肺炎克雷伯菌Hfq蛋白特性及對耐藥的影響

周宜慶，阮永春，周潔，張海旺，蘇美霞，曾敏，王丹，茅國峰，李明暉

1. 紹興市人民醫(yī)院感染性疾病科，紹興 312000； 2. 紹興市人民醫(yī)院臨床檢驗中心，紹興 312000

Hfq(host factor for RNA phage Qβ replicase)蛋白首先在大腸埃希菌中被發(fā)現(xiàn)，普遍存在于細菌中，是一個伴侶蛋白，屬于Sm/Lsm家族成員[1]。Hfq蛋白為同源六聚體結(jié)構(gòu)，通過促進sRNA與mRNA結(jié)合而發(fā)揮作用[2]。當其存在時，sRNA不僅可與mRNA的5′UTR及編碼區(qū)結(jié)合，還可與 3′UTR 結(jié)合。一條sRNA通過不同位點可與不同的mRNA結(jié)合，廣泛參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[3]。

Hfq蛋白參與的sRNA調(diào)節(jié)途徑被認為是細菌耐藥的重要機制之一，它也可以調(diào)節(jié)菌株毒力，可能是潛在的藥物治療靶點[4-5]。在銅綠假單胞菌中，缺乏Hfq會導致多黏菌素耐藥[6]。Hfq蛋白還與氣單胞菌持留菌有關(guān)[7]。另有研究發(fā)現(xiàn)，致病性大腸埃希菌的MgrR、RyhB以依賴Hfq蛋白的方式調(diào)節(jié)grlRA，從而調(diào)節(jié)其毒力[8]。

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae，KP)是臨床常見感染的病原體，中國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)(China Antimicrobial Surveillance Network, CHINET)監(jiān)測提示其檢出率及耐藥率均逐年升高，尤其是碳青霉烯類耐藥株檢出率明顯上升，給臨床治療帶來極大困難[9]，甚至出現(xiàn)了耐多黏菌素KP菌株的局部暴發(fā)[10]。Hfq蛋白在KP中的功能相關(guān)研究較為少見，對KP耐藥、毒力的影響及其機制尚未明了。

本研究將我院在2017年8月―2018年8月收集的KP與其他常見菌株的Hfq蛋白進行比較分析，并敲除1株KP菌的hfq基因用于后續(xù)研究，期望對KP感染的臨床診治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 59株KP自2017年8月―2018年8月在我院就診的臨床病例中分離。11株臨床常見菌株hfq基因從NCBI基因庫中下載(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)，分別是銅綠假單胞菌PAO1(Pseudomonasaeruginosa，AAG08329.1)、沙門菌LT2(Salmonellaenterica，NP_463222.1)、霍亂弧菌N16961(Vibriocholerae， NP_230001.1)、副溶血性弧菌RIMD 2210633(Vibrioparahaemolyticus，NP_799196.1)、KP HS11286(KP，NC_016845.1)、洋蔥伯克霍爾德菌ATCC 25416(Burkholderiacepacia，NZ_CP012981.1)、痢疾志賀菌Sd197(Shigelladysenteriae, NC_007606.1)、大腸埃希菌 MG1655(Escherichiacoli，NC_000913.3)、陰溝腸桿菌ATCC13047(Enterobactercloacae，NC_014121.1)、產(chǎn)單核細胞李斯特菌NCTC7974(Listeriamonocytogenes，VEH62636.1)、金黃色葡萄球菌NCTC 8325(Staphylococcusaureus，NC_007795.1)。

1.1.2 基因分析軟件 LINUX系統(tǒng)安裝ncbi-blast-2.9.0+、Samtools軟件，WINDOWS下安裝MAFFT(v7.037b)軟件，同時使用下列在線工具：EMBOSS Transeq(https://www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_transeq)、ESPript3.0(http://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript)、EMBL-EBI(https://www.ebi.ac.uk/Tools/st/)、BoxShade(https://embnet.vital-it.ch/software/BOX_form.html)、ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)、NCBI-conserved domains(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi?)和Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)。

1.1.3 實驗材料 2X HiFi Master Mix、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)物回收磁珠購自Biorise Life Science公司；質(zhì)粒pTargetF、pBBR1MCS-2、pCas9購自Addgene公司，其中pTargetF (Cm) 質(zhì)粒為本實驗室保存，在pTargetF的664～1 323 位點間加入了氯霉素抗性基因；質(zhì)粒pSMART-LCKan購自Lucigen公司；KpnI-HF、HindⅢ-HF、Turbo感受態(tài)、Gibson組裝克隆試劑盒購自NEW ENGLAND Biolabs公司； LB培養(yǎng)基：蛋白胨(tryptone)、酵母粉(yeast extract)為Oxoid公司產(chǎn)品，氯化鈉(NaCl)、瓊脂(agar)為Sigma公司產(chǎn)品；甘油、阿拉伯糖購自Sigma公司；卡那霉素(Kan)、氯霉素(Cm)購自索萊寶公司；亞胺培南/西司他丁(泰能)為默沙東公司產(chǎn)品；DNA 提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自天根公司；所用引物由擎科公司合成，KP 2017009菌株hfq基因敲除所用引物見表1。

1.2 方法

1.2.1 菌株hfq核酸序列分析 提取細菌基因組，送浙江天科公司進行基因組測序。 在LINUX下采用cat函數(shù)合并所有59例KP基因組，根據(jù)Blast比對結(jié)果，Samtools faidx提取菌株hfq基因。采用MAFFT軟件將本院收集菌株的基因序列及蛋白質(zhì)序列與下載的基因序列及蛋白序列進行多重序列比對，比對結(jié)果采用BoxShade標記。

表1 PCR引物

Tab.1 Primers for PCR

PrimerPrimer sequence 5'-3'Hfq sgRNA FTGTTGCTGTGGTGAGACACCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGHfq sgRNA RGGTGTCTCACCACAGCAACAACTAGTATTATACCTAGGACTGApTargetF SeqCCGCCTTTGAGTGAGCTGATHfqΔ Up FatcaagcttgaattcgttATGAATGATGTAACCGAGGCHfqΔ Up RagcactggccTCAGTTCTGGCTCGCACCAACHfqΔ Down FccagaactgaGGCCAGTGCTGTTTTTCCACHfqΔ Down RatatctagagaattcgtcCCACATAGTCAACAAGCGTTGSL1CAGTCCAGTTACGCTGGAGTCSR2GGTCAGGTATGATTTAAATGGTCAGTHfqΔ Seq1GCTCCATCAACGCATAGAACHfqΔ Seq2CGGCAGTGATCTGGTTAAAGHfq FGAGTGAAACGATGGCTAAGGGGCAATCTTTACAAGHfq RagggaacaaaagctgggtacttaGAGATCTTCTTCGCTAATCAGTTTCTGTTCGGCGTCGTCGCTGTCTTHfqΔ FATGAATGATGTAACCGAGGCGAHfqΔ RCCACATAGTCAACAAGCGTTGGaraP FGCTGCAGGAATTCGATATCATTATGACAACTTGACGGCTACaraP RCCTTAGCCATCGTTTCACTCCATCCAAAAAAAC

表2 臨床分離的KP對藥物的敏感性

Tab.2 Drug sensitivity of clinicalKlebsiellapneumoniaestrains

Drug*Drug sensitivitySensitiveIntermediaryResistanceAmpicillin0059Amoxicillin/Clavulanate19733Piperacillin/tazobactam31127Cefazolin18041Cefuroxime16043Ceftriaxone22037Ceftazidime22234Cefepime31424Cefoperazone/sulbactam24326Cefoxitin23333Ertapenem31028Imipenem34025Meropenem32024Ciprofloxacin28625Levofloxacin36122Gentamicin39020Amikacin5009Fosfomycin1134Tigecycline35123Aztreonam23035Tobramycin34817Nitrofurantoin72230Sulfamethoxazole and trimethoprim32026

Ceftazidime, Aztreonam, Sulfamethoxazole and trimethoprim were detected in 58 cases, Meropenem was detected in 56 cases, Cefoperazone/sulbactam was detected in 53 cases, Fosfomycin was detected in 18 cases, and the others were detected in 59 cases.

1.2.2 Hfq氨基酸序列分析 使用EMBOSS Transeq將59例KP的hfq基因翻譯成蛋白質(zhì)氨基酸序列，以編號20170009菌株的Hfq氨基酸序列為代表，聯(lián)合11株臨床常見菌株Hfq蛋白進行分析。以MAFFT軟件進行氨基酸序列的多序列比對，用在線網(wǎng)站ESPript3.0分析蛋白二級結(jié)構(gòu)。氨基酸序列理化性質(zhì)用在線網(wǎng)站ProtParam計算。以NCBI數(shù)據(jù)庫中保守結(jié)構(gòu)域預測Hfq蛋白結(jié)構(gòu)域。采用Phyre2預測Hfq蛋白三級結(jié)構(gòu)。

1.2.3 KPhfq基因的敲除 采用CRISPR/Cas9同源重組敲除20170009菌株hfq基因，步驟如下：引物Hfq sgRNA F/Hfq sgRNA R擴增pTargetF(Cm)質(zhì)粒，添加Hfq sgRNA序列。PCR條件：預變性95 ℃ 3 min，變性98 ℃ 20 s，退火 59 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 1 min，10個循環(huán)；變性 98 ℃ 20 s，退火+延伸72 ℃ 75 s，20個循環(huán)；最終延伸72 ℃ 120 s。PCR產(chǎn)物用Gibson組裝克隆試劑盒參照說明書步驟連接線性化pTargetF(Cm)質(zhì)粒，構(gòu)建 pTargetF(Cm)-Hfq質(zhì)粒。電轉(zhuǎn)化Turbo感受態(tài)細胞，Cm抗性選擇LB培養(yǎng)板，37 ℃培養(yǎng)過夜。提取陽性菌質(zhì)粒，用pTargetF Seq測序驗證。分別使用引物HfqΔ Up F/HfqΔ Up R、HfqΔ Down F/HfqΔ Down R擴增KP 20170009 gDNA，PCR條件1：預變性95 ℃ 3 min，變性98 ℃ 20 s，退火 63 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 30 s，10個循環(huán)；變性 98 ℃ 20 s，退火+延伸72 ℃ 45 s，20個循環(huán)；最終延伸 72 ℃ 1 min。PCR條件2：預變性95 ℃ 3 min，變性98 ℃ 20 s，退火 65 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 45 s，10個循環(huán)；變性 98 ℃ 20 s，退火+延伸72 ℃ 1 min，20個循環(huán)；最終延伸72 ℃ 90 s。上述所得產(chǎn)物采用Gibson組裝克隆試劑盒參照說明書步驟連接線性化pSMART-LCKan質(zhì)粒，構(gòu)建HfqΔ(009)/pSMART-LCKan質(zhì)粒。電轉(zhuǎn)化Turbo感受態(tài)細胞，Kan抗性選擇LB培養(yǎng)板，37 ℃培養(yǎng)過夜。提取陽性菌質(zhì)粒，用SL1/SR2、HfqΔ Seq1/HfqΔ Seq2測序驗證。電轉(zhuǎn)pCas9質(zhì)粒到上述KP 20170009感受態(tài)，30 ℃復蘇，鋪LB+Kan平板，30 ℃培養(yǎng)過夜；次日取上述菌30 ℃培養(yǎng)，培養(yǎng)液加入阿拉伯糖10 mmol/L。參照1.2.3方法，制備KP 20170009 (pCas9)電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞。電轉(zhuǎn)100 ng pTargetF(Cm)-Hfq和400 ng HfqΔ(009) KP 20170009 (pCas9)感受態(tài)細胞，30 ℃復蘇。鋪Kan+Cm抗性LB平板，30 ℃培養(yǎng)。使用引物HfqΔ Seq1/HfqΔ Seq2擴增陽性敲除菌株gDNA，PCR條件：預變性95 ℃3 min，變性98 ℃ 20 s，退火 64 ℃ 10 s，延伸72 ℃ 45 s，30個循環(huán)；最終延伸72 ℃ 90 s。對產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳并測序驗證。

單片機也稱微控制器，它集成CPU、ROM、RAM、存儲器、I/O口等，而微處理器是CPU，它僅集成運算器和控制器，沒有存儲器和接口。哈爾濱工業(yè)大學教授是單片機原理課程的負責人，長期從事“單片機原理及應(yīng)用”、“計算機自動測試”等課程的教學工作，培養(yǎng)優(yōu)秀的應(yīng)用人才，明確教學課程設(shè)置目的，通過對學生職業(yè)能力和社會能力分析，貫徹落實教學計劃，認真探討學習方法,從而促進學生專業(yè)能力、方法能力，培養(yǎng)學生們發(fā)現(xiàn)問題、分析問題、解決問題的能力,對此，我們進行了有效的教學實踐研究與探討。

1.2.4 菌株耐藥性測定 將20170009及20170009Δhfq菌株過夜振蕩培養(yǎng)，1∶100稀釋于4 ml MH肉湯培養(yǎng)基中，分別加入0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.3 μg/mL泰能共培養(yǎng)，設(shè)未加泰能組為對照，分別取1 h、2 h、3 h、4 h菌液計數(shù)，繪制生長曲線。

1.2.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，以獨立樣本t檢驗比較各時間點菌落數(shù)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床分離KP hfq基因密碼子相對保守

共收集本院59例KP，其中分離自男性患者33例，女性患者26例。來源于膽汁及腹腔引流液36例，痰液15例，尿液6例，血液及咽拭子各1例。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase，ESBL)陰性19例，ESBL陽性11例，碳青霉烯類耐藥28例。分析所收集的菌株hfq基因發(fā)現(xiàn)，3株hfq基因存在個別密碼子位點差異，如20180228的219位點C→T，20180088、20180228、20180232的240位點T→C，20180232的252位點G→A，見圖1。

2.2 Hfq氨基酸理化性質(zhì)

ProtParam預測的氨基酸pI、消光系數(shù)、穩(wěn)定性、親水性等理化指數(shù)詳見表3。所有菌株Hfq蛋白均為親水蛋白。金黃色葡萄球菌、產(chǎn)單核細胞李斯特菌Hfq蛋白穩(wěn)定性高，其他菌株Hfq蛋白均不穩(wěn)定。腸桿菌Hfq蛋白含有相同的正負電荷氨基酸數(shù)，與弧菌、銅綠假單胞菌、洋蔥伯克霍爾德菌存在差別，其中僅金黃色葡萄球菌含有較多的負電荷氨基酸。大腸埃希菌Hfq蛋白序列與KP存在2個位點差別，分別為大腸埃希菌79位點插入蘇氨酸(T)，94位點缺失脯氨酸(P)。在2017009序列的上述位點插入T及刪除P，然后分別計算理化值(表3)，20170009-79Tins和20170009-94Pdel主要表現(xiàn)為指數(shù)不穩(wěn)定及親水性改變，對消光系數(shù)無影響。

The nucleotide sequence alignment results by MAFFT are marked by the BoxShade, the black background color are labeled as a consensus sites, the unlabeled are mutation sites, the consensus is all sequence identity information, and the mutation site position is marked by a lowercase letter.

圖1 部分KPhfq基因的核酸序列比對結(jié)果

Fig.1 Part of Klebsiella pneumoniaehfqgene nucleic acid sequence alignment results

表3 Hfq蛋白氨基酸理化特點

Tab.3 Physicochemical characteristics of Hfq amino acid

StrainAminoacid Molecular weightpINegative AA1Positive AA Extinction coefficientUnstable indexAliphatic indexGRAVY2017000910211 003.216.96884 47066.5978.33-0.456E.coli10211 166.396.97884 47066.9177.35-0.50520170009-79Tins103111 04.326.96884 47065.2177.57-0.45820170009-94Pdel10110 906.106.96884 47063.3379.11-0.445S.enterica10211 133.366.97884 47063.9678.33-0.503V.parahaemolyticus879 839.239.229112 98062.2989.54-0.508V.cholerae879 769.189.229112 98061.6191.84-0.391S.dysenteriae10211 192.426.97884 47073.1076.37-0.538E.cloacae10311 118.346.97884 47061.3277.57-0.457B.cepacia798 849.198.12674 47053.73102.28-0.084P.aeruginosa829 103.529.52694 47058.0397.32-0.244S.aureus778 778.734.691265 96039.96*74.68-0.544L.monocytogenes778 714.999.16792 98033.93*92.34-0.275

The negative amino acids are Asp and Glu, and positive amino acids are Arg and Lys. GRAVY: grand average of hydropathicity.

2.3 Hfq蛋白序列C末端呈酸性

將上述hfq核苷酸序列翻譯成蛋白質(zhì)氨基酸序列，59株KP Hfq氨基酸序列完全一致，且與NCBI數(shù)據(jù)庫中的KP(HS11286)序列一致，見圖2。因此，選用20170009菌株Hfq氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫下載的11株臨床常見菌株Hfq氨基酸序列進行后續(xù)分析。氨基酸位點一致性如圖2中黑色陰影標注所示，所有菌株序列在N末端高度保守，均具有1個α螺旋及后續(xù)連著5個β折疊(β1～β5)的二級結(jié)構(gòu)，金黃色葡萄球菌、產(chǎn)單核細胞李斯特菌Hfq氨基酸的N末端與其他菌株也有明顯差別。KP的Hfq氨基酸序列與大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、痢疾志賀菌相似性較高，弧菌、銅綠假單胞菌、洋蔥伯克霍爾德菌Hfq氨基酸與腸桿菌的主要差別在C末端，表現(xiàn)為明顯截短，如圖2。C末端序列以酸性氨基酸為主，末端10個氨基酸pI在3.37～4.41，包括谷氨酰胺(Q)、脯氨酸(P)、天冬氨酸(D)、絲氨酸(S)、谷氨酸(E)、蘇氨酸(T)等，見圖3。

2.4 KP Hfq蛋白RNA結(jié)合位點

用NCBI保守結(jié)構(gòu)域進行檢索，結(jié)果提示20170009 Hfq氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)位于1～76位點，與圖2結(jié)果一致。其中，22-VSIYLVN*GIKLQGQIESRDQFVILLK-47為Sm1基序，51-SQMVYKHAISTV-62為Sm2基序。含有11個RNA結(jié)合位點，分別為25Y、29G、30I、31K、32L、33Q、46L、52Q、60S、61T和63V。

2.5 β4-β5區(qū)是Hfq蛋白的重要功能區(qū)域

The amino acid sequence alignment results are labeled by ESPript3.0, the sequence identity marked black background marker, and which secondary structure are predicted, such as the α1 helix and β1-β5 fold upper in the figure, and the amino acid position is indicated by the sequence position of 20170009 strain.

圖2 Hfq氨基酸序列比對結(jié)果及二級結(jié)構(gòu)預測

Fig.2 Hfq amino acid sequence alignment results and secondary structure

The 10 amino acids of the C-terminal of Hfq protein were shown by weblogo3.

圖3 Hfq蛋白C末端氨基酸保守位點

Fig. 3 Conserved sites of Hfq protein C-terminal amino acid sequence

2.6 KP hfq基因敲除菌株的耐藥能力下降

采用CRISPR/Cas9同源重組敲除20170009菌株hfq基因，挑選基因敲除后的菌株及原始菌株，煮沸法提取基因組，采用HfqΔ Seq1/HfqΔ Seq2引物進行PCR擴增及1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖6。PCR產(chǎn)物測序結(jié)果提示hfq基因成功敲除。

將野生株及基因敲除株在不同泰能濃度下培養(yǎng)，繪制生長曲線，結(jié)果見圖7。兩者在無抗生素存在下，菌落數(shù)無明顯統(tǒng)計學差異。在各濃度的泰能組，009Δhfq菌落數(shù)均較009野生株菌落數(shù)減少，其中0.1 μg/mL濃度組在第4小時P=0.039，差異有統(tǒng)計學意義；0.2 μg/mL濃度組在第1、3、4小時P值分別為0.008、0.005、0.08，差異有統(tǒng)計學意義；0.3 μg/mL濃度組在第1、3、4小時P值分別為0.007、0.001、0.001, 差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果表明，hfq基因敲除菌株的耐藥能力下降。

The results were predicted by Phyre2. A: the ProQ2 quality assessment. B: The prediction results of conservative area. C: The mutational sensitivity of Hfq. D: The ProtinDB interface. E: the pocket detection.

圖4 Hfq單體三級結(jié)構(gòu)特點預測結(jié)果

Fig.4 Prediction results of three-dimensional structural characteristics of Hfq monomer

The four conservative residues sequence profiles were by scanning against the database using PSI-Blast and the mutations were made using the SuSPect method in Phyre2. A: Residue 54V. B: Residue 55Y. C: Residue 56K. D: Residue 57H. E: Residue 58A. F: Residue 59I.

圖5 Hfq氨基酸殘基序列譜及突變傾向

Fig.5 Hfq amino acid residue sequence profile and mutation tendency

Line 1: Marker 1(1kb DNA Ladder, 1000-10000bp)；Line 2: Marker 2(100 bp DNA Ladder, 100-1500 bp)；Line 3: 20170009 PCR results(1 459 bp)；Line 4: 20170009Δhfq PCR results (1 058 bp).

圖6 20170009及Δhfq菌株基因組PCR鑒定結(jié)果

Fig.6 Genomic PCR results of 20170009 and Δhfqstrain

3 討論

Hfq蛋白存在于約50%的細菌中，是一個全局性調(diào)節(jié)因子，在細菌生長、趨化、毒力、耐藥、應(yīng)對外界選擇壓力方面起重要調(diào)節(jié)作用[11]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)KP的Hfq蛋白氨基酸序列非常保守， 僅3株菌株的個別密碼子存在差異，氨基酸序列則完全一致，且與NCBI數(shù)據(jù)庫中的KP株(HS11286)保持一致。與同為腸桿菌科的大腸埃希菌比對，發(fā)現(xiàn)僅2個位點存在差別，分別為在79位點缺失蘇氨酸(T)及在94位點插入脯氨酸(P)，且均發(fā)生在保守區(qū)外的C末端，理化性質(zhì)上主要影響Hfq蛋白的穩(wěn)定性和親水性。

IMP: Imipenem.

圖7 20170009及Δhfq菌株在抗生素不同溶度刺激下的生長曲線

Fig.7 Growth curve of 20170009 and Δhfqstrain stimulated by different concentration of antibiotics

二級結(jié)構(gòu)分析提示N末端更加保守，預測KP的Hfq氨基酸N末端含有Sm1和Sm2兩個結(jié)構(gòu)，且發(fā)現(xiàn)β4～β5連接區(qū)較為保守，尤其是56 K位點，提示是重要功能位點。同區(qū)域中，銅綠假單胞菌的57H[12]、惡臭假單胞菌56 K[13]均與空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定相關(guān)。此外，與本例產(chǎn)單核細胞李斯特菌Hfq 58位點的“A”不同。Kovach 等研究結(jié)果顯示，58位點為“K”，也是RNA的結(jié)合位點[14]。KP Hfq蛋白的該區(qū)域是否與空間位置形成相關(guān)還需后續(xù)研究證實。

Hfq蛋白的C末端由于在不同菌株存在較大差異，目前對其結(jié)構(gòu)及功能的了解有限。有研究發(fā)現(xiàn)，大腸埃希菌C末端可形成淀粉樣蛋白的纖維狀結(jié)構(gòu)，有利于Hfq蛋白在細胞內(nèi)定位[15]，且Hfq蛋白的C末端所含氨基酸偏酸性，有利于RNA退火，對sRNA與mRNA和DNA的結(jié)合以及RNA與Sm區(qū)域的結(jié)合也有促進作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn)包括KP在內(nèi)的各菌株C末端氨基酸pI都在4.0左右，可能具有類似的功能。以大腸埃希菌的Hfq序列為模板，用Phyre2預測KP的Hfq蛋白三維模型，僅N末端68(66.67%)個氨基酸比對上模板序列，單體結(jié)構(gòu)見圖4和圖5。Hfq功能蛋白為由6個單體組成的圓盤狀六聚體結(jié)構(gòu)，研究表明近側(cè)面結(jié)合RNA的poly U結(jié)構(gòu)[17]，遠側(cè)面可結(jié)合AAN重復序列而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。此外它也可參與自身調(diào)節(jié)[18]。近年來還發(fā)現(xiàn)部分RNA與Hfq蛋白的邊緣結(jié)構(gòu)結(jié)合而發(fā)揮作用，側(cè)面邊緣和近端在結(jié)構(gòu)上更靠近C末端區(qū)域，觀察到之間存在瞬時聯(lián)系，可能有利于C末端釋放雙鏈RNA和sRNA[19]。此外，Hfq六聚體側(cè)面邊緣結(jié)構(gòu)與RNA的結(jié)合在空間上依賴于各單體的精氨酸在側(cè)面邊緣結(jié)構(gòu)的聚集[20]。大腸埃希菌由于缺乏精氨酸，其側(cè)面邊緣結(jié)構(gòu)對sRNA、mRNA的作用有限[2]。KP的Hfq蛋白與大腸埃希菌Hfq蛋白類似，也缺乏精氨酸，邊緣結(jié)構(gòu)的作用可能同樣有限。

既往研究提示，Hfq蛋白與KP的適應(yīng)能力及毒力相關(guān)。如Chiang等研究發(fā)現(xiàn)，有17.3%和19.5% 的基因依賴Hfq蛋白而作用于RpoS、RpoE等因子，調(diào)節(jié)KP毒力基因表達[21]。也有研究提示，Hfq蛋白介導sRNA廣泛參與代謝酶、外排泵、轉(zhuǎn)運蛋白等的調(diào)節(jié)，從而參與耐藥機制[4-5]。敲除hfq基因的銅綠假單胞菌對抗生素的敏感性提高，該過程與viz泵、能量代謝、細胞壁和脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)組分的改變有關(guān)[22]。在維氏氣單胞菌中，hfq基因缺失株可對替加環(huán)素、頭孢噻肟、環(huán)丙沙星等多種抗生素的耐藥性下降，且可能與RelE、CspD、ClpB、RpoS、OxyR基因下調(diào)和OppB基因上調(diào)有關(guān)[23]。大腸埃希菌在敲除hfq基因后對多種抗生素的敏感性恢復，如同時敲除外排泵acrB基因，可抵消這種作用，提示這可能與hfq調(diào)節(jié)外排泵有關(guān)[24]。另有研究發(fā)現(xiàn)，多種sRNA通過Hfq蛋白參與大腸埃希菌和沙門菌的耐藥[25]。本研究采用CRISPR/Cas同源重組法獲得1株敲除hfq基因的KP菌，與野生株相比，Δhfq菌株耐碳青霉烯類能力下降，但是菌株生長無明顯影響，提示hfq基因參與了KP的耐藥調(diào)節(jié)。此外，該Δhfq菌株可用于進一步研究其在KP病理生理中的作用，揭示Hfq蛋白不同氨基酸位點的功能。

總之，本研究結(jié)果提示KP的Hfq蛋白較為保守，VYKHAI可能是重要的功能結(jié)構(gòu)域，hfq基因缺失株耐藥性明顯下降，明確Hfq蛋白功能具有重要的臨床意義。今后將進一步研究KP耐藥及其毒力調(diào)節(jié)的分子機制，以期為抗感染藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。