贛南臍橙致腐菌的分離鑒定及其對2-苯乙醇敏感性分析

熊大維 顧斌濤 劉蘭 黃筱萍

摘要?從采摘后貯存自然發(fā)病的贛南臍橙中分離出4種病原真菌，根據(jù)菌株形態(tài)學觀察和rDNA-ITS序列分析進行鑒定，這4種病原真菌分別為意大利青霉（Penicillium?italicum）、指狀青霉（Penicillium?digitatum）、柑橘鏈格孢（Alternaria?citri）和芽枝狀枝孢（Cladosporium?cladosporioides）。生物保鮮劑2-苯乙醇（2-PE）可有效地抑制這4種病原真菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長，但對不同致腐菌抑菌效果差異顯著（P<0.05）。2-PE對芽枝狀枝孢霉、指狀青霉菌、柑橘鏈格孢和意大利青霉菌菌絲生長的最小抑菌濃度分別為1.4、1.8、2.2和2.4?g/L。

關鍵詞?臍橙病原菌;形態(tài)學觀察;分子鑒定;2-苯乙醇;抑菌

中圖分類號?TS255.3文獻標識碼?A文章編號?0517-6611（2020）07-0186-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.07.053

Isolation?and?Identification?of?Citrus?Pathogens?from?Navel?Orange?in?Southern?Jiangxi?Province?and?Sensitivity?Analysis?to?2Phenylethanol?Alcohol

XIONG?Dawei，?GU?Bintao，?LIU?Lan?et?al

（Institution?of?Microbiology，?Jiangxi?Academy?of?Sciences，?Nanchang，?Jiangxi?330096）

Abstract?Four?citrus?pathogens?were?isolated?from?rotten?orange?of?Southern?Jiangxi?Province?after?harvesting.?According?to?the?observation?of?the?morphological?characteristics?of?fungi?and?the?analysis?of?rDNAITS?sequence，?the?four?citrus?pathogens?were?identified?as?Penicillium?italicum，?Penicillium?digitatum，?Alternaria?citri?and?Cladosporium?cladosporioides.?The?biopreservative?2phenylethyl?alcohol?can?effectively?inhibit?the?spore?germination?and?hyphae?growth?of?the?four?citrus?pathogens，?but?the?antibacterial?effects?of?different?saprophytic?fungi?were?significantly?different?（P<0.05）.?The?minimum?inhibitory?concentrations?for?the?hyphae?growth?of?C.?cladosporioides，?P.?digitatum，?A.?citri?and?P.?italicum?were?1.4，?1.8，?2.2?and?2.4?g/L，?respectively.

Key?words?Citrus?pathogens;Morphological?observation;Molecular?identification;2Phenylethanol?alcohol;Antibacterial

基金項目?江西省重點研發(fā)項目（S2018ZPYFE1016）;江西省科學院重大研究專項（2018-YZD1-03）。

作者簡介?熊大維（1975—），男，江西靖安人，助理研究員，從事微生物學研究。通信作者，研究員，碩士，從事生物工程及生物活性產(chǎn)物的制備和應用研究。

收稿日期?2019-10-09;修回日期?2019-10-28

近年來，我國柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，年產(chǎn)量超過2?900萬t，由于成熟度相對集中，其貯藏加工業(yè)的發(fā)展遠遠滯后于種植業(yè)，每年鮮果在采摘后貯藏、運輸和銷售環(huán)節(jié)的損失巨大，果品腐爛率為10%～40%[1-2]，造成重大的經(jīng)濟損失。引起柑橘腐爛的病害有20多種，其中約90%的柑橘采后腐爛是由意大利青霉引起的青霉病，指狀青霉引起的綠霉病和鏈格孢霉引起的黑腐病[3-7]。目前主要采用化學防腐劑進行防腐保鮮，由于存在病原菌對化學制劑易產(chǎn)生抗藥性，且對人體健康具有一定危害和造成環(huán)境污染，已被陸續(xù)禁止使用[8-9]。

2-苯乙醇（2-PE）是一種具有玫瑰氣味的芳香醇，廣泛存在于自然界中，具有廣泛的抗菌活性，可抑制大腸桿菌等G-菌和枯草芽孢、金黃色釀膿葡萄球菌等G+菌的生長，對酵母菌、青霉菌等真菌亦具有顯著的抑制作用[10-12]。其在食品防腐保鮮上的研究也已經(jīng)開展，劉普[13]研究表明生防菌檸檬形克勒克酵母菌對柑橘采后青、綠霉菌具有很好的防治效果，分離獲得對抑制真菌的有效成分為該菌產(chǎn)生的2-PE。方靜凡[14]發(fā)現(xiàn)2-PE對導致水果（如柑橘、蘋果、葡萄等）腐敗的許多真菌具有良好的防治效果，并對其最低抑菌濃度和抑菌機理進行了初步研究;采用產(chǎn)2-PE的酵母菌液涂抹，在果品上形成菌膜以達到生防效果。陳利軍等[15]發(fā)現(xiàn)2-PE對植物病原真菌如草莓灰霉病菌、白菜黑斑病菌等具有顯著的抑菌效果。

該研究從自然腐爛的臍橙中分離獲得4種致腐真菌，通過形態(tài)學觀察和分子學鑒定，確定了其種、屬。針對這些致腐真菌，采用生物法轉化合成的2-PE進行了抑菌試驗，確定了2-PE對不同真菌的孢子萌發(fā)最小抑菌濃度（MIC）和菌絲生長最小抑菌濃度。由于2-PE具有較好的水溶性和穩(wěn)定性，安全無毒，對真菌有較好的抑制作用，可開發(fā)為一種新型的生物防腐劑用于果蔬、食品的保鮮，為今后的植物病原菌的抑菌試驗和抑菌機制研究提供基礎。

1?材料與方法

1.1?材料與儀器

臍橙摘自贛州（信豐縣和安遠縣）不同果園，置通風處保存。2-PE粗提液，是由本實驗室生物轉化液經(jīng)乙醇抽提濃縮而成的質量分數(shù)為80%～90%粗制品[16];馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato?dextrose?agar，PDA）培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術有限責任公司。

BX53型顯微鏡（日本Olympus公司）;Prachfum?224-1CN分析天平（德國Sartorius公司）;L204電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）股份有限公司）;MJX-250B-Z霉菌培養(yǎng)箱（上海博迅醫(yī)療生物儀器有限公司）;CD-AX數(shù)顯式游標卡尺（世達工具（中國）有限公司）;SW-CJ-ID型雙人凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）;LDZX-50KBS手輪型立式蒸汽滅菌鍋（上海申安儀表有限公司）。

1.2?方法

1.2.1?菌種分離純化與鑒定。選擇具有典型發(fā)病癥狀的臍橙，用75%乙醇清洗患處表面，再用無菌刀片切取病患交界處5?mm×5?mm的組織，用2%NaClO溶液表面消毒，無菌水沖洗3次，接入PDA平板培養(yǎng)基上，于（28±0.5）℃倒置培養(yǎng)，待菌絲長出后，用無菌接種針挑取前緣菌絲植入另一培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，重復上述操作3次即可獲得純化菌株。

1.2.2?真菌種屬鑒定。

1.2.2.1?病原真菌形態(tài)學鑒定。通過觀察病原體菌落特征和培養(yǎng)特佂，包括菌落大小、顏色、邊緣、滲出物等，在顯微鏡下觀察菌絲生長情況、孢子形態(tài)、產(chǎn)孢結構及有無橫隔的特征，進而進行顯微形態(tài)分類鑒定。參照真菌鑒定手冊進行病原菌的初步鑒定[17]。

1.2.2.2?病原真菌的rDNA-ITS序列分析。

采用rDNA-ITS分子鑒定法對病原菌株進行分析。以不同病原菌的DNA作為模板，用通用引物擴增出約550?bp的rDNA-ITS序列，PCR反應條件：預變性94?℃?3?min;變性95?℃?1?min，退火54?℃?40?s，延伸72?℃?40?s，35個循環(huán);終延伸72?℃?10?min，保溫4?℃?60?min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，于上海生物工程有限公司完成測序。將測序獲得rDNA-ITS序列在GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中進行Blast搜索比對。

1.2.3?2-PE對病原真菌孢子萌發(fā)率的影響。將4種病原菌株分別于PDA斜面培養(yǎng)基中28?℃培養(yǎng)6?d，分別加入10?mL無菌水，用玻璃棒洗下孢子，菌液再分別倒入20?mL注射器中，經(jīng)4層無菌紗布過濾，收集孢子液，于4?℃冰箱貯存?zhèn)溆?。用血球計?shù)器計數(shù)孢子濃度，稀釋孢子液為10-4和10-5，涂布于含2-PE分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2?g/L的培養(yǎng)基中，以不加2-PE的平皿為對照，每個梯度涂布3皿，于28?℃培養(yǎng)3～6?d，計算孢子萌發(fā)率。

孢子萌發(fā)率（%）=處理平皿中菌落數(shù)對照平皿中菌落數(shù)×100（1）

1.2.4?菌絲生長抑制率的測定（采用菌絲生長速率測定法）。將4種病原菌孢子液分別涂布于PDA平皿中，于28?℃培養(yǎng)6～7?d，用打孔器在培養(yǎng)基上打孔，取生長一致的菌苔，備用。配制含2-PE濃度為0.4、0.8、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4?g/L的培養(yǎng)基，用量杯量取等量體積倒入平皿中，用￠5?mm打孔器切取生長一致的病原菌菌塊，移植于含藥劑的平皿中，每塊平皿植入3塊菌苔做平行試驗，另設加無菌水的PDA培養(yǎng)基平板作為對照。置于28?℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用游標卡尺測量菌落直徑，取?120?h的菌落平均值計算菌絲生長抑制率，測定2-PE對病原菌的抑菌率[18]。

菌絲生長抑制率（%）=對照菌落直徑-處理菌落直徑對照菌落直徑-菌餅直徑×100（2）

2?結果與分析

2.1?病原真菌的形態(tài)學鑒定

在真菌識別中，有形態(tài)學識別，如菌落形態(tài)、顏色、在不同時間的生長狀態(tài)、菌絲及孢子的形態(tài)及大小等。從自然腐爛的臍橙中分離出4種真菌，分別編號為FZ-1、FZ-2、FZ-3和FZ-4，菌落形態(tài)及孢子生長描述如下。

2.1.1?FZ-1菌株。菌株在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)2?d后，菌落表面平整呈白色，少許菌落中間略微凸起并附有青綠色孢子，菌落稀疏蓬松;培養(yǎng)3?d后，菌落表面仍平整，表面呈青綠色，邊緣呈白色，表面附有青綠色孢子，菌落稀疏蓬松。菌絲體由分枝的、分隔的、光滑的、透明至半透明的菌絲構成，菌絲2.7～6.0?μm寬。分生孢子梗與菌絲異形或同形，單菌絲構成，透明至半透明，光滑，薄壁，有分隔，分枝或不分枝，圓柱形，3.3～9.0?μm寬。產(chǎn)孢細胞單點芽植型產(chǎn)孢，（14.0～26.0）?μm×（3.0～4.2）μm，輪生，每輪2～4個倒棒狀或近圓柱形的產(chǎn)孢細胞，頂部變細，中間略膨大，基部平截，透明，頂生或側生，光滑。分生孢子全壁芽植型，單生，孢子呈鏈狀向上生長，質地干，未成熟時透明，成熟后半透明至淡灰黑褐色，光滑，壁薄，基部平截，頂部圓滑，無隔膜，部分近球形至球形，橢球形或倒卵形（5.0～12.5）μm×（4.2～10.1）μm（=7.8?μm×6.0?μm，n=45）;部分近圓柱形（8.4～24.0）?μm×?（2.8～5.5）μm（=15.0?μm×4.3?μm，n=35）;分生孢子裂解式脫落。還有一部分非常小的分生孢子，近球形或橢球形至球形（3.2～6.0）μm×（2.8～4.3）μm（=?4.2?μm×3.3?μm，n=45）。圖1為FZ-1的菌落形態(tài)及菌絲和孢子生長狀態(tài)。

2.1.2?FZ-2菌株。菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)2?d后，菌落表面凸起呈灰色，邊緣菌絲呈白色，表面附有灰色的孢子，菌落濃密緊湊;培養(yǎng)3?d后，菌落表面仍凸起且顏色加深，邊緣菌絲呈白色，表面附著大量的孢子，菌落濃密緊湊。菌絲體由分枝的、分隔的、光滑的、透明至淡灰褐色的菌絲構成，菌絲2～4?μm寬。分生孢子梗與菌絲異形或同形，單菌絲構成，半透明或淺褐色至中褐色，光滑，薄壁，有分隔，分枝或不分枝，圓柱形至近杯狀，3～4?μm寬。產(chǎn)孢細胞多點芽植型產(chǎn)孢，半透明至淺褐色，與分生孢子梗整合，光滑，（9.0～28.0）?μm×（2.5～5.0）μm（=?12.7?μm×?3.7?μm，n=20），內(nèi)部有細小油滴。分生孢子全壁芽植型，多生，孢子呈鏈狀向上生長，質地干，透明至淺褐色，近球形至球形，橢球狀到近紡錘形或倒卵形，部分近圓柱形，基部和頂部平截，最頂端孢子基部平截，頂部圓滑，0-1（-2）隔，光滑，壁薄，（3.8～11.0）×（2.6～4.5）μm（=?6.8?μm×3.4?μm，n=50）;分生孢子裂解式脫落（圖2）。

2.1.3?FZ-3菌株。菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)2?d后，菌落濃密不緊湊，表面灰白色至淺褐色，表面菌絲清晰可見，菌絲較分散，菌落中央無凸起，邊緣菌絲呈白色;培養(yǎng)3?d后，菌落濃密不緊湊，顏色呈灰白色至深褐色，培養(yǎng)基反面深褐色至黑色。菌絲體堆在一起褐色;菌絲分枝，具隔膜，半透明至深褐色，表面光滑，壁薄，寬2.5～6.4?μm（3.8?μm，n=40）。分生孢子梗寬2.2～5.3?μm（3.9?μm，n=25），頂端產(chǎn)孢，表面光滑，褐色至中褐色。產(chǎn)孢細胞圓柱形，淺褐色至褐色，在分生孢子梗的頂端。分生孢子單生，頂生，（15.0～36.0）?μm×（8.0～15.2）μm（23.6?μm×11.3?μm，n=40），基部平截2.4～4.5?μm（3.5?μm，n=40），隔膜網(wǎng)格狀，具橫隔膜和縱隔膜，橫膈膜較多1～6個隔膜，縱隔膜一般1個，分孢子呈卵形、紡錘形，棍棒狀、球形至橢球形，淺褐色至中褐色，表面光滑，壁?。▓D3）。

2.1.4

FZ-4?菌株。菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)2?d后，菌落濃密緊湊，表面灰白色，菌落中央凸起呈灰白色，邊緣菌絲呈白色;培養(yǎng)3?d后，菌落表面呈灰白色至淺青色，菌落濃密，表面可見灰白色孢子，培養(yǎng)基反面棕黃色。菌絲分枝，具隔膜，透明至淺色，表面光滑，壁薄。分生孢子梗寬2.6～4.5?μm（3.5?μm，n=20），表面光滑，透明至淺色，產(chǎn)孢細胞頂端集中呈掃帚狀。產(chǎn)孢細胞頂生，燒瓶形瓶梗，（8.0～25.0）μm×（2.0～3.0）μm（16.1?μm×?2.6?μm，n=20），透明，壁薄，基部寬頂部窄。分生孢子頂生，數(shù)量非常多，散射狀，（2.8～7.6）μm×（2.05～4.8）μm（4.55?μm×?2.88?μm，n=70），無隔膜，球形、橢球形至長橢球形，淺褐色至透明，表面光滑，壁?。▓D4）。

2.2?病原真菌的分子學鑒定

利用18S和28S的上下游引物序列，得到以上4種病原菌菌株的序列結果（表1），與NCBI?Blast?上的已知序列進行比對，以確定病原真菌種或亞種。

由表1可知，利用rDNA-ITS鑒定4種臍橙病原真菌分別如下：FZ-1為指狀青霉（Penicillium?digitatum），F(xiàn)Z-2為芽枝狀枝孢霉（Cladosporium?cladosporioides），F(xiàn)Z-3為柑橘鏈格孢（Alternaria?citri），F(xiàn)Z-4為意大利青霉（Penicillium?italicum），與各自源物種的同源性均達100%。

2.3?不同質量濃度的2-PE對4種病原真菌孢子萌發(fā)率的影響

2-PE對細胞具有一定的毒性，其抑菌作用主要是通過增加細胞膜的通透性而擾亂跨膜質子電勢，以及作為大分子合成的抑制劑抑制細胞內(nèi)蛋白質和RNA的合成。不同的微生物對2-PE的耐受性不同，通常質量濃度為0～2?g/L的2-PE可抑制大部分微生物生長，當質量濃度達4?g/L可完全抑制酵母菌生長[19]。由表2可知，2-PE對4種病原菌孢子萌發(fā)均有顯著（P<0.05）的抑制效果，在濃度為0.6?g/L時可全部抑制柑橘鏈格孢和芽枝狀枝孢霉的孢子萌發(fā)，對指狀青霉和意大利青霉的最低孢子萌發(fā)抑制濃度分別為0.8和1.2?g/L，2-PE對意大利青霉的孢子萌發(fā)率抑制效果較弱。

2.4?不同質量濃度的2-PE對4種病原真菌的抑菌效果

2-PE對柑橘致腐菌均有很好的抑菌作用（表3）。在一定質量濃度下，2-PE對芽枝狀枝孢霉的抑制效果最好，其次為指狀青霉和柑橘鏈格孢，對意大利青霉的抑制效果相對較弱。其最小抑菌濃度（MIC）分別為1.4、1.8、2.2、2.4?g/L，即2-PE濃度達2.4?g/L時，可完全抑制4種病原菌菌絲的生長。方靜凡[14]采用2-PE對多種果實病原真菌的抑菌譜進行檢測，2-PE濃度為0.2%～0.4%（V/V）時可完全抑制柑橘綠霉菌、黑腐菌、炭疽菌，蘋果青霉菌和灰霉菌等多種致腐真菌的生長，對意大利青霉菌B3的最小抑菌濃度MIC為0.25%（V/V）。

3?結論

從不同地區(qū)自然腐爛的臍橙中分離純化出4種病原真菌，通過觀察菌落形態(tài)，菌絲生長，分生孢子形狀、大小及分生孢子梗形態(tài)等對其進行鑒定，由于真菌生長條件改變，菌絲的生長形態(tài)會有改變、厚垣孢子難形成和觀察，分生孢子在形態(tài)學上差異小，對菌絲、孢子的描述困難，較難區(qū)分多種菌株之間的差異。隨著分子生物學技術的發(fā)展，rDNA-ITS被廣泛應用于果蔬類采后病原菌的分離和鑒定[20-22]。通過18S?rDNA測序以及在GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對，結果表明這4種柑橘致腐菌分別為意大利青霉、指狀青霉、柑橘鏈格孢和芽枝狀枝孢霉。其中意大利青霉、指狀青霉和柑橘連格孢為引起柑橘采后腐爛的主要病原真菌。利用分子學技術進行輔助鑒定，可以鑒定出親緣關系較近的種、屬。

2-苯乙醇對柑橘致腐菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長均有較強的抑制效果，2-PE可在較低的質量濃度下完全抑制真菌孢子萌發(fā)，相較于酵母菌和真菌菌絲，真菌孢子對2-PE具有更高的敏感性，可能是孢子在萌發(fā)過程中蛋白質和RNA的合成更易受到2-PE的抑制。在相同的質量濃度下，2-PE抑制4種病原真菌孢子萌發(fā)的強弱順序依次為芽枝狀枝孢、柑橘鏈格孢、指狀青霉、意大利青霉，濃度為1.2?g/L時可完全抑制病原菌孢子的萌發(fā)。而在相同的質量濃度下，2-PE對芽枝狀枝孢霉菌生長的抑菌效果最強，其次為指狀青霉、柑橘鏈格孢，對意大利青霉抑菌較弱，在濃度為2.4?g/L時可完全抑制4種病原真菌的生長。該研究從采后腐爛的贛南臍橙中分離出主要的致腐真菌，并采用生物轉化的2-PE進行了抑菌效果評價，為進一步開發(fā)新型果蔬保鮮生物保鮮劑2-PE奠定了基礎。

參考文獻

[1]?LADANIYA?M?S.2Commercial?fresh?citrus?cultivars?and?producing?countries：Citrus?fruit[M].2rd?ed.San?Diego：Academic?Press，2008：13-65.

[2]?劉浩強，李鴻筠，向可海，等.保鮮劑對柑橘貯藏病菌的敏感性及貯藏保鮮效果[J].食品科學，2014，35（4）：210-214.

[3]?TALIBI?I，BOUBAKER?H，BOUDYACH?E?H，et?al.Alternative?methods?for?the?control?of?postharvest?citrus?disease[J].Journal?of?applied?microbiology，2014，117（1）：1-17.

[4]?萬春鵬，陳楚英，陳明，等.肉桂提取物對贛南臍橙的保鮮效果[J].食品工業(yè)科技，2015，36（17）：317-321.

[5]?楊文俠，鄧利珍，周亮，等.植物提取液對臍橙致腐青霉菌的抑菌研究[J].食品科技，2013，38（12）：238-241.

[6]?張?zhí)m，李節(jié)法，陳東奎，等.柑桔采后病害新型生物防控保鮮劑研究進展[J].廣西農(nóng)學報，2016，31（5）：59-63.

[7]?張良，劉媛潔，肖勇生，等.響應面法優(yōu)化柑橘復合生物保鮮劑配方[J].食品工業(yè)科技，2016，37（16）：340-345，356.

[8]?熊亞波，閆曉俊，顏靜，等.新型柑橘貯藏保鮮劑的研究進展[J].食品科學，2015，36（9）：284-288.

[9]?鄧雨艷，曾凱芳.柑橘果實采后侵染性病害防治技術研究進展[J].食品科技，2008，33（4）：211-214.

[10]?苗瀟瀟.玫瑰花露香氣成分分析及其抑菌作用的初探[D].太原：山西大學，2017：39-48.

[11]?王軍喜，趙文紅，韓珍，等.玫瑰露抑菌效果研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學，2012（3）：79-80，90.

[12]?鄧雨艷，曾凱芳.柑橘果實采后侵染性病害防治技術研究進展[J].食品科技，2008，33（4）：211-214.

[13]?劉普.柑橘采后生防菌檸檬形克勒克酵母（34-9）產(chǎn)生的活性物質及其他抑菌機制的研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學，2011：43-52.

[14]?方靜凡.苯乙醇對柑橘青霉及生防菌34-9的作用研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學，2013：21-25.

[15]?陳利軍，王國君，田雪亮，等.產(chǎn)香真菌ZY-2菌株鑒定及其揮發(fā)性物質抑菌活性測定與組分分析[J].南方農(nóng)業(yè)學報，2013，44（11）：1818-1822.

[16]?黃筱萍，劉蘭，熊大維，等.酵母靜息細胞耦合原位分離技術連續(xù)轉化2-苯乙醇?[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2018，44（10）：20-24.

[17]?魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上海科學技術出版社，1979.

[18]?劉浩強，李鴻筠，向可海，等.保鮮劑對柑橘貯藏病菌的敏感性及貯藏保鮮效果[J].食品科學，2014，35（4）：210-214.

[19]?梅建鳳.利用酶母細胞生物轉化法合成天然2-苯乙醇的研究[D].杭州：浙江大學，2009：15-39.

[20]?YANG?L?Z，ZHOU?L，YU?H，et?al.Isolation?and?identification?and?antifungal?activity?of?a?Penicillum[J].Acta?agriculture?boreali?occidentalis?sinica，2009，18（4）：98-102.

[21]?YU?T，LI?H?Y，ZHENG?X?D.Synergistic?effect?of?chitosan?and?Cryptococcus?laurentii?on?inhibition?of?Penicillus?expansum?infections[J].International?journal?of?food?microbiology，2007，114（3）：261-266.

[22]?張翠香，李娜，李倩，等.柑橘青霉菌的分離鑒定與特性分析[J].華中師范大學學報（自然科學版），2014，48（1）：86-90.