AISPPs對木瓜蛋白酶的抗凍保護作用研究

田 野，李亞楠，吳 征，陳 強，曲 敏

(哈爾濱商業(yè)大學 食品工程學院 黑龍江省普通高校食品科學與工程重點實驗室，哈爾濱 150076)

冰結構蛋白(ice structuring proteins, ISPs)，又稱不凍蛋白、抗凍蛋白，是一類由某些魚類、昆蟲、植物、真菌和細菌為抵御外界環(huán)境應激反應所產生的多肽，能夠有效地抑制冰晶生長的蛋白[1].它具有一定的熱滯活性，即能夠以非依數性方式降低溶液的冰點，但對熔點影響甚微，使溶液冰點和熔點之間出現差值[2].其中，植物源ISPs與動物源ISPs相比具有來源廣泛、價格低廉等特點，自1992年以來成為研究的熱點[3-4].

木瓜蛋白酶又稱木瓜酶，是一類含巰基肽鏈的內切酶，廣泛存在于番木瓜(Cariea papaya)的根、莖、葉和果實內，其中在未成熟的乳汁中含量最為豐富[5].它具有酶活高、熱穩(wěn)定性好、天然衛(wèi)生安全等特點，因此在食品[6]、醫(yī)藥[7]、飼料、日化、皮革及紡織等行業(yè)得到廣泛應用[8].木瓜蛋白酶最適溫度為55～60 ℃，在低溫條件下，酶和底物的結合速率減慢，且木瓜蛋白酶中的肽鏈收縮，不易與底物嵌合，酶活降低.

本課題組利用冰與冰結構蛋白特異性結合法提取AISPs[9]，并將其應用于冷凍面團[10]、速凍餃子皮[9]等方面，發(fā)現AISPs對其具有明顯的保護作用.但木瓜冰結構蛋白酶肽(Allium ice structural proteins peptide,AISPPs)的抗凍保護作用未見報道，故本試驗將AISPPs加入木瓜蛋白酶中，探究其對木瓜蛋白酶的抗凍保護作用，以酶活性作為主要的功能性評價指標，并對其凍干保護機理進行初步探討，以期拓寬AISPPs的應用.

1 材料與儀器

1.1 實驗材料

“肇東”紫花苜蓿，由黑龍江省農業(yè)科學院草業(yè)研究所苜蓿實驗基地提供.Na2HPO4，NaH2PO4，乙醇，硫酸銨，丙酮，EDTA-2Na，氫氧化鈉，考馬斯亮藍G-250，鄰苯三酚，SOD，所有試劑均為分析純.標準蛋白酶液，生化試劑.

1.2 實驗儀器

電子天平，沈陽龍騰電子秤量儀器公司；TGL-16型高速臺式離心機，上海醫(yī)療器械六廠；721型紫外可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；DHP-9162型光照培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；GW-06A電熱恒溫干燥箱，哈爾濱儀器五廠；ESJ 180-4型分析天平，沈陽龍騰電子秤量儀器公司；粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；BCD-247-C型電熱恒溫水浴鍋，聚創(chuàng)環(huán)保設備有限公司.

1.3 冰結構蛋白的制備

參照曲敏[9]的方法，取苜蓿草粉以1∶20的料液比在磷酸緩沖溶液，磁力攪拌器攪拌、浸泡2 h，8層紗布及濾紙過濾，棄去草渣，上清液于5 000 r/min離心15 min，得可溶性蛋白的粗提液，采用考馬斯亮藍法測定粗提液中蛋白含量，計算質量,記為m1.

將蒸餾水注入圓球形冰槽，在-18 ℃冰箱冷凍，制成直徑為1 cm的冰球，備用.在上清液中加入冰球，于-18 ℃靜置，以冰球吸附上清液中的AISPs.2 min后，分離出冰球并待自然融化，測量溶液中蛋白含量，計算質量為m2.最后將融化后的液體裝入旋轉蒸發(fā)儀進行旋轉蒸發(fā)濃縮，得到的濃縮液即為AISPs溶液.

1.4 標準曲線的測定

參照葉婧[11]的方法，采用考馬斯亮藍染料比色法，分別取0、10、20、30、40、50、60 mg/L牛血清蛋白標準品各1 mL，加入考馬斯亮藍G250溶液5 mL，充分混勻，靜置5 min，于595 nm波長處測定吸光值.以牛血清蛋白質量濃度為橫坐標，以A595nm為縱坐標，繪制標準曲線.

1.5 酪氨酸標準曲線的測定

本試驗采用福林酚試劑法[12]測定酪氨酸標準曲線.分別取1 mL質量濃度為10、20、30、40、50、60 μg/mL的酪氨酸溶液，加入0.5 mL 福林試劑、5 mL 0.4 mol/L Na2CO3均勻混合，于40 ℃水浴鍋中放置1 min，于680 nm下測定其吸光度，以空白組為對照，以酪氨酸質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線.

1.6 AISPPs的制備

用堿性蛋白酶對AISPs進行酶解制備AISPPs，以蛋白水解度(DH)作為考察指標，考察酶解時間、底物質量濃度、酶質量分數、溶液pH、酶解溫度其酶解程度的影響.

1.6.1 酶解時間

酶解溫度55 ℃，反應體系的pH為8.0，堿性蛋白酶質量分數為5%條件下分別酶解1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h，比較不同酶解時間對AISPs的水解程度.

1.6.2酶質量分數的影響

酶解溫度55 ℃，反應體系的pH為8.0條件下，分別加入質量分數2%、3%、4%、5%、6%、7%的堿性蛋白酶，酶解2.5 h，比較不同酶質量分數對AISPs的水解程度.

1.6.3 酶解pH的影響

酶解溫度55℃，堿性蛋白酶質量分數為5%條件下，分別調節(jié)反應體系的pH為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，酶解2.5 h，比較不同酶解pH對AISPs的水解程度.

1.6.4酶解溫度的影響

反應體系的pH為8.0，堿性蛋白酶質量分數為5%條件下分別于45、50、55、60、65 ℃條件下進行反應，酶解2.5 h，比較不同酶解溫度對AISPs的水解程度.

1.6.5 蛋白水解度的測定

本試驗采用甲醛滴定法測量蛋白質水解度，取2 mL待測蛋白溶液，分別加入4 mL蒸餾水及酚酞溶液3滴，搖勻后用0.095 35 mol/L氫氧化鈉溶液滴至成微紅色，然后加入4 mL中性甲醛溶液，搖勻后靜置片刻.再用0.095 35 mol/L NaOH溶液滴至成為紅色，記下加入甲醛后所消耗的標準氫氧化鈉體積.以蒸餾水為對照，水解度按下式計算：

DH%=B(Mb)(1/α)(1/MP)(1/htot)×100%

(2)

其中：B為NaOH的體積，mL；Mb為NaOH的濃度，mol/L；1 /α為在pH 7.0，50 ℃的試驗條件下，1 /α為2.26；MP為蛋白質的品質，g；htot為每克原料蛋白質中肽鍵的毫摩爾數，對AISPs蛋白該值取7.40 mmol/g.

1.7 響應面實驗

根據單因素實驗結果，采用響應面法對堿性蛋白酶對AISPs的水解條件進行優(yōu)化，選取酶解時間(A)、酶解pH(B)和酶解溫度(C)為考察因素，以DH為考察指標，進行響應面試驗.見表1.

表1 響應面分析試驗設計因素與水平

采用BBD試驗設計方法設立17組試驗，各因素和響應面值(DH)如表2所示，對數據進行二次回歸擬合，分析各因素的效應，最后得到堿性蛋白酶對AISPs的水解條件最佳工藝.

1.8 AISPPs對木瓜蛋白酶的保護作用

1.8.1 不同凍藏時間的比較

取兩組木瓜蛋白酶各10 mL，一組加入0.3%的AISPPs，一組為空白對照，于-30 ℃凍藏5、10、15、20、25 d后木瓜蛋白酶活力，比較不同凍藏時間下加入AISPPs對木瓜蛋白酶的保護作用.

1.8.2 不同質量分數AISPPs對木瓜蛋白酶酶活力的影響

取5組木瓜蛋白酶各10 mL，分別加入質量分數為0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%的AISPPs，于-30 ℃凍藏5 d，測定木瓜蛋白酶活力，比較不同AISPPs對木瓜蛋白酶活力的影響.

表2 堿性蛋白酶對AISPs的水解條件響應曲面試驗設計和結果

2 實驗結果與分析

2.1 牛血清蛋白標準曲線及AISPs提取率

由圖1可知，蛋白溶液的吸光度與質量濃度存在正比例關系，線性關系良好，可用于后續(xù)實驗.根據標準曲線，通過計算得出AISPs提取率約為37.77%.

圖1 牛血清蛋白標準曲線

2.2 酪氨酸標準曲線

由圖2可知，酪氨酸標準曲線為y=0.195 1x-0.151 3，線性關系良好，可用于其他待測蛋白質量濃度的測定.根據標準曲線，根據計算堿性蛋白酶的酶活性為9×104U/mg.

圖2 酪氨酸標準曲線

2.3 酶解單因素實驗

2.3.1 酶解時間

由圖3可知，水解度隨著酶解時間的增加，呈現先增大后減小的趨勢；當酶解時間為2.5 h時，水解度達到最大值為15.3%，蛋白酶基本和蛋白質完全作用，繼續(xù)水解底物質量濃度會繼續(xù)減小，隨著水解的進行酶的特異性催化位點減少，即水解過程中酶逐漸失活，故最佳酶解時間為2.5 h.

2.3.2 酶解質量分數

由圖4可知，水解度隨著酶解質量分數的逐漸升高，呈現先增大后減小的趨勢.當酶質量分數為1%～ 4%時，酶質量分數的逐漸增加使反應物逐漸達到反應完全，AISPs水解度逐漸增加.當酶解質量分數達到4%時，水解度達到最大值為14.6%.此后再增加酶質量分數，增加了溶液體積，AISPPs被稀釋，水解度降低.

圖3 酶解時間對水解度的影響

圖4 酶質量分數對水解度的影響

2.3.3 酶解pH

圖5可知，水解度隨著酶解pH的逐漸升高，呈現先增大后減小的趨勢.這是由于隨著pH的不斷增大，AISPs所帶的電荷不斷增多，蛋白與水之間的相互作用不斷增大，蛋白與蛋白之間的相互作用不斷減小.當酶解pH達到4時，水解度達到最大值為16.2%.

圖5 酶解pH對水解度的影響

2.3.4 酶解溫度

由圖6可知，水解度隨著酶解溫度的逐漸升高，呈現先增大，后減小的趨勢.當在45～55 ℃時，溫度升高可以提高酶的活性，且有利于底物折疊結構的展開，水解度隨著溫度的增加而增加.當酶解溫度達到55 ℃時，水解度達到最大值為16.3%，故最佳酶解溫度為55℃.當在55～70 ℃時，此時溫度超過了酶的最適宜溫度時，酶逐漸失活，導致蛋白質水解度下降.

圖6 酶解溫度對水解度的影響

2.4 堿性蛋白酶對AISPs的水解條件優(yōu)化

2.4.1 回歸方程的建立與方差分析

利用軟件對試驗結果進行回歸分析，擬合得到水解度的二次元回歸方程為：

DH%=16.5+1.61A+0.43B+0.22C+0.16AB+0.34AC+0.14BC-1.05A2-0.25B2-0.98C2

(3)

由表3可知，失擬項不顯著，表明模型的擬合程度良好，未知因素對試驗結果的干擾較少，模型的方差分析說明該模型已經達到顯著水平(P<0.05).由P值可知各因素對堿性蛋白酶對AISPs的水解條件影響為：酶解時間>酶解pH>酶解溫度.校正系數R2Adj為0.95、變異系數(C.V.)為2.9%<10%、決定系數R2為0.43，說明多項式模型的利用性和精密度是可行的，通過此模型方程能預測出堿性蛋白酶對AISPs在任何變量值下的水解條件.

表3 堿性蛋白酶對AISPs的水解條回歸模型

2.4.2 響應面分析及驗證

圖7～9是因素(酶解時間、酶解pH、酶解溫度)交互影響的響應面圖和等高線圖.由圖7可知，隨著酶解時間的增大，堿性蛋白酶對AISPs的水解度呈現先有所增加后緩慢降低的趨勢.酶解pH為 4～6時，提取率呈現先增大后減小的趨勢；等值線區(qū)域水平，表示酶解時間與酶解pH間具有顯著的交互作用.由圖8可知，隨著酶解pH的不斷增加，水解度呈現先增大后趨于平穩(wěn)的趨勢；隨著酶解溫度的逐漸增大，水解度呈現先增大后減小的趨勢.由圖9可知，隨著酶解溫度的不斷增高，水解率呈現先增大后減小的趨勢.

通過二次多項式回歸分析求最大值，得到堿性蛋白酶對AISPs的水解條件最佳工藝為：酶解時間為2.817 h，酶解pH為5.221，酶解溫度為50.593 ℃，在此條件下DH的理論預測值為16.04%.結合最優(yōu)工藝參數和實際生產可操作性，對各因素進行修訂，最終確定最有工藝為：酶解時間為2.8 h，酶解pH為5.2，酶解溫度為50.6.在最佳工藝條件下，經過3次重復試驗驗證，DH為15.89%，與預測值相近，說明優(yōu)化工藝重復性良好，最優(yōu)工藝的結果可靠.

圖7 酶解時間和酶解pH對水解條件的交互影響

圖8 酶解時間和酶解溫度對水解條件的交互影響

圖9 酶解pH和酶解溫度對水解條件的交互影響

2.5 AISPPs對木瓜蛋白酶的抗凍保護作用

由圖10可知，隨著冷凍天數的逐漸延長，木瓜蛋白酶的酶活力逐漸降低，但加入AISPPs可明顯緩解低溫對其的損害.當冷凍時間為25 d時，對照組木瓜蛋白酶酶活性為2.8×105U/mg；而實驗組木瓜蛋白酶酶活性為4.1×105U/mg，相比對照組酶活性提高了46.43%.因此，添加AISPPs對木瓜蛋白酶活力具有一定的保護作用.隨著冷凍時間的延長，一方面，木瓜蛋白酶溶液中水分開始結晶,蛋白酶分子側鏈在冰晶的擠壓下發(fā)生聚集，其周圍的游離水分子因重排布而失去復水力，逐漸導致木瓜蛋白酶變性;另一方面，未凍結時，部分木瓜蛋白酶分子以高度水化的折疊狀存在，非極性基團相互作用形成非極性鍵，因為位于酶分子內部而避開與水分子的接觸，所以狀態(tài)比較穩(wěn)定；但溫度降低時，冰晶的形成使木瓜蛋白酶水化程度降低，致使蛋白酶分子展開變性[13].而AISPPs能吸附于冰晶表面，介于木瓜蛋白酶分子和水分子之間，阻止水與冰的接觸，從而抑制冰晶生長，改變冰晶形態(tài)，抑制冰晶重結晶[14]，從而減緩了冰晶對木瓜蛋白酶的傷害.

圖10 冷凍時間對木瓜蛋白酶活力的影響

2.6 AISPPs添加量的確定

由圖11可知，隨著添加AISPPs質量分數的增加，木瓜蛋白酶的酶活力呈現先增高后減小的趨勢.當AISPPs質量分數為0.5%時，木瓜蛋白酶活力達到最高值6.3×105U/mg.Carpenter J F等[15]發(fā)現ISPs相對質量分數較低時可顯著提高紅細胞的存活率；而較高質量分數將致使紅細胞的存活率降低.其原因是ISPs具有雙重效應，當質量分數較低時，具有抑制大的冰晶形成的作用，表現出對細胞膜的保護；而當質量分數較高時，ISPs進入磷脂雙分子層，破壞其結構引起滲漏，影響了其與冰晶親和作用強度，促進了大冰晶的形成，成為細胞膜毒害劑[3].說明適宜的質量分數決定了其抗凍保護作用，而AISPPs的最適添加量為0.5%.

圖11 冰結構蛋白質量分數對木瓜蛋白酶活力的影響

3 結 語

本文利用冰結合磷酸緩沖液提取法提取AISPs，并用堿性蛋白酶對其進行酶解.通過單因素及響應面法對AISPs的水解條件優(yōu)化，優(yōu)化結果為酶解時間為2.8 h，酶解pH為5.2，酶解溫度為50.6 ℃.在最佳工藝條件下，經過3次重復試驗驗證，AISPs的DH%為15.89%，水解后得到苜蓿冰結構蛋白肽，探究AISPPs對木瓜蛋白酶活力的影響.于-30 ℃凍藏5 d條件下，發(fā)現加入AISPPs可提高木瓜蛋白酶活力；當冷凍時間為25 d時，對照組木瓜蛋白酶酶活性為2.8×105U/mg，實驗組木瓜蛋白酶酶活性為4.1×105U/mg，相比對照組酶活性提高了46.43%.比較質量分數為0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%的AISPPs對木瓜蛋白酶活力的影響，發(fā)現AISPPs為0.5%時，木瓜蛋白酶活力達到最高值6.3×105U/mg.