脈沖強(qiáng)光對黃曲霉菌孢子的殺菌效果、微觀結(jié)構(gòu)及動力學(xué)的影響

王 蓓 洪 晨 Ragab Khir 潘忠禮* 馬海樂 周存山

（1 江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 江蘇鎮(zhèn)江 212013 2 加利福尼亞大學(xué)戴維斯分校生物與農(nóng)業(yè)工程系 美國戴維斯 95616）

黃曲霉菌（Aspergillus flavus）是一類土壤腐生真菌，菌體由許多復(fù)雜的分枝菌絲構(gòu)成，氣生菌絲形成分生孢子梗，小梗上著生球形分生孢子[1]，成熟的孢子會隨氣流附著在食品表面。孢子在食品儲藏過程中萌發(fā)生長，產(chǎn)生劇毒的次級代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素（aflatoxin），而真菌本身也會導(dǎo)致動物和免疫功能低下人群曲霉病發(fā)病率的增加[2]。由于黃曲霉菌孢子潛在危害大，繁殖能力極強(qiáng)，易散播，對食品安全及人類健康存在很大的威脅，因此，需要對其進(jìn)行有效的殺菌。目前常用的殺菌方式主要是熱力殺菌、化學(xué)殺菌和輻照殺菌等[3-5]。這些方法在對食品風(fēng)味質(zhì)量、殘留、消費者可接受程度等方面存在不足，亟需一種高效、安全、環(huán)保的殺菌技術(shù)。

脈沖強(qiáng)光（Pulsed light）是一種新興的非熱殺菌方式，具有高效、節(jié)能、環(huán)保、安全等特點。脈沖強(qiáng)光技術(shù)是利用瞬間放電以脈沖的形式激發(fā)燈管中的惰性氣體，發(fā)出強(qiáng)烈的白光，其產(chǎn)生的光熱和光化效應(yīng)能破壞微生物的細(xì)胞壁和DNA 結(jié)構(gòu)，從而殺滅微生物[2]。

微生物致死動力學(xué)模型可以定量評價和預(yù)測殺菌效果，對實際應(yīng)用具有指導(dǎo)意義。在傳統(tǒng)熱力學(xué)殺菌中，常應(yīng)用一級動力學(xué)方程[6]，采用D 值或Z 值來確定殺菌工藝[6-8]。熱力學(xué)殺菌的機(jī)理是使蛋白質(zhì)變性，酶鈍化或失活，而酶鈍化的過程符合一級動力學(xué)方程。傳統(tǒng)紫外殺菌是通過破壞DNA使菌代謝紊亂、失活，其中紫外殺菌模型常采用Log-linear 模型[9-10]。而脈沖強(qiáng)光與熱力學(xué)殺菌和紫外殺菌機(jī)理不同，它是通過光熱和光化的協(xié)同作用殺滅微生物，因此，需要建立新的殺菌動力學(xué)模型以描述其殺菌特征。研究發(fā)現(xiàn)脈沖強(qiáng)光殺菌動力學(xué)曲線更加符合非線性模型[11-14]。在脈沖強(qiáng)光殺菌過程中，根據(jù)殺菌對象不同，模型也有所不同。張瑞雪等[15]研究脈沖強(qiáng)光對副溶血性弧菌的動力學(xué)模型，發(fā)現(xiàn)Weibull 模型和Log-logistic 模型較Linear 模型能更好地模擬殺菌動力學(xué)。Izquier 等[16]對蔬菜上自然產(chǎn)生的細(xì)菌進(jìn)行脈沖強(qiáng)光殺菌，發(fā)現(xiàn)生菜、卷心菜和胡蘿卜適合采用Weibull 模型，同時生菜也適合Weibull+tail 模型。本試驗以黃曲霉菌孢子為受試菌株，研究脈沖強(qiáng)光強(qiáng)度和處理時間對固體培養(yǎng)基中黃曲霉菌孢子的殺菌效果，并對處理前、后孢子的微觀形態(tài)進(jìn)行掃描電鏡分析。運用Log-linear 模型、Weibull 模型和Weibull+tail 模型對殺菌致死曲線進(jìn)行動力學(xué)分析，以期為食品及農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉殺滅的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

黃曲霉菌株（Aspergillus flavus）NRRL-3357，美國農(nóng)業(yè)部西部研究中心；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA 培養(yǎng)基），美國Sigma-Aldrich 公司；巴特菲爾德磷酸緩沖溶液（Butterfield's phosphate buffer）及其余試劑（均為分析純級），美國Sigma-Aldrich 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SteriPule-XL?3000 實驗室規(guī)模脈沖強(qiáng)光殺菌系統(tǒng)，美國Xenon 公司，具體設(shè)備參數(shù)見文獻(xiàn)[17]；NU-425-600 型超凈工作臺，美國NuAire股份有限公司；FFU20F3AWA 型恒溫培養(yǎng)箱，美國Scientific Division，Jouan 股份有限公司；SR-24C 型高壓滅菌鍋，美國Consolidated Stills &Sterilizers 公司；K-550-G 型漩渦振蕩儀，美國Scientific Industries 股份有限公司；S-4700 掃描電子顯微鏡（SEM），美國Hitachi High-Technologies 股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 黃曲霉菌孢子懸液的制備 取活化后的黃曲霉菌斜面試管，用無菌接種環(huán)小心的刮取表面形成的孢子，轉(zhuǎn)入裝有10 mL 緩沖溶液的錐形瓶中，重復(fù)上述步驟，制成孢子懸液。將錐形瓶置于漩渦振蕩器上，振蕩1 min 后獲得分散的菌絲-孢子懸液。用3 層無菌紗布過濾此懸液得到孢子懸液，將孢子懸液的濃度調(diào)整到105CFU/mL。

將0.1 mL 黃曲霉菌孢子懸液均勻涂布于直徑為60 mm 的無菌PDA 平板上，蓋上蓋子并放置于無菌環(huán)境中20 min，待表面水分蒸發(fā)備用。

1.3.2 脈沖強(qiáng)光殺菌 將涂布好黃曲霉菌孢子的平板放置于脈沖強(qiáng)光殺菌室燈管正下方，移去培養(yǎng)皿蓋。設(shè)定樣品與石英窗之間的距離分別為5，9，13，17 cm，處理不同時間（1～60 s）做3 組平行試驗。石英窗與燈管的距離為5.8 cm，上述距離對應(yīng)的脈沖強(qiáng)光的強(qiáng)度分別為2.86，1.60，1.08，0.93 W/cm2。處理后的培養(yǎng)皿放置于30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d 后進(jìn)行菌落計數(shù)。

1.3.3 菌落計數(shù) 按照國標(biāo)GB 4789.2-2016[18]對處理前、后黃曲霉菌孢子進(jìn)行菌落計數(shù)。

1.3.4 掃描電鏡分析 將黃曲霉菌孢子懸液分成未處理組和脈沖強(qiáng)光處理組，未處理組：直接吸取0.25 mL 未處理孢子懸液注入固定液中；脈沖強(qiáng)光處理組：將0.25 mL 孢子懸液在強(qiáng)度為1.08 W/cm2的脈沖強(qiáng)光下處理10 s 后收集注入固定液中。參照文獻(xiàn)[19]的方法進(jìn)行電鏡檢測。將固定好的樣品用臺式離心機(jī)離心2 min 以濃縮孢子。濃縮的孢子用pH 7.2 的0.1 mol/L 二甲胂酸鈉緩沖液重新使孢子懸浮，并沖洗3 次，每次離心1 min 然后固定于1%四氧化鋨溶液中。孢子用水重新懸浮并沖洗3 次，每次離心1 min。孢子重新懸浮于水中，并使用0.1 μm 孔徑的核孔徑跡蝕刻膜過濾器過濾。膜過濾器預(yù)先用聚-L-賴氨酸處理以提高孢子對膜的附著力。將膜置于13 mm 膜固定器上，并連接到3 mL 一次性Luer-Lock 頭注射器上。帶有樣品的膜在空氣干燥（23 ℃）后用雙層粘圖層碳標(biāo)簽安裝在鋁樣品蒂上，并在Desk II 噴濺包衣單元用金-鈀包衣90 s。孢子在2 kV 發(fā)射場掃描電子顯微鏡下觀察和拍照，照片在2 560×1 920 dpi 分辨率下拍攝。

1.3.5 脈沖強(qiáng)光技術(shù)的殺菌動力學(xué)模型 紫外和脈沖強(qiáng)光殺菌動力學(xué)選用3 個經(jīng)典數(shù)學(xué)模型：Log-linear 模型、Weibull 模型和Weibull+tail 模型。使用Geeraerd 等[20]發(fā)布的統(tǒng)計學(xué)軟件GInaFIT來計算模型參數(shù)。

1）照射能量 照射能量是在某一照射強(qiáng)度下處理一定時間，物體所受到的脈沖強(qiáng)光照射的能量。照射能量F 與照射強(qiáng)度I 和處理時間t 之間的關(guān)系為：

式中，I——照射強(qiáng)度，W/cm2；t——照射處理時間，s。

2）Log-linear 模型 該模型假設(shè)微生物具有相同的抗逆性，致死動力學(xué)可以用線性模型來描述，微生物下降的對數(shù)值隨時間的變化呈線性變化，即：

式中，N——孢子存活量，CFU/g；N0——初始菌數(shù)，CFU/g；F——照射能量，J/cm2；kmax——失活速率，cm2/J。kmax經(jīng)典單位為1/min，表示的是1 min 能夠降低的lg 數(shù)。在本文中，它代表1 J/cm2能量能夠降低的lg 數(shù)。

3）Weibull 模型 Weibull 方程屬于分布函數(shù)。該模型假設(shè)菌體間的熱逆性有差別且符合Weibull 分布。其數(shù)學(xué)模型為：

式中，N——孢子存活量，CFU/g；N0——初始菌數(shù)，CFU/g；F——照射能量，J/cm2；δ——降低微生物一個對數(shù)所需的照射能量，J/cm2；p——形狀參數(shù)（無量綱），當(dāng)p＞1 時，曲線呈單調(diào)下凹，當(dāng)p＜1 時，曲線呈單調(diào)上凹，當(dāng)p=1 時，曲線為一條直線，此時Weibull 模型變?yōu)椋?/p>

此形式的Weibull 模型與一級動力學(xué)方程一致，δ=1/D，D=ln10/k，一級動力學(xué)方程可看作Weibull 模型的特定形式[21]。

4）Weibull+tail 模型 考慮到實際生產(chǎn)中存在一類抗逆性較強(qiáng)，不易殺死的穩(wěn)定孢子，即使延長殺菌時間也不能降低，因而形成拖尾的特點，采用Albert 和Mafart[22]提出的模型：

式中，N——孢子存活量，CFU/g；N0——初始菌數(shù)，CFU/g；Nres——抗逆穩(wěn)定孢子，CFU/g；F——照射能量，J/cm2；δ——降低微生物一個對數(shù)值所需的照射能量，J/cm2；p——形狀參數(shù)（無量綱）。

5）模型擬合度的驗證評價 采用SPSS 19.0對試驗數(shù)據(jù)分別進(jìn)行Log-linear 模型、Weibull 模型和Weibull+tail 模型的擬合處理，得到脈沖強(qiáng)光殺菌的動力學(xué)方程，以均方根誤差RMSE、決定系數(shù)R2、精確因子Af和偏差因子Bf這4 個參數(shù)來評判擬合度的優(yōu)劣。RMSE、Af和Bf的計算公式如下：

式中，α——預(yù)測值；β——實測值；m——試驗值個數(shù)。

Af反映了預(yù)測值與實際值偏離的程度，Af值越小表明模型的預(yù)測值與實際值越接近，模型越精確。當(dāng)Bf＞1 表示模型的預(yù)測值比實際值高，當(dāng)Bf＜1 表示模型預(yù)測值比實際值低，Bf越接近1，模型擬合度越高。決定系數(shù)R2和RMSE 表示模型的精確度、可靠度，R2越接近于1，RMSE 越小，模型擬合度越高。

2 結(jié)果與分析

2.1 脈沖強(qiáng)光殺菌效果

圖1 脈沖強(qiáng)光在不同時間和強(qiáng)度下對黃曲霉菌孢子的殺菌效果Fig.1 Inactivation effect of Aspergillus flavus spores under different times and intensities of pulsed light treatments

由圖1 可知，脈沖強(qiáng)光能夠快速有效的使黃曲霉菌孢子失活，殺菌效果與處理時間存在顯著性關(guān)系（P＜0.05）。在強(qiáng)度為2.86 W/cm2照射下，處理1 s 即可降低（2.08±0.30）lg（CFU/mL），隨著時間的延長，殺菌效果顯著提高，18 s 后可降低（4.79±0.1）lg（CFU/mL），19 s 后黃曲霉菌孢子被全部殺死。殺菌效果與照射強(qiáng)度間也存在顯著性關(guān)系（P＜0.05）。在照射強(qiáng)度0.93，1.08，1.60，2.86 W/cm2條件下同樣處理1 s 后，殺菌效果分別為（0.64±0.32），（1.04±0.20），（1.33±0.28），（2.08±0.30）lg（CFU/mL）。照射能量是殺菌時間和照射強(qiáng)度共同作用的結(jié)果，因此，采用照射能量作為動力學(xué)研究的變量。

2.2 掃描電鏡分析

圖2 顯示的是脈沖強(qiáng)光處理前、后黃曲霉菌孢子的掃描電鏡照片，通過對處理前、后孢子形態(tài)結(jié)構(gòu)特征的觀察可以看出，未處理的孢子形態(tài)完整，呈球形，表面有突起。脈沖強(qiáng)光處理后的孢子體積變小且不規(guī)則，表面皺縮，并出現(xiàn)孔狀結(jié)構(gòu)。

黃曲霉菌孢子的細(xì)胞壁主要成分是幾丁質(zhì)其次是纖維素等，因此具有支撐和保護(hù)細(xì)胞內(nèi)部的作用。脈沖強(qiáng)光處理使孢子崩潰可能是由于細(xì)胞質(zhì)從細(xì)胞壁的孔狀結(jié)構(gòu)泄露導(dǎo)致。目前已經(jīng)有充分的研究表明，脈沖強(qiáng)光對微生物的致死是光化學(xué)和光熱效應(yīng)共同作用的結(jié)果[23-24]。光化學(xué)效應(yīng)能夠?qū)е掳屑?xì)胞DNA 鏈的斷裂，光熱效應(yīng)主要導(dǎo)致細(xì)胞壁的破壞。在脈沖強(qiáng)光處理過程中，高能照射導(dǎo)致瞬間溫度升高，胞內(nèi)水分快速蒸發(fā)形成微小的蒸汽，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜膨脹破裂，細(xì)胞質(zhì)泄露[25-26]?？梢钥隙ǖ氖?，脈沖強(qiáng)光對黃曲霉菌孢子的殺菌是通過對細(xì)胞壁的破壞，對于是否破壞DNA 有待進(jìn)一步研究。

圖2 黃曲霉菌孢子的掃描電鏡顯微照片（照射能量：5.2 J/cm2）Fig.2 SEM picture of Aspergillus flavus spores（fluence：5.2 J/cm2）

2.3 脈沖強(qiáng)光殺菌動力學(xué)

1）模型的選擇和參數(shù)的確定 將結(jié)果中的照射能量與殺菌效果通過SPSS 回歸擬合，分別得到了線性模型、Weibull 模型和Weibull+tail 模型的參數(shù)（表1），通過對比R2可以直觀看出線性模型擬合度較差。通過比較Weibull 和Weibull+tail兩個模型的RMSE 和R2發(fā)現(xiàn)在5，9 cm 和17 cm數(shù)據(jù)中Weibull+tail 模型擬合度較高，而在13 cm這組數(shù)據(jù)中Weibull 模型擬合度較高；通過比較Af和Bf反映出在9 cm 這組數(shù)據(jù)中Weibull+tail模型擬合度較高，而在5，13 cm 和17 cm 數(shù)據(jù)中Weibull 模型擬合度較高，在兩個模型都比較接近實際值時難以直接判斷哪個模型擬合度更高。因此，為了進(jìn)一步評判這3 個模型的精確度，將預(yù)測值與實際值進(jìn)行相關(guān)性分析，比較相關(guān)系數(shù)的大小。

表1 脈沖強(qiáng)光處理瓊脂表面黃曲霉菌孢子失活的3 個模型的動力學(xué)參數(shù)Table 1 Kinetics parameters of three models for inactivation by pulsed light of A.flavus spores on agar surface

3 個模型進(jìn)行預(yù)測值與實際相關(guān)性分析結(jié)果顯示，線性模型、Weibull 模型和Weibull+tail 模型的相關(guān)系數(shù)分別為R2=0.7893、R2=9537 和R2=0.9727，P＜0.0001，試驗個數(shù)n=74?？梢钥闯觯琖eibull+tail 模型的相關(guān)性更高（圖3）。

因此確定Weibull+tail 模型為脈沖強(qiáng)光殺滅黃曲霉菌孢子的模型。將擬合得到的參數(shù)帶入Weibull+tail 模型可以得到黃曲霉菌孢子存活量與照射能量之間的關(guān)系式，當(dāng)樣品與石英窗距離為5 cm 時：

距離為9 cm 的關(guān)系式為：

距離為13 cm 的關(guān)系式為：

距離為17 cm 的關(guān)系式為：

2）脈沖強(qiáng)光殺菌曲線的特征分析 圖4 顯示的是不同強(qiáng)度下黃曲霉菌孢子Weibull+tail 模型的致死擬合曲線，可以看出曲線的特點為：曲線初始沒有肩型，中段呈上凹形態(tài)，雖有拖尾但較短。沒有肩型的特點是有利于滅菌的，因為菌株數(shù)量減少速度較快。一般沒有肩型有兩種可能，一種是確實沒有肩型，另一種是有肩型而選擇的照射能量值不密集從而沒有顯示[16]。本試驗整個處理過程中，試驗點的選擇比較平均且密集，因此排除了埋沒初始階段肩型的可能。且初始較低的照射能量為0.92～2.08 J/cm2，對比其它研究顯示出肩的照射能量如Bialka 等[27]為5.4 J/cm2，可以認(rèn)為，本試驗中的孢子致死擬合曲線確實沒有肩。

δ 是決定降低1 個lg（CFU/mL）微生物所需的照射能量，5，9，13，17 cm 的δ 值分別為0.36，0.68，1.73，3.40 J/cm2，即隨著距離的增加，降低1 lg（CFU/mL）黃曲霉菌孢子所需的照射能量逐漸增加，說明距離越近照射能量利用率越高。lgNres表示無法被殺死的微生物的數(shù)量，在本試驗中由于采用的是光滑瓊脂表面，所以當(dāng)采用脈沖強(qiáng)光進(jìn)行表面殺菌時孢子幾乎完全失活，4 組lgNres值均接近于0。然而，如果載體為液體，如水、果汁、牛奶、食用油等lgNres會增加，這取決于脈沖強(qiáng)光的穿透力以及液體的濁度。而如果載體為表現(xiàn)相對粗糙的固體食品，如糧食、蔬菜、水果等，lgNres會更高，因為藏匿于縫隙或孔洞中的微生物不易被這種表面殺菌技術(shù)所殺滅。

圖3 脈沖強(qiáng)光殺滅黃曲霉菌孢子效果的3 個模型預(yù)測值和實際值的相關(guān)性Fig.3 Correlation between calculated and tested values of survival ratios for inactivation by pulsed light of A.flavus spores on agar surface

圖4 在不同距離條件下黃曲霉菌孢子Weibull+tail模型的致死擬合曲線Fig.4 Survival curves of A.flavus spores at different distances fitted with Weibull+tail model

3 結(jié)論

脈沖強(qiáng)光對固體培養(yǎng)基上黃曲霉菌孢子殺滅效果明顯。殺菌效果與處理時間和脈沖強(qiáng)光的強(qiáng)度存在顯著性關(guān)系（P＜0.05），隨著時間的延長和強(qiáng)度的增大，脈沖強(qiáng)光對黃曲霉菌孢子的殺菌效果顯著提高。在強(qiáng)度2.86 W/cm2條件下處理1 s可使孢子降低（2.08±0.30）lg（CFU/mL），18 s 后可降低（4.79±0.1）lg（CFU/mL），19 s 后可全部殺死。在照射強(qiáng)度0.93，1.08，1.60，2.86 W/cm2條件下同樣處理1 s 后，殺菌效果分別為（0.64±0.32），（1.04±0.20），（1.33±0.28），（2.08±0.30）lg（CFU/mL）。

根據(jù)掃描電鏡分析，脈沖強(qiáng)光能夠利用其高能的光熱作用破壞孢子細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致黃曲霉菌孢子菌體胞漿物質(zhì)外滲，阻礙其代謝而致死。

通過對殺菌效果和照射能量之間關(guān)系的研究，得到脈沖強(qiáng)光殺菌動力學(xué)特征與Weibull+tail模型和Weibull 模型擬合度高（決定系數(shù)R2＞0.95），經(jīng)過進(jìn)一步模型擬合度評價得出Weibull+tail 模型的相關(guān)性更高（R2=0.9727），并根據(jù)動力學(xué)參數(shù)得出黃曲霉菌孢子存活量與照射能量之間的關(guān)系式。形狀參數(shù)δ 隨著強(qiáng)度的減小而增加，說明距離越近照射能量利用率越高。