膝關(guān)節(jié)僵硬實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的研究進(jìn)展

陳科，張?chǎng)?，劉麗珠，廖瑩?/p>

(1.成都體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)與健康學(xué)院，四川 成都 610041；2.四川省骨科醫(yī)院，四川 成都 610041)

膝關(guān)節(jié)僵硬臨床較為常見，是膝關(guān)節(jié)骨折、膝部軟組織損傷、膝骨關(guān)節(jié)炎或膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的常見并發(fā)癥[1-2]。膝關(guān)節(jié)僵硬可嚴(yán)重影響患者的日常生活，降低其生活質(zhì)量。深入研究膝關(guān)節(jié)僵硬的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，有助于明確膝關(guān)節(jié)僵硬的發(fā)生機(jī)制、探索膝關(guān)節(jié)僵硬的最佳治療方式[3]。目前有關(guān)膝關(guān)節(jié)僵硬實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的研究較多，但尚無該模型的統(tǒng)一制備方法及檢測(cè)指標(biāo)。為此，本文對(duì)膝關(guān)節(jié)僵硬實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1 膝關(guān)節(jié)僵硬實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的種類

我們以“膝關(guān)節(jié)僵硬”“膝關(guān)節(jié)攣縮”“動(dòng)物模型”和“traumatic knee contracture”“animal model”“knee stiff”“knee joint stiffness”等為關(guān)鍵詞，從中國知網(wǎng)、萬方和PubMed數(shù)據(jù)庫中檢索了相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)多數(shù)膝關(guān)節(jié)僵硬實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型為大鼠(以SD大鼠居多)和兔(以新西蘭白兔居多)，其次為山羊。

2 膝關(guān)節(jié)僵硬實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的制備方法

2.1 屈曲型膝關(guān)節(jié)僵硬Salib等[4]選擇新西蘭白兔制備屈曲型膝關(guān)節(jié)僵硬實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型：采用吸入異氟醚對(duì)新西蘭白兔進(jìn)行全身麻醉；取膝前正中入路，由髕旁切開進(jìn)入關(guān)節(jié)腔，離斷交叉韌帶，先用直徑為3 mm的鉆頭在股骨髁非軟骨處鉆孔造成骨皮質(zhì)缺損，然后將小腿過度伸展破壞關(guān)節(jié)囊，最后將膝關(guān)節(jié)屈曲至150°，并用克氏針固定8周；術(shù)后采用丁丙諾啡鎮(zhèn)痛、頭孢唑林抗感染；取出克氏針時(shí)，清除關(guān)節(jié)周圍的異位骨化組織；但實(shí)驗(yàn)過程中是否出現(xiàn)骨折、感染等情況，該研究未報(bào)道。Baranowski等[5]選擇大鼠制備屈曲型膝關(guān)節(jié)僵硬實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型：先過伸膝關(guān)節(jié)破壞關(guān)節(jié)囊，然后于大腿外側(cè)和脛骨前內(nèi)側(cè)切開，在脛骨干上斜向上方鉆一個(gè)直徑為1.2 mm的孔、在股骨外側(cè)髁非軟骨處鉆一個(gè)直徑為2 mm的孔(這模擬了膝關(guān)節(jié)周圍骨折)，注意避免損傷外側(cè)副韌帶，最后用克氏針穿透脛骨和股骨，將膝關(guān)節(jié)固定于屈曲145°位；術(shù)后4周膝關(guān)節(jié)明顯僵硬，術(shù)后8周取出內(nèi)固定物后膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度未恢復(fù)正常；該研究報(bào)道了3只大鼠由于麻醉意外或克氏針脫落而被剔除，但未報(bào)道大鼠感染情況。

2.2 伸直型膝關(guān)節(jié)僵硬伸直型膝關(guān)節(jié)僵硬實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的制備方法主要包括非手術(shù)方法和手術(shù)方法：非手術(shù)方法操作簡(jiǎn)單，對(duì)動(dòng)物的創(chuàng)傷相對(duì)較小，但固定肢體的時(shí)間較長(zhǎng)；手術(shù)方法的優(yōu)點(diǎn)是能精準(zhǔn)控制膝關(guān)節(jié)固定角度，缺點(diǎn)是操作較為復(fù)雜、創(chuàng)傷較大、感染風(fēng)險(xiǎn)較高。無論選擇何種膝關(guān)節(jié)僵硬實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制備方法，關(guān)鍵在于保持動(dòng)物模型的穩(wěn)定性，即關(guān)節(jié)功能不會(huì)因?yàn)闀r(shí)間延長(zhǎng)而有較大變化。

2.2.1非手術(shù)方法 張理平等[6]采用非手術(shù)方法制備伸直型膝關(guān)節(jié)僵硬實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型：先對(duì)兔膝關(guān)節(jié)進(jìn)行強(qiáng)力扭轉(zhuǎn)、暴力按摩，造成膝關(guān)節(jié)周圍軟組織損傷，然后將膝關(guān)節(jié)固定于伸直位4周；但該研究未報(bào)道膝關(guān)節(jié)骨折等情況。周云等[7]先對(duì)兔進(jìn)行全身麻醉，然后將其膝關(guān)節(jié)置于完全伸直位、踝關(guān)節(jié)置于跖屈60°位，最后用石膏固定；6周后膝關(guān)節(jié)攣縮程度趨于穩(wěn)定。

2.2.2手術(shù)方法 黃哲元等[8]選擇山羊制備伸直型膝關(guān)節(jié)僵硬實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型：先切斷山羊髕韌帶，顯露股骨遠(yuǎn)側(cè)干骺端前側(cè)，然后屈曲膝關(guān)節(jié)，顯露關(guān)節(jié)面，最后用直徑為2 mm的克氏針將膝關(guān)節(jié)固定于伸直位，并加用石膏固定；術(shù)后8周去除石膏及內(nèi)固定物后，膝關(guān)節(jié)僵硬程度與術(shù)后4周相比無明顯變化，且術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度明顯小于健側(cè)。

3 膝關(guān)節(jié)僵硬實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的檢測(cè)指標(biāo)

膝關(guān)節(jié)僵硬實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的檢測(cè)指標(biāo)大致分為兩類：一類為膝關(guān)節(jié)僵硬的療效指標(biāo)，主要反映僵硬膝關(guān)節(jié)的功能等情況；另一類為膝關(guān)節(jié)僵硬的病理指標(biāo)，主要反映僵硬膝關(guān)節(jié)的細(xì)胞等病理變化。

3.1 療效指標(biāo)

3.1.1關(guān)節(jié)活動(dòng)度 關(guān)節(jié)活動(dòng)度是臨床和科研評(píng)價(jià)關(guān)節(jié)功能的基本指標(biāo)之一。臨床常將膝關(guān)節(jié)及其周圍肌肉和韌帶組織視為一個(gè)整體進(jìn)行活動(dòng)度測(cè)量，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可通過切斷膝關(guān)節(jié)周圍的肌肉和韌帶組織來觀察由關(guān)節(jié)囊攣縮引起的關(guān)節(jié)活動(dòng)受限情況。Trudel等[9]對(duì)膝關(guān)節(jié)僵硬模型大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的肌源性攣縮及關(guān)節(jié)源性攣縮情況進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)源性攣縮程度隨時(shí)間推移而加重、肌源性攣縮程度在膝關(guān)節(jié)固定2周后逐漸減輕。人體關(guān)節(jié)活動(dòng)度的測(cè)量，多通過受試者的主觀感受判定關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍的起止點(diǎn)，而動(dòng)物關(guān)節(jié)的活動(dòng)度則多通過扭矩或力矩等指標(biāo)反映。Fukui等[10]研究發(fā)現(xiàn)，新西蘭白兔的膝關(guān)節(jié)最大扭矩為0.2 N·m，當(dāng)牽拉速度為0.4 mm·s-1時(shí)可以將慣性的影響降至最低。Steplewski等[11]將角速度設(shè)定為40(°)·min-1來減小機(jī)械慣性對(duì)兔膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度的影響。Trudel等[12]研究發(fā)現(xiàn)，切斷大鼠膝關(guān)節(jié)周圍肌肉、破壞膝關(guān)節(jié)囊(伸膝超過0°)后，膝關(guān)節(jié)的最小力矩為1649 g·cm。

3.1.2關(guān)節(jié)剛度 關(guān)節(jié)僵硬是對(duì)關(guān)節(jié)病理狀態(tài)的主觀描述，不能反映僵硬關(guān)節(jié)的生物力學(xué)特性。對(duì)關(guān)節(jié)的僵硬程度有一個(gè)定量的描述，有利于評(píng)價(jià)僵硬關(guān)節(jié)的生物力學(xué)特性。“剛度”是指物體在承受外力時(shí)抵抗形變的能力，可通過測(cè)量關(guān)節(jié)剛度定量評(píng)價(jià)關(guān)節(jié)的力學(xué)情況。根據(jù)膝關(guān)節(jié)屈伸僵硬的特點(diǎn)，可將膝關(guān)節(jié)視為一個(gè)力矩模型，膝關(guān)節(jié)剛度即膝關(guān)節(jié)最大活動(dòng)度時(shí)膝關(guān)節(jié)力矩改變量與膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度改變量之比[13]。Salib等[4]對(duì)新西蘭白兔的膝關(guān)節(jié)剛度進(jìn)行了測(cè)試，關(guān)節(jié)測(cè)試儀的扭矩范圍為0～80 N·cm，以恒定速率逐漸增加扭矩，并測(cè)量關(guān)節(jié)角度的變化，通過軟件繪制成扭矩-關(guān)節(jié)角度線性圖，其斜率表示關(guān)節(jié)剛度。Zhou等[3]分別在2.5 N·cm、7.5 N·cm、12.5 N·cm及17.5 N·cm的預(yù)定扭矩下牽伸大鼠膝關(guān)節(jié)，預(yù)定扭矩的范圍根據(jù)正常大鼠的膝關(guān)節(jié)力學(xué)測(cè)試情況制定，2.5 N·cm是剛好高于可測(cè)量的阻力點(diǎn)的值、17.5 N·cm是導(dǎo)致關(guān)節(jié)超過最大伸展角度(180°)和肌橫斷術(shù)后關(guān)節(jié)囊破裂的值；當(dāng)達(dá)到預(yù)定扭矩時(shí)，測(cè)試儀停止2.1 s，記錄關(guān)節(jié)角度，并制作扭矩-角位移圖，最后根據(jù)扭矩-角位移回歸線的斜率來計(jì)算關(guān)節(jié)剛度；該研究發(fā)現(xiàn)，大鼠膝關(guān)節(jié)制動(dòng)4周時(shí)，其制動(dòng)側(cè)的膝關(guān)節(jié)剛度大于健側(cè)和對(duì)照組大鼠的膝關(guān)節(jié)剛度。

3.1.3步態(tài)分析 對(duì)于膝關(guān)節(jié)僵硬實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，可通過步態(tài)分析了解其關(guān)節(jié)僵硬情況。目前，Catwalk步態(tài)分析儀在大鼠的步態(tài)分析中較為常用；該儀器主要由玻璃通道、攝像頭、壓力傳感器等組成，大鼠走過玻璃通道時(shí)其足印會(huì)被通道下方的攝像頭拍攝并傳送至計(jì)算機(jī)進(jìn)行分析；為提高正式實(shí)驗(yàn)時(shí)采集的數(shù)據(jù)的有效性，可在正式實(shí)驗(yàn)前增加大鼠走過玻璃通道的次數(shù)。Catwalk步態(tài)分析儀的分析指標(biāo)包括靜態(tài)指標(biāo)(足印的面積、長(zhǎng)度、寬度等)和動(dòng)態(tài)指標(biāo)(步速、雙足站立相的持續(xù)時(shí)間等)，常用步態(tài)參數(shù)包括步幅、擺動(dòng)速度、最大接觸面積、平均壓力、支撐相時(shí)長(zhǎng)等。田海源[14]對(duì)膝關(guān)節(jié)僵硬大鼠進(jìn)行不同時(shí)長(zhǎng)的靜態(tài)漸進(jìn)性牽伸，并通過Catwalk步態(tài)分析儀對(duì)其步態(tài)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)牽伸干預(yù)后大鼠的足印面積、足平均壓力、步幅、擺動(dòng)速度等均較牽伸前增加，其中牽伸時(shí)間為30 min組的足平均壓力、步幅和擺動(dòng)速度優(yōu)于牽伸時(shí)間為20 min組和40 min組；認(rèn)為適度牽伸可改善膝關(guān)節(jié)僵硬大鼠的步態(tài)，但過長(zhǎng)的牽伸時(shí)間、過大的牽伸強(qiáng)度，可能造成二次損傷，反而會(huì)影響正常步態(tài)。

3.2 病理指標(biāo)

3.2.1肌成纖維細(xì)胞數(shù)量 肌成纖維細(xì)胞是一種特殊的成纖維細(xì)胞，關(guān)節(jié)僵硬被認(rèn)為與肌成纖維細(xì)胞的過度增殖有關(guān)。莊澤等[15]研究發(fā)現(xiàn)，僵硬關(guān)節(jié)的肌成纖維細(xì)胞中磷酸酶與張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog，PTEN)基因轉(zhuǎn)錄水平下降，可引起PTEN蛋白表達(dá)下降，從而激活了下游磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路，促進(jìn)了肌成纖維細(xì)胞增殖，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)纖維化。α-平滑肌肌動(dòng)蛋白是肌成纖維細(xì)胞的特異性標(biāo)記蛋白，可以通過免疫組織化學(xué)法對(duì)該蛋白進(jìn)行染色從而觀察肌成纖維細(xì)胞的數(shù)量。Hildebrand等[16]在研究兔膝關(guān)節(jié)僵硬模型時(shí)發(fā)現(xiàn)，與正常膝關(guān)節(jié)相比，創(chuàng)傷、固定4周后的膝關(guān)節(jié)內(nèi)肌成纖維細(xì)胞數(shù)量和肌成纖維細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比顯著增加。

3.2.2轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)表達(dá)水平 TGF-β是一種多功能細(xì)胞因子，可調(diào)節(jié)多種組織的分化、增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的生成。哺乳動(dòng)物的TGF-β有3種亞型，即TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，其中TGF-β1是一種普遍存在的纖維化因子，可于組織修復(fù)的早期階段大量釋放，在炎癥、創(chuàng)傷修復(fù)及纖維化過程中起關(guān)鍵作用，被認(rèn)為是與關(guān)節(jié)僵硬最相關(guān)的因子[17]。周云等[7]研究發(fā)現(xiàn)，隨著兔膝關(guān)節(jié)固定時(shí)間的延長(zhǎng)，其關(guān)節(jié)液及關(guān)節(jié)囊中TGF-β1水平逐漸增高。Monument等[18]研究發(fā)現(xiàn)，膝關(guān)節(jié)僵硬兔的關(guān)節(jié)囊內(nèi)TGF-β1 mRNA及蛋白表達(dá)水平均高于對(duì)照組。

3.2.3Ⅰ型和Ⅲ型膠原含量 Ⅰ型和Ⅲ型膠原是形成膠原纖維的主要成分，膠原纖維雖然可以促進(jìn)傷口愈合，但若過度沉積，則可引起關(guān)節(jié)纖維化，造成關(guān)節(jié)僵硬。Sasabe等[19]研究發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，觀察組大鼠的膝關(guān)節(jié)在固定1周后Ⅰ型膠原含量增加、固定2周后Ⅰ型膠原密度增加。Li等[20]研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)僵硬大鼠的滑膜組織中Ⅲ型膠原mRNA水平明顯高于正常對(duì)照組，據(jù)此推測(cè)滑膜組織膠原代謝異常與骨折后關(guān)節(jié)僵硬的發(fā)生有關(guān)。Steplewski等[21]采用IgG重組抗體變體治療兔膝關(guān)節(jié)僵硬，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在治療2周后，與對(duì)照組相比，關(guān)節(jié)僵硬組兔膝關(guān)節(jié)內(nèi)Ⅲ型膠原與Ⅰ型膠原含量的比值降低，認(rèn)為抑制膠原纖維的形成可以緩解關(guān)節(jié)攣縮程度。

3.2.4基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)表達(dá)水平 MMP主要由巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生，是一類結(jié)構(gòu)中含有Zn2+、Ca2+的蛋白水解酶[22]。目前發(fā)現(xiàn)的MMP根據(jù)其作用底物可分為6類，即膠原酶、明膠酶、間質(zhì)溶解素、基質(zhì)溶解因子、膜型基質(zhì)金屬蛋白酶、其他，其中膠原酶的主要作用底物是纖維類膠原蛋白(即Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白)、明膠酶的主要作用底物是Ⅸ型膠原蛋白(參與結(jié)締組織代謝)[23]。Sun等[24]研究發(fā)現(xiàn)，與采用慢病毒介導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)2小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)治療的關(guān)節(jié)僵硬治療組大鼠相比，關(guān)節(jié)僵硬組大鼠的MMP-1和MMP-13表達(dá)顯著增加，由此認(rèn)為慢病毒介導(dǎo)ERK2-siRNA可在一定程度上減輕創(chuàng)傷后關(guān)節(jié)囊過度纖維化。

3.2.5組織形態(tài)變化 Chen等[25-26]研究發(fā)現(xiàn)，僵硬關(guān)節(jié)的主要病理改變?yōu)槔w維及滑膜組織增生或局部退變，部分纖維組織可出現(xiàn)增生伴玻璃樣變性，滑膜下纖維組織中可見血管增生。Watanabe等[27]用石膏將大鼠膝關(guān)節(jié)固定制備膝關(guān)節(jié)僵硬模型，并對(duì)不同固定時(shí)間的膝關(guān)節(jié)組織形態(tài)變化進(jìn)行了觀察：固定2周時(shí)，可見膝關(guān)節(jié)周圍脂肪組織萎縮；固定4周時(shí)，可見膝關(guān)節(jié)軟骨與鄰近組織粘連；固定16周時(shí)，可見脛骨和股骨與其臨近組織粘連；固定32周時(shí)，可見膝關(guān)節(jié)囊纖維化、關(guān)節(jié)腔變窄、關(guān)節(jié)及其周圍組織僵硬。Salib等[4]研究發(fā)現(xiàn)，與膝關(guān)節(jié)腔注射安慰劑組相比，膝關(guān)節(jié)腔注射塞來昔布可以改善關(guān)節(jié)僵硬組新西蘭白兔膝關(guān)節(jié)囊內(nèi)致密纖維結(jié)締組織。

4 小 結(jié)

制備一種有效且穩(wěn)定的膝關(guān)節(jié)僵硬實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，對(duì)人類認(rèn)識(shí)和防治膝關(guān)節(jié)僵硬具有重要價(jià)值。在所有膝關(guān)節(jié)僵硬類型中，以伸直型膝關(guān)節(jié)僵硬最為常見，因此應(yīng)積極探索該類型動(dòng)物模型的制備方法及相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)?？捎糜谠u(píng)價(jià)膝關(guān)節(jié)僵硬的指標(biāo)較多，除了肌成纖維細(xì)胞數(shù)量、TGF-β表達(dá)水平、Ⅰ型和Ⅲ型膠原含量、MMP表達(dá)水平及組織形態(tài)變化外，還包括結(jié)締組織生長(zhǎng)因子、腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-6及纖維連接蛋白表達(dá)水平等。