絲素蛋白-羥基磷灰石三維大孔支架復(fù)合脂肪干細胞體外構(gòu)建組織工程骨的可行性研究

丁曉明，張凱三，劉婷婷，朱明，王祥杰，潘月興，劉玉田，郭振光，徐開民，楊彬

(1.日照市中醫(yī)醫(yī)院，山東 日照 276800；2.日照市人民醫(yī)院，山東 日照 276827)

因腫瘤切除、創(chuàng)傷和骨髓炎等導(dǎo)致的骨損傷、骨缺損，處理較為困難。目前常用的自體或異體骨移植、骨搬移等技術(shù)均有一定的療效，但都存在一定的缺陷[1-4]。骨組織工程技術(shù)的出現(xiàn)，給骨缺損修復(fù)帶來了新的思路[3,5]。骨組織工程技術(shù)的關(guān)鍵在于支架的構(gòu)建[6-8]，支架的孔徑、孔隙、連通性對于所構(gòu)建的組織工程骨的生物力學(xué)特征具有重要影響。絲素蛋白(silk fibroin，SF)是一種由18種氨基酸組成的天然大分子蛋白，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、性能優(yōu)良、可塑性強[9]。羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)是骨基質(zhì)的主要礦物質(zhì)成分，因其本身的生物活性和骨誘導(dǎo)作用[10]，可與聚己內(nèi)酯、膠原和SF等天然或合成材料相結(jié)合制備骨支架[11-14]。本研究探討了SF-HA三維大孔支架復(fù)合脂肪干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)體外構(gòu)建組織工程骨的可行性，現(xiàn)總結(jié)報告如下。

1 材料與儀器

Ⅰ型膠原酶、CCK8、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)、胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)、納米級HA(Sigma公司)，石蠟(上海永華石蠟有限公司)，兔ADSCs(湖南欣瑞生物科技有限公司)，成骨誘導(dǎo)液(成分包括10 ng·mL-1TGF-β1、100 ng·mL-1IGF-1、50 μg·mL-1抗壞血酸、40 μg·mL-1L-脯氨酸、6.25 μg·mL-1胰島素、6.25 μg·mL-1轉(zhuǎn)鐵蛋白、6.25 ng·mL-1硒酸、100 μg·mL-1丙酮酸鈉、300 μg·mL-1L-谷氨酰胺、10%FBS和1%青霉素-鏈霉素混合溶液)，兔Ⅰ型膠原Elisa試劑盒(上海藍基生物科技有限公司)，鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(strept avidin-biotin complex，SABC)免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，S-4800掃描電子顯微鏡(Hitachi公司)，Sky Scan 1174 micro-CT(Bruker公司)。

2 方 法

2.1SF-HA三維大孔支架構(gòu)建及性能評估

2.1.1SF-HA三維大孔支架構(gòu)建 采用石蠟微球瀝濾技術(shù)[13]制備SF-HA三維大孔支架。將40～60目石蠟微球加入模具中，表面給予合適的壓力壓平，移入預(yù)熱的烘箱中在50 ℃加熱60 min后室溫冷卻。將提純后的SF配制成10%溶液。稱取一定量的納米級HA粉末，按照質(zhì)量比1∶10添加蒸餾水制成10%HA勻漿。2種液體按照1∶1混合，在超聲振蕩器中混勻后加到模具中，真空抽吸后移入-80 ℃冰箱4 h，在無水乙醇中浸泡2 h使SF結(jié)晶，以正己烷提取石蠟微球后剩余的即為支架結(jié)構(gòu)。

2.1.2SF-HA三維大孔支架性能評估 取部分支架樣本使用micro-CT進行掃描重建，使用Image J軟件從掃描圖片中選擇50個以上孔隙，觀察支架結(jié)構(gòu)并計算支架結(jié)構(gòu)的平均孔徑和支架孔隙率，支架孔隙率=[1-(支架總體積-支架結(jié)構(gòu)體積)/支架總體積]×100%；將支架樣本放入PBS中浸泡24 h，置于MTF-100力學(xué)加載裝置加力平臺上，以0.5 mm·min-1進行壓縮測試，計算支架的彈性模量，彈性模量=(截面的載荷/截面面積)/(支架壓縮前后高度差值/支架原始高度)。

2.2SF-HA三維大孔支架生物相容性評估將兔ADSCs以成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)7 d后，按照1×107個·mL-1的密度接種到SF-HA三維大孔支架上，孵育2 h后添加成骨誘導(dǎo)液，移入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)液，進行以下測試：①培養(yǎng)7 d后，取樣浸入2.5%戊二醛固定，經(jīng)梯度乙醇脫水，切片噴金后使用掃描電子顯微鏡觀察；②分別于培養(yǎng)7 d、21 d后取樣，使用多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，透明滲透后，石蠟包埋機常規(guī)包埋切片，后經(jīng)脫蠟處理，進行HE染色后鏡下觀察；③分別于培養(yǎng)7 d、21 d后取樣，以CCK8測定細胞增殖情況。

2.3ADSCs在SF-HA三維大孔支架上的成骨分化情況評估

2.3.1定性觀察 分別于SF-HA三維大孔支架ADSCs復(fù)合體培養(yǎng)7 d、21 d后取樣，使用多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，透明滲透后，石蠟包埋機常規(guī)包埋切片，經(jīng)脫蠟處理，取切片分別進行Von Kossa染色和Ⅰ型膠原免疫組化染色。

Von Kossa染色步驟如下：①切片脫蠟、復(fù)水；②PBS洗滌1遍；③5%硝酸銀水溶液浸泡后紫外光照射10 min；④蒸餾水洗滌5 min；⑤5%次亞硫酸鈉溶液中放置2 min；⑥蒸餾水洗滌5 min；⑦襯染1 min，水洗后鏡檢。

Ⅰ型膠原免疫組化染色步驟如下：①切片脫蠟、復(fù)水，室溫下滴加3% H2O2滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水沖洗3次，每次2 min；②加入5%BSA，在20～37 ℃封閉30 min；③滴加鼠抗兔Ⅰ、Ⅱ型膠原抗體，冰箱4 ℃過夜，PBS緩沖液漂洗、晾干；④滴加生物素化羊抗兔IgG，37 ℃孵育2 h，PBS緩沖液漂洗、晾干；⑤滴加SABC，37 ℃孵育30 min，PBS緩沖液漂洗、晾干；⑥D(zhuǎn)AB室溫顯色5～15 min(鏡下觀察顏色變化確定顯色時間)，蒸餾水洗滌；⑦再經(jīng)蘇木素輕度復(fù)染 3 min，蒸餾水洗滌，水洗后鏡檢。

2.3.2定量評價 分別于SF-HA三維大孔支架ADSCs復(fù)合體培養(yǎng)1 d、7 d、21 d后取樣，以Elisa測定其中Ⅰ型膠原含量。具體操作步驟如下：每個時間取5個樣本，浸入PBS小心清洗、剪碎，再經(jīng)粉碎處理后，反復(fù)凍融得到勻漿，離心后提取上清液；取100 μL上清液，按照Elisa試劑盒說明書操作，使用酶標(biāo)儀測定波長450 nm處的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品曲線范圍(0～100 ng·mL-1)推算出對應(yīng)每組樣品濃度。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。SF-HA三維大孔支架ADSCs復(fù)合體培養(yǎng)7 d、21 d時的細胞數(shù)量比較采用t檢驗；SF-HA三維大孔支架ADSCs復(fù)合體培養(yǎng)1 d、7 d、21 d時的Ⅰ型膠原含量比較采用方差分析，不同時間點之間的兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié) 果

3.1SF-HA三維大孔支架性能評估結(jié)果支架內(nèi)部可見均勻排列的大孔結(jié)構(gòu)，連通性好(圖1)。支架孔徑(365.30±27.10)μm，孔隙率(85.30±1.80)%，彈性模量為(54.93±5.44)kPa。

圖1 絲素蛋白-羥基磷灰石三維大孔支架Micro-CT三維重建圖像

3.2SF-HA三維大孔支架生物相容性評估結(jié)果掃描電子顯微鏡圖像顯示細胞能夠很好地在支架孔壁上黏附和伸展，細胞通過孔隙之間的連通結(jié)構(gòu)長入孔隙內(nèi)或在孔隙邊緣呈拉網(wǎng)樣覆蓋，細胞周圍可見基質(zhì)分泌(圖2)。HE染色結(jié)果顯示，細胞核深染、胞漿紅染，均勻黏附在支架孔隙內(nèi)壁上，隨成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)時間延長，細胞和基質(zhì)明顯增多(圖3)。CCK8檢測結(jié)果顯示，培養(yǎng)21 d時SF-HA三維大孔支架上的細胞數(shù)量較培養(yǎng)7 d時增加(1.14±0.08，1.98±0.11，t=13.810，P=0.000)。

圖2 絲素蛋白-羥基磷灰石三維大孔支架脂肪干細胞復(fù)合體成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d后掃描電鏡圖像

圖3 絲素蛋白-羥基磷灰石三維大孔支架脂肪干細胞復(fù)合體HE染色結(jié)果(×200)

3.3ADSCs在SF-HA三維大孔支架上的成骨分化情況評估結(jié)果Von Kossa染色和Ⅰ型膠原免疫組化染色可觀察到鈣沉積和Ⅰ型膠原積累，而且隨時間延長不斷增多(圖4、圖5)。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)1 d、7 d、21 d時，SF-HA三維大孔支架ADSCs復(fù)合體上Ⅰ型膠原含量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(0.90±0.24，1.26±0.27，3.89±0.82，F(xiàn)=49.780，P=0.000)；成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d時的Ⅰ型膠原含量高于成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)1 d、7 d時(P=0.000；P=0.000)；成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)1 d、7 d時的Ⅰ型膠原含量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.059)。

圖4 絲素蛋白-羥基磷灰石三維大孔支架脂肪干細胞復(fù)合體Von Kossa染色結(jié)果(×200)

圖5 絲素蛋白-羥基磷灰石三維大孔支架脂肪干細胞復(fù)合體I型膠原免疫組化染色結(jié)果(×200)

4 討 論

骨組織工程技術(shù)經(jīng)過多年的發(fā)展，已取得了很大的進步[2-3,6]。在眾多骨支架材料中，SF的細胞附著率和增殖率較好，并且具有合適的力學(xué)性能、較低的免疫原性以及可控的降解速率等特征，是制備骨支架的理想材料[8,12]。HA也具有較好的生物活性和骨誘導(dǎo)作用，可以與天然或合成材料共同制備理想的骨支架[13-17]。

骨支架制備技術(shù)較多，如冷凍干燥、鹽瀝濾、石蠟微球瀝濾等[8,13,18-20]。石蠟微球瀝濾技術(shù)可操作性強，通過控制石蠟微球體積及加熱溫度、時間，可制作出具有理想孔隙和連通性的骨支架。但目前采用該方法加工SF支架的研究較少?；谝酝难芯浚覀兡７绿烊还堑慕Y(jié)構(gòu)，通過石蠟微球瀝濾技術(shù)成功制備SF-HA多孔結(jié)構(gòu)作為骨支架，并確定了10%SF和10%HA等比例混合的最佳比例，最終制備的骨支架具有良好的三維大孔結(jié)構(gòu)，孔隙均勻、連通性好、力學(xué)性能優(yōu)良，符合成骨細胞生長對于孔徑、孔隙率的基本要求[13]。

支架材料本身的骨誘導(dǎo)作用并不能完全滿足細胞在支架上的成骨誘導(dǎo)分化，這就需要生長因子的調(diào)節(jié)功能。使用特定的生長因子能夠引導(dǎo)和加速細胞在特定方向上的生長、分化[21-23]。生長因子的添加需要經(jīng)過多重檢測，充分評估其對細胞生長和誘導(dǎo)分化的利弊，選擇相對合適的濃度。根據(jù)以往關(guān)于ADSCs向骨細胞誘導(dǎo)分化的相關(guān)研究[24-26]，我們最終選擇本研究所述的成骨誘導(dǎo)液成分進行ADSCs成骨誘導(dǎo)。

從觀察結(jié)果可以看出，ADSCs在骨支架上經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)后，通過連通結(jié)構(gòu)長入孔隙內(nèi)或在孔隙邊緣呈拉網(wǎng)樣覆蓋，細胞周圍可見基質(zhì)分泌，支架上的細胞隨培養(yǎng)時間延長不斷增多，表明細胞在支架結(jié)構(gòu)內(nèi)黏附、增殖良好；Von Kossa染色及Ⅰ型膠原免疫組化染色、Elisa檢測結(jié)果顯示，支架上的骨基質(zhì)(鈣和Ⅰ型膠原)隨誘導(dǎo)培養(yǎng)時間延長不斷增加。

本研究的結(jié)果顯示，SF-HA三維大孔支架復(fù)合成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的ADSCs具有在體外構(gòu)建組織工程骨的可能。接種在SF-HA三維大孔支架上的ADSCs最終能否分化為成骨細胞及SF-HA三維大孔支架復(fù)合ADSCs能否再生骨組織，還有待于進一步的研究來證實。