器（600 r/min，42 ℃）攪拌4 h。攪拌過程中，TGZ 催化酪蛋白包埋合生元乳化的液滴，形成膠體顆粒。500 g 離心5 min 收集膠體顆粒，用無菌生理鹽水洗滌3 次，重新收集膠體顆粒，4 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 合生元的雙層包埋 15 g 酪蛋白包埋的膠體顆粒加入到100 mL 1.0 g/100 mL 的海藻酸鈉溶液，置于磁力攪拌器（600 r/min）攪拌30 min。700 g 離心5 min 收集微膠囊，然后懸浮于100 g含有0.05%吐溫80 和1.11%CaCl2的大豆油中，繼續(xù)攪拌30 min。添加200 mL 1.11%CaCl2到混合液中打破乳化，500 g 離心5 min 收集雙層包埋微膠囊，用無菌生理鹽水洗滌3 次，重新收集微膠囊，4 ℃貯存?zhèn)溆谩Ｓ眉す饬６确植純x對雙層包埋微膠囊進行粒徑的測量。

1.3.4 包埋率的測定 將微膠囊和裂解液（0.06 mol/L 檸檬酸鈉和0.2 mol/L 碳酸氫鈉）混合，于37℃緩慢攪拌1 h 弱化海藻酸鈉的交聯(lián)作用。把0.5 g 弱化后的微膠囊加入到4.5 mL 磷酸鹽緩沖液中（pH 6.8），用高速均質(zhì)機破碎微膠囊，37 ℃恒溫振蕩30 min，釋放包埋的干酪乳桿菌28-2。稀釋混合液涂布MRS 平板進行活菌計數(shù)。包埋率按公式（1）計算。

式中，N——包埋后微膠囊中的活菌數(shù)；N0——包埋前的活菌數(shù)。

1.3.5 微膠囊在模擬胃腸液中的存活實驗 模擬胃液和模擬腸液的配制方法參照文獻[20]配制。0.5 g 微膠囊溶于9.5 mL 模擬胃液中，37 ℃，100 r/min 恒溫振蕩30，60，90，120 min。收集微膠囊重懸于9.5 mL 模擬腸液中，37 ℃，100 r/min 恒溫振蕩4 h。稀釋混合液涂布MRS 平板進行活菌計數(shù)。

1.3.6 微膠囊形態(tài)分析 將新鮮制備的微膠囊用戊二醛溶液固定后，在pH 7.2 的磷酸鹽緩沖液中洗滌，用不同濃度的乙醇溶液梯度脫水、氯仿脫脂，進行冷凍干燥。將干燥樣品進行離子濺射噴金，用掃描電子顯微鏡觀察微膠囊的形態(tài)。

1.3.7 合生元微膠囊的應(yīng)用研究 將10 g 微膠囊加入到100 mL 橙汁中，4 ℃貯存28 d。分別于第1，7，14，21，28 天取樣進行菌數(shù)測定，方法同1.3.4節(jié)。

2 結(jié)果與分析

2.1 微膠囊粒徑和包埋率 用激光粒度分布儀對包埋的微膠囊進行粒徑的測量。由表1 可知，沒有添加乳糖醇時，微膠囊的粒徑最?。?00.5 μm）。添加乳糖醇后，微膠囊粒徑顯著增大（340.3～372.9 μm）。乳糖醇添加量為1.0 g/100 mL 時，粒徑最小，為340.3 μm，乳糖醇添加量為2.5 g/100 mL 時，粒徑達到最高值372.9 μm。

表1 乳糖醇添加量對微膠囊包埋率和粒徑的影響Table 1 Effect of different lactitol concentrations on the encapsulation efficiency and particle size

包埋率是評價微膠囊質(zhì)量的重要指標。包埋率越高，說明益生菌與外界環(huán)境接觸越少，對益生菌的保護作用越強[14]。由表1 可知，包埋前干酪乳桿菌的活菌數(shù)差異不顯著，在10.91～10.93 lg（CFU/g）。包埋后活菌數(shù)均有所下降，添加2.5 g/100 mL 乳糖醇時，下降最顯著，包埋率為11.41%。乳糖醇添加量為1.0 g/100 mL 時，包埋率最高（61.73%），顯著高于未添加乳糖醇的46.34%。很多因素影響益生菌的包埋率，如包埋前益生菌數(shù)量、益生元類型、包埋方式、壁材種類等。有文獻報道，益生元（Hi-maize）可以顯著提高益生菌的包埋率和存活率[21]，然而也有研究表明益生元（槲黃素）的存在降低了益生菌的包埋率和存活率[22]。本試驗中，乳糖醇的添加易于干酪乳桿菌的包埋，這可能是由于乳糖醇的存在增大了微膠囊粒子的體積，使更多益生菌被包埋，從而提高了包埋率。過高的添加量雖然增大了微膠囊的體積，但是也使得更多的乳糖醇包埋于粒子中，反而降低了包埋率。

2.2 包埋后干酪乳桿菌在模擬胃腸液中的存活量

圖1 酪乳桿菌在模擬胃腸液中的活菌數(shù)的變化Fig.1 Number of survival cells of microencapsulated L.casei after incubation in stimulated gastrointestinal condition

包埋后干酪乳桿菌對胃腸道的耐受性如圖1所示。隨著微膠囊在模擬胃液中作用時間的延長，干酪乳桿菌的存活數(shù)有所下降。未添加乳糖醇的干酪乳桿菌的活菌數(shù)最少為4.97 lg（CFU/g），添加乳糖醇后的活菌數(shù)為6.66～8.08 lg（CFU/g），均顯著高于對照菌數(shù)。添加乳糖醇后干酪乳桿菌活菌數(shù)在模擬胃液中處理90 min 后開始上升。低濃度（0.5 g/100 mL）時，上升速度緩慢，到120 min 后，僅增加了0.89 個對數(shù)值。添加量為1.0 g/100 mL時，活菌數(shù)增長最顯著，為2.35 個對數(shù)值。之后，隨著乳糖醇添加量的增加，增長速度開始減慢，添加量為2.5 g/100 mL 時，增長量為0.98 個對數(shù)值。模擬胃腸道耐受性結(jié)果表明，乳糖醇的添加可以增加干酪乳桿菌對胃腸道的耐受性，這與其它關(guān)于益生元增加益生菌耐受性的報道結(jié)果一致[23]。另外，乳糖醇的添加還可以增加干酪乳桿菌在模擬胃腸道中的存活菌數(shù)。乳糖醇是一種乳糖衍生的糖醇，可作為益生菌發(fā)酵的碳源。Kontula 等[24]早在1999 年就報道過乳酸菌利用乳糖生長繁殖，隨后有許多關(guān)于乳糖醇促進益生菌生長的報道。研究表明，乳糖醇可以促進乳酸桿菌（如鼠李糖乳桿菌）、雙歧桿菌（幼兒雙歧桿菌）的生長，這可能是因為乳糖醇可以被干酪乳桿菌利用，減少氨的形成，改變腸道pH 值，從而促進了干酪乳桿菌的生長[10，25]。對乳糖醇/嗜酸乳桿菌NCFM 合生元組合的研究表明，其在人類結(jié)腸模型和臨床干預(yù)中發(fā)揮了一定的功能特性[26-27]。同時微膠囊緊密的抗穿透表面可以作為一個強大的物理屏障，在通過胃腸道時保護益生菌細胞，提高其存活率。綜合上述結(jié)果可知，乳糖醇添加量為1.0 g/100 mL 時，其粒徑最小，包埋率最高，對胃腸道的耐受性最好。

2.3 微膠囊形態(tài)分析

由于冷凍干燥過程會導(dǎo)致膠囊收縮和不規(guī)則形狀的形成乃至膠囊破碎，因此使用戊二醛將微膠囊固定，保證微膠囊能夠在掃描電鏡下觀察到較為完整的結(jié)構(gòu)，掃描電鏡結(jié)果見圖2。由圖2 可知雙層包埋的乳糖醇/干酪乳桿菌合生元微膠囊及干酪乳桿菌微膠囊均呈球形，有完整的結(jié)構(gòu)。兩種微膠囊的表面未觀察到乳酸菌，表明干酪乳桿菌完全被包埋壁材捕獲，存在于微膠囊內(nèi)部。與乳酸菌微膠囊相比（圖2a 和2b），添加乳糖醇后，微膠囊的聚集更加明顯，且表面出現(xiàn)少許凹陷和明顯褶皺（圖2c 和2d）。這可能是由于微膠囊形成過程中碳水化合物含量較高所致。

圖2 微膠囊的掃面電鏡分析Fig.2 SEM images of freeze dried alginate-coated microcapsules

2.4 微膠囊在橙汁中的應(yīng)用

將含有1.0 g/100 mL 乳糖醇的合生元雙層包埋后，添加到橙汁中進行貯存穩(wěn)定性試驗，結(jié)果如圖3 所示。在4 ℃貯存28 d 期間，不含乳糖醇橙汁中的干酪乳桿菌的活菌數(shù)呈下降趨勢，最終從9.94 lg（CFU/g）降低到9.14 lg（CFU/g）。添加乳糖醇橙汁的最初干酪乳桿菌含量為9.89 lg（CFU/g），28 d 后的活菌數(shù)為9.65 lg（CFU/g），兩者差異不顯著，說明乳糖醇的添加可以提高干酪乳桿菌在橙汁中的穩(wěn)定性。28 d 后，添加乳糖醇比未添加乳糖醇的活菌數(shù)高0.56 個對數(shù)值。Krasaekoopt 和Watcharapoka[28]的研究結(jié)果顯示，4 ℃貯存28 d 后添加低聚半乳糖的益生菌比未添加的干酪乳桿菌高0.4 個對數(shù)值，比嗜酸乳桿菌高0.5 個對數(shù)值。說明益生元的添加可以提高微膠囊在橙汁中的貯藏穩(wěn)定性。

圖3 橙汁貯存期間干酪乳桿菌活菌數(shù)的變化（4 ℃，28 d）Fig.3 Number of L.casei in orange juice during storage at 4°C for 28 d

3 結(jié)論

本研究用黏玉米來源TGase 作為催化劑交聯(lián)酪蛋白包埋干酪乳桿菌/乳糖醇合生元，用海藻酸鈉為壁材進行二次包埋后獲得了合生元雙層微膠囊。結(jié)果表明，乳糖醇添加量為1.0 g/100 mL 時，微膠囊的粒徑最小，包埋率最大，可有效提高干酪乳桿菌在模擬胃腸道條件下的存活率。掃面電鏡結(jié)果證實了壁材對干酪乳桿菌的完全捕獲。橙汁貯存試驗表明，添加乳糖醇后，干酪乳桿菌活菌數(shù)在4 ℃貯存28 d 后，僅下降了0.24 個對數(shù)值。乳糖醇的添加可以增加益生菌對外界環(huán)境的耐受性，有助于益生菌的生長，這為乳糖醇合生元產(chǎn)品的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。