載脂蛋白E在膿毒癥中抗炎作用的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)觀察

趙田，邵義明

1廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東湛江524001；2廣東醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院；3湛江市器官功能損傷與保護(hù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

膿毒癥是機(jī)體對(duì)感染反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致的器官功能障礙[1]，病死率可達(dá)25%，合并休克的膿毒癥患者病死率超過80%[2，3]。有效遏制膿毒癥的發(fā)生發(fā)展有助于降低病死率。載脂蛋白E(ApoE)是乳糜蛋白、極低密度脂蛋白(VLDL)、中間密度脂蛋白(IDL)和高密度脂蛋白(HDL)等血漿脂蛋白的主要結(jié)構(gòu)成分，在這些脂蛋白的代謝中起著重要作用[4]。ApoE與許多炎癥有關(guān)疾病密切相關(guān)，如2型糖尿病[5]、心血管疾病[6]、阿爾茨海默病[7]等。目前對(duì)于ApoE與膿毒癥的文獻(xiàn)報(bào)道很少。2018年3月～2019年7月，本研究構(gòu)建了細(xì)胞膿毒癥模型和動(dòng)物膿毒癥模型，觀察ApoE對(duì)膿毒癥細(xì)胞及小鼠的抗炎作用，為膿毒癥的治療提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞與其他材料 SPF級(jí)健康的野生型小鼠(WT，8～12周，雄性)和ApoE敲除小鼠(ApoE-/-，8～12周，雄性)各14只，體質(zhì)量20～25 g。小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞RAW264.7在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱生存，在添加10%胎牛血清和青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，每2 d傳代1次。LPS購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。ApoE購(gòu)自美國(guó)Peprotech公司。

1.2 ApoE對(duì)膿毒癥的體外抗炎作用觀察

1.2.1 細(xì)胞分組與模型制作 將RAW264.7細(xì)胞分為對(duì)照組、ApoE組、LPS組、LPS+ApoE組。對(duì)照組不做特殊處理。ApoE組加入5 μg/mL的ApoE。LPS組加入1 μg/mL的LPS。LPS+ApoE組先加入1 μg/mL的LPS，6 h后加入5 μg/mL的ApoE。

1.2.2 培養(yǎng)液上清炎癥因子檢測(cè) 各組處理24 h后吸取細(xì)胞培養(yǎng)液上清，采用ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-6、IL-1β。所有檢測(cè)均需重復(fù)3次，取平均值。

1.3 ApoE對(duì)膿毒癥的體內(nèi)抗炎作用觀察

1.3.1 小鼠分組與模型制作 將WT小鼠分為WT組、WT+LPS組，將ApoE-/-小鼠分為ApoE-/-組、ApoE-/-+LPS組，每組各7只。WT組、ApoE-/-組不做特殊處理。WT+LPS組、ApoE-/-+LPS組采用腹腔注射10 mg/kg LPS制作膿毒癥模型。

1.3.2 血清炎癥因子檢測(cè) 造模后1 h通過眼球取靜脈血，3 000 r/min離心10 min，獲取血清，采用ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-6、IL-1β。

1.3.3 生存情況觀察 造模后72 h觀察各組小鼠生存情況。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清炎癥因子水平比較 見表1。

表1 各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清炎癥因子水平比較

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與LPS組相比，#P<0.05。

2.2 各組小鼠血清炎癥因子水平比較 見表2。

表2 各組小鼠血清炎癥因子水平比較

注：與WT組相比，*P<0.01；與ApoE-/-組相比，#P<0.01；與WT+LPS組相比，△P<0.05。

2.3 各組小鼠生存情況比較 ApoE-/-+LPS組小鼠造模后24 h內(nèi)全部死亡，WT+LPS組小鼠造模后72 h仍有2只存活(Log-Rank=0.002，P=0.96)。

3 討論

膿毒癥是細(xì)菌入血后，短時(shí)間內(nèi)釋放大量LPS導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)，這些炎癥介質(zhì)直接作用于機(jī)體，使機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，炎癥反應(yīng)過于強(qiáng)烈會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的心血管系統(tǒng)、腎臟、肝臟等多種器官功能障礙，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡[8，9]。對(duì)膿毒癥患者早期實(shí)行干預(yù)能進(jìn)一步阻斷病情發(fā)展，改善患者預(yù)后。近年研究表明，ApoE不僅能結(jié)合和運(yùn)輸血脂到機(jī)體各組織進(jìn)行代謝[10]，還具有抗炎活性和免疫調(diào)節(jié)功能。ApoE可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞吞噬功能，抑制T細(xì)胞增殖[11]，促進(jìn)CD1分子向自然殺傷T(NKT)細(xì)胞呈遞脂質(zhì)抗原，同時(shí)在細(xì)胞水平上提出了ApoE介導(dǎo)的NKT細(xì)胞活化模型，可以促使NKT細(xì)胞活化[12，13]。

為進(jìn)一步了解ApoE與膿毒癥的關(guān)系，我們分別在RAW264.7細(xì)胞和小鼠水平上進(jìn)行膿毒癥造模，觀察ApoE對(duì)炎癥因子表達(dá)的影響，同時(shí)觀察注射ApoE后小鼠72 h生存狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，LPS組TNF-α、IL-6、IL-1β水平高于對(duì)照組，LPS+ApoE組IL-6水平低于LPS組，提示ApoE可以抑制炎癥因子表達(dá)。也有體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LPS可通過激活Toll樣受體，促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子，炎癥因子又可以通過激活細(xì)胞內(nèi)MAPK和PI3K/AKT等信號(hào)通路抑制ApoE的合成[14]。動(dòng)物水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，WT+LPS組血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平高于WT組;ApoE-/-+LPS組血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平高于ApoE-/-組；ApoE-/-+LPS組血清IL-6水平高于WT+LPS組；ApoE-/-+LPS組小鼠造模后24 h內(nèi)全部死亡，WT+LPS組小鼠造模后72 h仍有2只存活。這進(jìn)一步表明ApoE在膿毒癥中起到了抗炎作用。先前研究表明，與野生型小鼠相比，ApoE敲除小鼠血清TNF-α表達(dá)水平升高，并且對(duì)內(nèi)毒素和念珠菌感染敏感性增加[15]，小鼠死亡率增加，與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。上述研究結(jié)果都表明ApoE在膿毒癥中發(fā)揮抗炎作用。

研究表明，ApoE還可通過增加單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中miRNA-146a表達(dá)，抑制NB-κB介導(dǎo)的炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化[16]。我們推測(cè)ApoE在膿毒癥中的抗炎作用可能也與增加單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞miRNA-146a水平、抑制NB-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有關(guān)。同時(shí)，ApoE是一個(gè)多態(tài)性蛋白，有3種亞型，即ApoE2、ApoE3和ApoE4[17]。在神經(jīng)相關(guān)性疾病中，ApoE3主要發(fā)揮保護(hù)作用[18]，ApoE4則是危險(xiǎn)因子[19，20]。推測(cè)ApoE發(fā)揮保護(hù)作用可能與ApoE3的功能有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。