定志散對抽動癥小鼠多巴胺和刻板行為的影響

單麒元，劉 琳，孫 竺，徐靜東

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，哈爾濱 150076)

抽動-穢語綜合征(Tourette’s syndrome , TS)是一種兒童期發(fā)病可延續(xù)至青春期，通常伴有運動和行為異常的慢性神經(jīng)精神障礙性疾病[1].目前國內(nèi)治療TS的藥物最普遍的是多巴胺(Dopamine, DA)受體阻斷劑，例如硫必利等.但是長期使用無論是治療效果還是副作用均顯示出其局限性.

中醫(yī)認(rèn)為TS的發(fā)病機制是患兒神傷氣亂，心氣虧虛[2].安神定志丸是《和劑局方》中一種臨床常用的養(yǎng)心安神方劑.本實驗的定志散源于《和劑局方》的安神定志丸，定志散選用人參、茯苓、遠(yuǎn)志、石菖蒲四味中藥.人參配伍茯苓，益氣養(yǎng)心；石菖蒲配伍遠(yuǎn)志，定志開竅；遠(yuǎn)志配伍茯苓，交通心腎.諸藥合用益心氣，開心竅，安心神.

TS患者臨床主要表現(xiàn)為不自主眨眼、面部肌肉抽動做怪相、縮鼻、聳肩、搖頭及穢語等[3].本實驗在造模后進行籠邊觀察，研究定志散對TS小鼠刻板行為的影響.單胺類神經(jīng)元軸突可以影響大腦中每一個腦區(qū)，其中含DA量占比最多，許多研究認(rèn)為TS的發(fā)病機制和DA有關(guān)[4-5]，所以本實驗檢測造模21 d小鼠腦勻漿中含DA量并與刻板行為相印證，來研究定志散對TS模型鼠的防治效果.

1 實驗材料

1.1 實驗動物

清潔級ICR小鼠48只，雌雄各半，6～8周齡，體重(20±2)g.由長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，批號：201900027072.

1.2 實驗藥品

亞氨基二丙腈(梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號：AV54D-EQ);鹽酸硫必利片(天津中新藥業(yè)集團股份有限公司，批號：36180304);定志散(由哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院提供).

1.3 實驗儀器

ZZ-6小鼠自主活動測試儀(型號：ZZ-6 廠家：成都泰盟科技有限公司);電子分析天平(型號：FA-1004B 廠家：上海躍平科學(xué)儀器有限公司);高效液相色譜儀(型號：e2695 廠家：Waters);醫(yī)用低溫箱(型號：MDF-193 廠家：Panasonic)

2 實驗方法

2.1 制備定志散混懸液

處方：人參15 g、茯苓15 g、遠(yuǎn)志10 g、石菖蒲10 g.分別配制高劑量組定志散懸濁液(0.3 g/mL)、中劑量組(0.15 g/mL)、低劑量組(0.075 g/mL)，放入4 ℃冰箱待用.

2.2 實驗動物分組及復(fù)制抽動-穢語綜合征模型

取小鼠48只，按0 d自主行為成績隨機分為空白組(n=8)、模型組(n=8)、陽性藥組(n=8)、高劑量組(n=8)、中劑量組(n=8)、低劑量組(n=8).將亞氨基二丙腈(3,3'-Iminodipropanenitrile, IDPN)用生理鹽水稀釋成質(zhì)量濃度為30 mg/mL的溶液，按0.3 g/kg劑量通過腹腔注射給藥；空白組給予腹腔注射等量的生理鹽水，每天1次持續(xù)注射21d.

2.3 實驗動物給藥

每日取出定志散懸濁液，低、中、高劑量組分別按1.2、2.4、4.8 g/kg灌胃.陽性藥組按10g/kg給予硫必利片混濁液.空白組、模型組給予等量的蒸餾水灌胃，持續(xù)灌胃21d.

2.4 刻板行為指標(biāo)檢測

2.4.1 點頭次數(shù)測定

將小鼠分別置于29 cm×18 cm×15 cm的觀察籠中，先適應(yīng)環(huán)境1 min后人為記錄其1 min內(nèi)點頭次數(shù)，測試完畢后清潔籠內(nèi)排泄物，以消除對下一組小鼠的影響.造模后每7天檢測1次，一共3次.

2.4.2 分類刻板行為評估

將小鼠分別置于29 cm×18 cm×15 cm的觀察籠中，先適應(yīng)環(huán)境1 min后人為記錄其1 min內(nèi)旋轉(zhuǎn)、自咬、擺頭、捋毛、舞蹈樣運動、嚙咬出現(xiàn)次數(shù)，測試完畢后清潔籠內(nèi)排泄物，以消除對下一組小鼠的影響.造模后第21d測試.

2.5 腦中含多巴胺量測定

2.5.1 組織樣本制備

將小鼠麻醉后，立即斷頭處死，分開顱骨，在冰盤上快速取腦，去除腦干及小腦，置0～4℃生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，腦組織右側(cè)半球，置于液氮中保存.后將待測腦組織從液氮中取出，精密稱重，迅速放入預(yù)冷的玻璃勻漿器中，加入重量體積比(1∶1)的冰冷生理鹽水，0～4 ℃條件下快速勻漿.組織被均勻粉碎后在恒溫下進行離心(2 000 r/min，10 min，4 ℃)，取上清液待測.

2.5.2 檢測條件

1)色譜分析條件

色譜柱采用Agilent C18反相色譜柱(4.6×150 mm, 5 μm)，流動相為水相(每1L 中含辛烷磺酸鈉2.5 g，磷酸二氫鈉12 g，乙二胺四乙酸36 mg，氯化鈉1.17 g，pH=3.3)∶甲醇∶乙腈=78∶19∶3，使用前經(jīng)0.22 μm微孔濾膜負(fù)壓濾過，并超聲脫氣15 min.流速為1mL/min，柱溫35 ℃；電化學(xué)檢測器工作電極為玻璃碳電極，參比電極為銀/氯化銀(Ag/AgCl)電極，工作電壓為0.8 V，靈敏度：50 nA.

2)小鼠腦勻漿樣品預(yù)處理

取小鼠腦勻漿液50 μL，加入200 μL乙腈，渦旋混勻沉淀蛋白，再將混勻后的液體離心10 min(12 000 r·min-1)，吸取上清液氮氣吹干，加50 μL流動相，渦旋5 min，離心10 min(12 000 r·min-1)取上清液，進樣20 μL，進行HPLC分析.

2.5.3 高效液相電化學(xué)分析方法學(xué)驗證

1)專屬性考察

精密吸取多巴胺對照品，20 μL進樣，記錄色譜圖.

2)線性關(guān)系考察

精密稱取 DA 5 mg，用蒸餾水溶解定容5毫升容量瓶中,DA質(zhì)量濃度：1 mg·mL-1，再從中取10 μL，得質(zhì)量濃度為1 μg/mL，從中精密吸取6.0 mL，置10 mL量瓶中，后逐步稀釋，得質(zhì)量濃度分別為20、40、80、150、300、600 ng·m L-1標(biāo)準(zhǔn)稀釋液.計算峰高(Y)與質(zhì)量濃度(X)的線性回歸方程.

3)精密度考察

分別配制低(100 ng·mL-1)、中(300 ng·mL-1)、高(500 ng·mL-1)3種不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，分裝后貯存于-80 ℃冰箱內(nèi).日內(nèi)連續(xù)測3次，計算日內(nèi)精密度；每份樣本每日測1次，連續(xù)測定3日，計算日間精密度.

4)回收率考察

相對回收率：混合對照品稀釋液100、300、500 ng·mL-1分別連續(xù)進樣3次，以實測的質(zhì)量濃度(由標(biāo)準(zhǔn)曲線求出各樣品的質(zhì)量濃度)與混合對照標(biāo)準(zhǔn)品溶液質(zhì)量濃度之比來計算相對回收率.

5)穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液，分別于24 h、30 d進樣20 μL，計算各組分峰面積積分值(RSD值).

2.6 統(tǒng)計學(xué)處理方法

3 實驗結(jié)果

3.1 刻板行為指標(biāo)檢測

3.1.1 點頭刻板行為檢測

小鼠點頭刻板行為次數(shù)顯示，與空白組相比，模型組14 d的點頭刻板行為次數(shù)顯著增加(P<0.05)，模型組21 d點頭刻板行為次數(shù)非常顯著增加(P<0.01).與模型組相比，14 d陽性藥組點頭次數(shù)顯著降低(P<0.05)，21 d低劑量組和陽性藥組點頭次數(shù)顯著降低(P<0.05)、高劑量組點頭次數(shù)非常顯著降低(P<0.01).見表1.

表1 小鼠點頭刻板行為次數(shù)次)

注：與空白組比較，*P<0.05有顯著性差異，**P<0.01有非常顯著性差異；與模型組比較，△P<0.05有顯著性差異，△△P<0.01有非常顯著性差異

3.1.2 分類刻板行為檢測

與空白組相比，模型組的舞蹈樣次數(shù)顯著增加(P<0.05),旋轉(zhuǎn)、自咬、擺頭次數(shù)非常顯著增加(P<0.01).與模型組相比，陽性藥組的舞蹈樣次數(shù)顯著增加(P<0.05),自咬和擺頭次數(shù)非常顯著增加(P<0.01)；低劑量組的擺頭和舞蹈樣次數(shù)顯著增加(P<0.05)自咬次數(shù)非常顯著增加(P<0.01)；中劑量組擺頭次數(shù)顯著增加(P<0.05)；高劑量組舞蹈樣次數(shù)顯著增加(P<0.05)自咬和擺頭次數(shù)非常顯著增加(P<0.01).見表2

表2 小鼠分類刻板行為檢測次)

注：與空白組比較，*P<0.05有顯著性差異，**P<0.01有非常顯著性差異；與模型組比較，△P<0.05有顯著性差異，△△P<0.01有非常顯著性差異

3.2 高效液相-電化學(xué)法測小鼠腦勻漿中含多巴胺量結(jié)果

3.2.1 方法學(xué)驗證

3.2.2 小鼠腦勻漿中含多巴胺量測定結(jié)果

與空白組比較，模型組小鼠腦中含DA量顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，高劑量組和陽性藥組的小鼠腦中含DA量顯著升高(P<0.05).見表3.

表3 小鼠腦中含DA量

注：與空白組比較，*P<0.05有顯著性差異；與模型組比較，△P<0.05有顯著性差異

4 討 論

現(xiàn)今臨床使用的治療TS藥物療程長、靶向性不強、患兒長期使用常出現(xiàn)嗜睡、胃腸道反應(yīng)，故臨床依從性差[7-8].中醫(yī)認(rèn)為TS的發(fā)病機制是小兒為稚陰稚陽之體，形氣未充，神氣怯弱，易為外界刺激而干擾臟腑正常生理功能.暴受驚嚇而致神傷氣亂，使心無所依，神無所歸；思慮過度而使心脾損傷，心氣虧虛，運化不利；小兒所愿不遂，嬌寵縱若，稍有不順，則易惱怒，致肝氣郁結(jié)，疏泄失職，郁久化火，熱極生風(fēng)，致肝風(fēng)內(nèi)動，風(fēng)陽上擾清竅，出現(xiàn)肢體和頭面部肌肉抽搐，或擰眉眨眼，或努嘴聳肩[9].定志散來源于宋代《和劑局方》中臨床常用的一種安心養(yǎng)傷方劑定志丸.人參配伍茯苓，益氣養(yǎng)心；石菖蒲配伍遠(yuǎn)志，定志開竅；遠(yuǎn)志配伍茯苓，交通心腎.諸藥合用益心氣，開心竅，安心神.所以在本實驗中，選用定志散來研究其對TS的治療效果.

TS是一種慢性、多發(fā)性、波動性伴有肌肉抽搐，伴或不伴有不自主發(fā)聲的精神性障礙疾病.動物復(fù)制TS模型時，刻板行為的變化是最明顯的表現(xiàn).有文獻記載當(dāng)TS鼠運動極度活躍、其刻板行為包括持續(xù)互相捋毛、挖掘、撕咬、跳躍并伴有步伐缺陷[10-11].在前期預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)，用IDPN誘導(dǎo)的TS模型鼠的點頭刻板行為最為典型且和臨床TS患者癥狀相似，所以本實驗每隔7天檢測一次點頭刻板行為，研究定志散對TS模型鼠刻板行為的影響效果.實驗中各組模型鼠在15 d后逐漸出現(xiàn)的行為學(xué)的改變且逐漸增多，造模第21 d模型鼠刻板行為最為明顯且安全性較好，所以本實驗在21d進行分類刻板行為評估，然后處死小鼠測其腦勻漿中含DA量.

DA系統(tǒng)包括：黑質(zhì)-紋狀體，中腦邊緣，中腦皮質(zhì)，漏斗結(jié)節(jié)四個部分.現(xiàn)今許多學(xué)者以皮質(zhì)-紋狀體-丘腦-皮質(zhì)回路中DA神經(jīng)遞質(zhì)失衡作為TS發(fā)病機制的主流研究方向[12].有學(xué)者認(rèn)為TS的發(fā)病機制或是DA的低毒性堆積引起[5]，或是多巴胺轉(zhuǎn)運體的超敏感[13-14]，或是多巴胺D1受體的超敏感[7]，或是多巴胺D2受體的抑制[3]等猜測.所以本實驗在21d各組TS模型鼠刻板行為最明顯的時候集體處死，用高效液相-電化學(xué)法測腦勻漿中含DA量.

刻板行為檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)21d低、中、高劑量定志散組均能減少改善TS模型鼠的刻板行為，其中低劑量和高劑量顯著減少(P<0.05).含DA量測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，TS模型組鼠的腦中含DA量顯著減少(P<0.05).持續(xù)灌胃21d定志散后，TS模型鼠腦中含DA量都有回升的趨勢且低、中、高劑量三組鼠的腦中含DA量有遞增趨勢，其中高劑量定志散組的腦中含DA量顯著增加(P<0.05).所以能初步得出結(jié)論:定志散對TS進行有效的防治作用且穩(wěn)定.

另外，在刻板行為檢測實驗中發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，只有定志散低劑量組和高劑量組的刻板行為有顯著減少(P<0.05),但是中劑量組沒有顯著性差異.而在含DA量測定實驗中，只有定志散高劑量組顯著提高腦中含DA量.本實驗定志散的君藥是人參，有研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷可以提高神經(jīng)興奮性傳遞的同時，也可拮抗興奮性神經(jīng)的毒素起到保護作用[15].猜測可能與人參皂苷對興奮神經(jīng)的雙向調(diào)節(jié)有關(guān)，這也和TS的發(fā)病機制是DA神經(jīng)的低毒性堆積引起的假說[5]相符合.提示后期可以改變處方中人參的處方量，研究人參皂苷對興奮性神經(jīng)的雙向調(diào)節(jié)對TS治療效果的影響，尋求一個最佳的人參給藥處方量.