有機酸改性對玉米醇溶蛋白膜機械性能的影響

王 鍵 何余堂 尹天罡 解玉梅 劉 賀

（渤海大學食品科學與工程學院 國家魚糜及魚糜制品加工技術研發(fā)分中心生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州 121013）

目前，塑料包裝因難回收、難降解等而造成的環(huán)境污染問題日益嚴重。隨著現(xiàn)代環(huán)保生活理念的日益普及，推動了對可生物降解包裝材料的需求。為制備良好的生物降解性材料，一方面，將一些生物降解劑和添加劑添加到合成塑料基質(zhì)中，使其在自然環(huán)境中不穩(wěn)定且易于降解[1-3]；另一方面，將某些具有成膜性能的生物聚合物作為天然包裝及食品保鮮材料。其中，某些多糖和蛋白質(zhì)已被證明是理想的包裝材料，其中一些已被商業(yè)應用[4-7]。在潛在的天然包裝及食品保鮮材料中，玉米醇溶蛋白是一種值得研究的理想材料[8-10]。美國FDA 還將其列為最安全的生物材料賦形劑之一[11]。

玉米醇溶蛋白具有特殊的氨基酸組成，其含有必需氨基酸較少，營養(yǎng)價值低[12]，然而其成膜性極佳，無需添加任何塑化劑、鞣制劑就可以在常溫下形成阻濕、阻氧、耐油、抗輻射的蛋白膜[13]，在特種食品保鮮、包裝及制藥行業(yè)具有很強的應用潛質(zhì)。玉米醇溶蛋白膜在現(xiàn)實生活中應用的瓶頸是其較差的機械性能，這也是植物蛋白膜共同的缺點。

玉米醇溶蛋白成膜的作用力是蛋白間疏水鍵、氫鍵和有限的二硫鍵。添加塑化劑，如甘油可改善玉米醇溶蛋白膜的機械性能，而在存放過程中，玉米醇溶蛋白分子矩陣中的甘油會慢慢遷移至表面導致塑化效果失效。對玉米醇溶蛋白改性也許是解決玉米醇溶蛋白膜機械性能問題的有效手段?；瘜W改性是用化學方法使蛋白質(zhì)分子中的氨基酸殘基的側(cè)鏈基團或多肽鏈發(fā)生斷裂、聚合或引入新的基團來改變蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的方法，包括磷酸化、?；?、去酰氨、共價交聯(lián)、糖基化等多種改性方式[14-16]。這些方法可以改善玉米醇溶蛋白膜的一些性質(zhì)，然而，其機械性能差的缺點卻無法解決。由于檸檬酸可對玉米醇溶蛋白膜機械性能產(chǎn)生較大影響[17]，因此選用了與之結(jié)構(gòu)相近的乙酸、乳酸、琥珀酸、蘋果酸、酒石酸和檸檬酸共6 種有機羧酸，研究其對玉米醇溶蛋白膜的影響。這些羧酸不僅在水和乙醇中均有良好的溶解度，而且是食品工業(yè)中常用的添加劑。使用這些添加劑對玉米醇溶蛋白改性，保障了其食用的安全性。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設備

鮮玉米，墾粘4 號（籽粒黃色），產(chǎn)地為遼寧省錦州；復合生物保鮮劑由本課題組研制。

檸檬酸（AR），天津市致遠化學試劑有限公司；蔗糖酯，杭州瑞霖化工有限公司；其它試劑，天津市化學試劑一廠。玉米醇溶蛋白，自制；琥珀酸（AR），美國阿拉丁工業(yè)公司；蘋果酸（AR），天津市福晨化學試劑廠；酒石酸（AR），上海翰思化工有限公司；乳酸（AR）、冰乙酸（AR）、無水乙醇（AR）、氫氧化鈉（AR），天津市風船化學試劑科技有限公司。

恒溫水浴鍋（HH-4 型），鄄城威瑞科技儀器有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9075A），上海一恒科學儀器有限公司；質(zhì)構(gòu)儀（TA.XT plus型），北京超技儀器有限公司；真空冷凍干燥機（ALPHA 1-2LD PLUS 型），寧波海曙恒隆試驗器材有限公司；場發(fā)射掃描電鏡（S-4800 型），日本株式會社日立制作所。

1.2 試驗方法

1.2.1 玉米醇溶蛋白的制備 將玉米蛋白粉用粉碎機粉碎研磨成細小顆粒，過70 目篩得到均勻的玉米蛋白粉，取80 g 玉米蛋白粉于燒杯中并按一定料液比加入乙醇水溶液，混合均勻后用0.4 g/mL NaOH 溶液調(diào)節(jié)溶液pH 值。將調(diào)好pH 值的玉米蛋白粉溶液放入超聲發(fā)生器中超聲提取，待提取完畢后將溶液以4 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心15 min。取上層清液，并加入等體積的0.01 g/mL NaCl 溶液置入4 ℃冰箱靜置12 h 得濕玉米醇溶蛋白沉淀，取出沉淀反復清洗至中性。最后將沉淀物放入干燥箱40 ℃干燥至恒重取出，研磨過60目篩，即可得到產(chǎn)物玉米醇溶蛋白[18]。

1.2.2 有機酸改性玉米醇溶蛋白膜的制備 量取10 mL 乙醇溶液置于燒杯中，加入改性劑有機酸，經(jīng)磁力攪拌充分混勻，再稱取1 g 玉米醇溶蛋白，在磁力攪拌下慢慢加入玉米醇溶蛋白粉使其充分分散溶解，最終形成0.1 g/mL 濃度的玉米醇溶蛋白溶液。慢慢將玉米醇溶蛋白膜溶液傾倒于不銹鋼板上，再用涂膜器將膜液均勻涂膜以盡量確保成膜后的玉米醇溶蛋白膜厚度一致，將附有膜液不銹鋼板置于室溫中干燥平衡12 h 即可制得改性膜。

堿催化有機羧酸改性玉米醇溶蛋白膜的制備，是在有機酸改性玉米醇溶蛋白膜液制備后，加入研磨成粉的氫氧化鈉顆粒，調(diào)整pH 值并加熱至60 ℃保溫30 min，待反應完成后，將膜液傾倒于不銹鋼板上干燥成改性膜。

1.2.3 玉米醇溶蛋白膜機械性能測定 用于玉米醇溶蛋白膜機械性能測定的樣品，需先將膜置于常溫50%相對濕度的生化培養(yǎng)箱中平衡24 h 以上。裁剪膜為長度60 mm，寬度10 mm 的長條狀樣品，質(zhì)構(gòu)儀的參數(shù)設定為初始夾具間距30 mm，機頭抬升速度60 mm/min，待樣品夾好運行測試程序，記錄膜樣品拉斷時所受力（N）與斷裂長度（mm），厚度用螺旋測微器測出。

樣品的抗拉強度[19]（TS）由以下公式計算得出：

式中，F(xiàn)max——膜樣品拉斷時所受力，N；W——膜樣品的寬度，mm；T——膜樣品的厚度，mm。

樣品的延展率（E）由以下公式計算得出：

式中，L0——膜樣品的初始長度，mm；L——膜樣品在拉斷時的長度，mm。每個樣品重復5 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 制備條件對玉米醇溶蛋白膜機械性能影響

2.1.1 乙醇體積分數(shù) 如圖1 所示，乙醇體積分數(shù)對玉米醇溶蛋白膜機械性能影響較小，乙醇體積分數(shù)為90%時，膜的機械性能處在均衡水平，所成膜的各項指標較好，膜外觀平整透明，無不溶物，完整度高。隨著乙醇體積分數(shù)的升高膜的抗拉強度略有上升，這可能是由于在較高的體積分數(shù)下，玉米醇溶蛋白分子中疏水氨基酸殘基暴露程度增大，疏水相互作用增強，分子間聚集結(jié)合程度高，使得其抗拉強度增加，然而，乙醇體積分數(shù)對于抗拉強度總體上來說影響不大。膜的延展率則在一定程度上表現(xiàn)出了無序性且普遍誤差較大。

2.1.2 無堿改性羧酸添加量 無堿改性共有6 種羧酸，選用檸檬酸作為測試羧酸添加量的試劑是由于在預試驗中，檸檬酸對玉米醇溶蛋白膜的性質(zhì)改變溫和，效果較好。

圖1 乙醇體積分數(shù)對玉米醇溶蛋白膜機械性能影響Fig.1 Effects of ethyl concentration on zein film mechanical property

如圖2 所示，檸檬酸對玉米醇溶蛋白膜的機械性能影響明顯，考慮到檸檬酸添加量在超過4%時，黏性增加不利于制膜，因此選擇檸檬酸最佳添加量為3%做后續(xù)試驗。隨著檸檬酸添加量的增加，玉米醇溶蛋白膜的機械性能呈平穩(wěn)下降趨勢，其延展率卻顯著提高，這表明檸檬酸在膜體系中起到了塑化劑的作用。

圖2 檸檬酸添加量對玉米醇溶蛋白膜機械性能影響Fig.2 Effects of CA concentration on zein film mechanical property

2.1.3 加堿催化改性溶液的pH 值 由于6 種羧酸酸性不同，不易統(tǒng)一固體NaOH 添加量，因此使用溶液的pH 值來反應NaOH 的添加量，其值是整個反應過程的關鍵因素。

如圖3 所示，在膜液pH 值為5.0 時，玉米醇溶蛋白改性膜的抗拉強度達到最大，然而其膜的延展率下降嚴重，考慮到堿催化改性膜的抗拉強度是重要指標，因此選用最佳pH 值為5。在膜液pH 值較低的反應初期，玉米醇溶蛋白膜的抗拉強度顯著增加，而隨著膜液pH 值的增加，膜的抗拉強度反而下降，這可能是由于玉米醇溶蛋白氨基酸殘基與檸檬酸之間交聯(lián)過度，適度的交聯(lián)可以增強玉米醇溶蛋白分子間的作用力，使膜的強度提升，隨著反應程度增加，玉米醇溶蛋白原有結(jié)構(gòu)被破壞，大分子物質(zhì)形成，分子間作用力下降，導致玉米醇溶蛋白膜的抗拉強度下降，所以需要控制交聯(lián)反應程度。膜液pH 值也對玉米醇溶蛋白膜的延展率影響顯著，隨著膜液pH 值的生高，膜的延展率快速下降，在膜液pH 值為4.0 時已達到較低水平。說明交聯(lián)反應可在分子間產(chǎn)生作用力較強的共價鍵，降低了分子的流動性，使得膜的延展率大幅下降。

2.2 羧酸種類對玉米醇溶蛋白膜機械性能的影響

在玉米醇溶蛋白含量0.1 g/mL，乙醇體積分數(shù)90%，羧酸添加量0.03 g/mL，加堿改性溶液pH值調(diào)整至5.0，反應溫度60 ℃，反應時間30 min 的條件下，6 種羧酸對玉米醇溶蛋白改性具體結(jié)果見表1。

由表1 可知改性對于玉米醇溶蛋白膜的厚度影響不顯著，說明改性并未使玉米醇溶蛋白膜厚度顯著增加。無堿催化下，改性膜抗拉強度：冰乙酸＞對照組＞琥珀酸＞酒石酸＞檸檬酸＞乳酸＞蘋果酸，延展率：蘋果酸＞檸檬酸＞乳酸＞琥珀酸＞酒石酸＞冰乙酸＞對照組。蘋果酸對于玉米醇溶蛋白膜的延展率最大，達到（228.17±26.53）%，相較于對照組顯著提升，然而也造成了膜的剛性應力丟失，其抗拉強度僅為（0.70±0.05）MPa。檸檬酸改性膜延展率提升至（137.86±19.72）%且保持了（4.65±0.18）MPa 的抗拉強度，綜合性能最佳。堿催化改性下，改性膜抗拉強度：檸檬酸＞酒石酸＞琥珀酸＞乳酸＞冰乙酸＞對照組＞蘋果酸，延展率則與對照組無顯著差異。堿催化檸檬酸改性使膜抗拉強度增加至（12.73±1.05）MPa，得到了強度很高的膜，然而其延展率不理想，僅為（3.65±0.21）%。

圖3 反應pH 值對玉米醇溶蛋白膜機械性能影響Fig.3 Effects of pH on zein film mechanical property

表1 不同羧酸對膜機械性能的影響Table 1 Effects of different carboxylic acids on the mechanical property of zein film

2.3 羧酸種類對玉米醇溶蛋白膜改性機理推測

在玉米醇溶蛋白含量0.1 g/mL，乙醇體積分數(shù)90%，羧酸添加量0.03 g/mL，加堿改性溶液pH 值調(diào)整至5.0，反應溫度60 ℃，反應時間30 min 的條件下，6 種羧酸對玉米醇溶蛋白改性具體結(jié)果見圖4。

圖4 6 種羧酸結(jié)構(gòu)Fig.4 The structure of six carboxylic acids

結(jié)合表1 結(jié)果，無堿羧酸改性條件下，使玉米醇溶蛋白膜柔性增加的羧酸有一個共同點：只含有一個羥基基團，顯然是羥基基團與水分子、玉米醇溶蛋白分子之間的氫鍵作用使膜分子流動性增強，體系自由體積增加，然而，酒石酸含有兩個羥基基團，卻沒有顯著的增加玉米醇溶蛋白膜的延展率，可能是由于兩個羥基基團會導致酒石酸分子間形成氫鍵，而導致了與玉米醇溶蛋白氨基酸殘基無法氫鍵連接。

加堿反應可能發(fā)生了交聯(lián)反應，然而，反應原理應與?；磻煌浣宦?lián)機理如圖5 所示。

圖5 羧酸與玉米醇溶蛋白交聯(lián)機理[20]Fig.5 Carboxylic acid and zein crosslinking mechanism[20]

通過上述反應，檸檬酸將兩個蛋白分子交聯(lián)在一起，發(fā)生此反應要求羧酸至少需要含有兩個羧基基團，表中數(shù)據(jù)也證實了這一觀點，一元酸乳酸和冰乙酸對玉米醇溶蛋白膜的抗拉強度在堿催化反應下沒有提升，表明乳酸和冰乙酸未與玉米醇溶蛋白分子交聯(lián)反應。二元酸在堿催化下與玉米醇溶蛋白發(fā)生交聯(lián)反應，使蛋白膜的抗拉強度提升。二元酸中蘋果酸是特例，其與玉米醇溶蛋白的交聯(lián)沒有提升膜的抗拉強度，這可能是由于反應前，蘋果酸使玉米醇溶蛋白膜抗拉強度降低到了一個較低的程度，隨著反應發(fā)生，改性膜的抗拉強度雖由0.70 MPa 上升至4.02 MPa，然而已無法恢復到原有水平。交聯(lián)反應的發(fā)生導致了分子流動性變差，膜的延展率均顯著降低。由于控制了反應進程，交聯(lián)的程度較小，沒有大分子質(zhì)量物質(zhì)形成，對膜的結(jié)構(gòu)變化只在于微觀量上，膜厚度增加不明顯。

3 結(jié)論

通過對玉米醇溶蛋白改性膜的制備條件試驗，最佳的有機酸無堿改性玉米醇溶蛋白膜制備條件為玉米醇溶蛋白含量0.1 g/mL，乙醇體積分數(shù)90%，羧酸添加量0.03 g/mL。堿催化有機酸改性玉米醇溶蛋白膜制備條件為在玉米醇溶蛋白含量0.1 g/mL，乙醇體積分數(shù)90%，羧酸添加量0.03 g/mL，加堿改性溶液pH 值調(diào)整至5.0，反應溫度60 ℃，反應時間30 min。在此條件下所制玉米醇溶蛋白膜平坦易揭，完整性好，綜合機械性能佳。

在不同有機酸改性時，蘋果酸對于玉米醇溶蛋白膜的延展率最大，達到（228.17±26.53）%，而其抗拉強度僅為（0.70±0.05）MPa。檸檬酸改性膜延展率提升至（137.86±19.72）%且保持了（4.65±0.18）MPa 的抗拉強度，綜合性能最佳。堿催化改性下，堿催化檸檬酸改性使膜抗拉強度增加至（12.73±1.05）MPa，得到了強度很高的膜，然而其延展率不理想，僅（3.65±0.21）%。通過對有機酸結(jié)構(gòu)的分析，猜測其改性機理為：具有1 個羥基基團的羧酸可與膜體系形成氫鍵，使得膜分子流動性增強，提高膜的延展率；具有2 個以上羧基基團的羧酸，在堿的催化下可與玉米醇溶蛋白氨基酸殘基發(fā)生交聯(lián)反應，使膜的抗拉強度提升。