慢性乙型肝炎患者血清鐵調(diào)素和鐵代謝指標(biāo)及體外HBV轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞鐵調(diào)素水平變化*

王兆飛，管世鶴，陳禮文，王 琴，楊 凱，張 浩，候舒文，潘正蘭，段元麗

鐵調(diào)素(hepcidin,Hepc)是一種由肝臟合成并分泌的生物活性多肽，也是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一具有負(fù)性調(diào)鐵作用的生物素[1]。目前，相關(guān)鐵代謝與慢性病毒性肝炎的研究主要集中在丙型肝炎[2，3],而對(duì)乙型肝炎病毒(HBV)感染者體內(nèi)鐵調(diào)素與鐵代謝變化規(guī)律的研究仍存在爭(zhēng)議。為探究CHB患者血清鐵調(diào)素和鐵代謝指標(biāo)變化的臨床價(jià)值，我們比較了CHB患者與健康體檢者血清鐵調(diào)素和鐵代謝指標(biāo)的變化，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 2017年4月～9月安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院治療的慢性乙型肝炎患者71例，男性39例，女性32例；年齡為(36.83±10.08)歲。診斷符合2015年頒布的《慢性乙型肝炎防治指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)，所有患者均未接受過(guò)干擾素治療。排除標(biāo)準(zhǔn): 合并其他病毒性肝炎、肝癌 、遺傳性 、缺鐵性疾病或既往有鐵代謝紊亂疾病的HBV感染者。另選24例健康體檢者，男、女各12例，平均年齡為(35.70±13.24)歲作為對(duì)照，經(jīng)檢測(cè)排除各類肝炎的存在，無(wú)心、肝、肺、腎等疾病?；颊呓M與健康健康人在年齡和性別方面差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 檢測(cè)方法 使用全自動(dòng)生化分析儀(Dimension EXL with LM，德國(guó)西門子公司)檢測(cè)生化指標(biāo)；使用全自動(dòng)蛋白分析儀(BN ProSpec,德國(guó)西門子公司)檢測(cè)鐵代謝指標(biāo)【血清鐵(SI)、鐵蛋白(Ferr)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)】；采用ELISA法檢測(cè)血清Hepc(武漢基因美生物公司，美國(guó)伯騰儀器有限公司生產(chǎn)的SynergyH4酶標(biāo)儀，在475nm波長(zhǎng)下讀取OD值，并計(jì)算鐵調(diào)素水平)；使用電化學(xué)發(fā)光全自動(dòng)免疫分析儀(Cobas e 601,瑞士羅氏公司)檢測(cè)血清IL-6；采用熒光定量PCR法測(cè)定血清HBV DNA水平(上海復(fù)星醫(yī)藥核酸提取試劑盒，Agilent Stratagene，California，USA)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 以含有100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、10%胎牛血清的DMEM對(duì)Huh7細(xì)胞(上海富亨細(xì)胞庫(kù))在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于 6孔板，調(diào)整每孔細(xì)胞數(shù)約為1×106。取具備乙型肝炎病毒全基因組的pC1.3質(zhì)粒1.8 μg，混合脂質(zhì)載體(Thermo Scientific，USA) 2μL，靜置20 min，轉(zhuǎn)染接種于6孔板24 h，培養(yǎng)Huh7細(xì)胞，達(dá)到80%融合；以等量的空載質(zhì)粒(pBlue-ks)轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，作為空白對(duì)照，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，換液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h。

1.4 細(xì)胞鐵調(diào)素mRNA水平檢測(cè) 采用RT-qPCR法，在6孔板，分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h和48 h，用TRIzol(Thermo Scientific，USA)提取肝細(xì)胞總RNA。測(cè)量RNA樣品的純度后，根據(jù)操作說(shuō)明，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Thermo Scientific，USA)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用cDNA作為模板，采用PCR法擴(kuò)增鐵調(diào)素基因，引物序列 F: ATGTTCCAGAGGCGAAGGAG，R: CTACGTCTTGCAGCACATCC；選擇β-actin(引物序列F:GGGAAATCGTGCGTGACATTAAGG， R:CAGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG)作為參考基因。使用Agilent Stratagene M×3000P熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定。靶基因引物由安徽欣樂(lè)生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成。

1.5 細(xì)胞鐵調(diào)素蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法，在6孔板轉(zhuǎn)染48 h，使用裂解緩沖液制備全細(xì)胞蛋白裂解物。采用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。隨后，加入緩沖液到全細(xì)胞蛋白裂解物中(緩沖液與裂解物體積為1：4)。然后，100℃煮沸10 min，使用10%～15%SDS-PAGE電泳分離20 μg總蛋白，并轉(zhuǎn)移到聚二氟乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h。將膜洗滌3次，分別加抗人鐵調(diào)素抗體(Abcam，UK)和抗人β-actin抗體(Abcam，UK)，在4℃溫育過(guò)夜。洗滌后，將膜與1：5000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的抗小鼠或抗兔二抗(北京中山金橋)在室溫下孵育1 h，洗滌。采用化學(xué)發(fā)光法使蛋白條帶可視化，用顯影儀對(duì)顯影蛋白條帶圖進(jìn)行拍照保存，以并β-actin為內(nèi)參，應(yīng)用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，重復(fù)檢測(cè)3次。

2 結(jié)果

2.1 CHB患者與健康人血清學(xué)指標(biāo)比較 與健康人比， CHB患者血清SI、Ferr、ALT、AST、TBIL和IL-6水平顯著升高，而血清Hepc、Tf、sTfR和ALB水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

2.2 不同炎癥活動(dòng)度CHB患者鐵代謝及鐵調(diào)素水平比較 肝組織中度炎癥活動(dòng)組患者血清SI和Ferr水平顯著高于，血清Hepc顯著低于輕度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；重度炎癥活動(dòng)組血清SI和Ferr水平顯著高于，而血清Tf和Hepc水平顯著低于輕中度活動(dòng)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表2 不同肝組織炎癥活動(dòng)CHB患者鐵調(diào)素和鐵代謝指標(biāo)【 M(interquartile range)】比較

與輕度炎癥活動(dòng)組比，①P<0.05；與中度炎癥活動(dòng)組比，②P<0.05

2.3 HBV感染細(xì)胞鐵調(diào)素水平變化 在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞24 h和48 h后，Hepc mRNA相對(duì)水平為(5.21±0.43)，較空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的(0.73±0.14)顯著升高；在48 h，病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞Hepc mRNA水平為(8.45±0.61)，較空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的(1.16±0.17)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)；轉(zhuǎn)染質(zhì)粒48 h后，轉(zhuǎn)染病毒組細(xì)胞hepc蛋白相對(duì)表達(dá)量較空白組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

圖1 轉(zhuǎn)染細(xì)胞Hepcidin mRNA水平

圖2 轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞Hepcidin蛋白相對(duì)表達(dá)量

3 討論

已有文獻(xiàn)報(bào)道CHB患者體內(nèi)存在不同程度的鐵代謝紊亂[4]。據(jù)本研究結(jié)果顯示隨著CHB患者肝組織炎癥活動(dòng)度加重，患者體內(nèi)鐵超載進(jìn)行性加重，有關(guān)報(bào)道[5，6]研究結(jié)果一致。故檢測(cè)血清鐵調(diào)素水平及鐵代謝相關(guān)指標(biāo)有助于評(píng)估CHB患者的病情進(jìn)展。

HBV DNA載量多用于確定感染性、判斷治療指征、確定耐藥性的出現(xiàn)以及診斷隱匿性HBV感染[7]。ALB和TBIL是體現(xiàn)肝臟合成與轉(zhuǎn)化能力的指標(biāo)[8]。本研究結(jié)果顯示病毒復(fù)制及肝臟合成功能降低與血清鐵調(diào)素水平降低顯著相關(guān)。然而，在我們構(gòu)建的HBV感染肝細(xì)胞模型中，通過(guò)檢測(cè)Hepc mRNA及其蛋白的相對(duì)表達(dá)情況，我們發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞感染HBV后鐵調(diào)素水平顯著升高，此結(jié)果與本研究中發(fā)現(xiàn)的CHB患者血清鐵調(diào)素顯著降低相矛盾。我們?cè)隗w外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了HBV感染可刺激鐵調(diào)素的表達(dá)。既往研究證明HBV感染本身并不會(huì)引起肝細(xì)胞損傷，而是由HBV感染引起的宿主炎癥反應(yīng)和T細(xì)胞免疫應(yīng)答所致[9]。所以，體外HBV感染肝細(xì)胞后細(xì)胞損傷程度遠(yuǎn)低于體內(nèi)，大量的肝細(xì)胞損傷會(huì)引起肝臟合成能力的降低。血清鐵調(diào)素與血清白蛋白的合成有關(guān)，說(shuō)明在HBV感染過(guò)程中體內(nèi)大量肝細(xì)胞損傷引起了肝臟對(duì)鐵調(diào)素合成能力的下降。此外，本研究CHB患者血清IL-6水平升高而鐵調(diào)素水平減低，顯示正向調(diào)控鐵調(diào)素的細(xì)胞因子IL-6的升高并沒(méi)有引起體內(nèi)鐵調(diào)素的升高，反而出現(xiàn)體內(nèi)鐵調(diào)素水平的減低。這是由于HBV復(fù)制引起的免疫反應(yīng)干擾了體內(nèi)復(fù)雜細(xì)胞因子及信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的正常功能[10]，包括STAT3和BMP/SMAD在內(nèi)共同調(diào)控鐵調(diào)素表達(dá)的多種信號(hào)通路受到了影響?？傊覀冋J(rèn)為在體內(nèi)鐵調(diào)素表達(dá)的正調(diào)節(jié)因子作用可能被負(fù)調(diào)節(jié)因子作用所掩蓋，但具體機(jī)制仍有待探索。經(jīng)以上分析我們推測(cè)HBV感染者體內(nèi)鐵調(diào)素表達(dá)降低為患者體內(nèi)鐵超載的重要原因之一【11-15】。

我們的研究證明了檢測(cè)鐵調(diào)素及其鐵代謝相關(guān)指標(biāo)有助于評(píng)估慢性乙型肝炎患者病情進(jìn)展，并推測(cè)出鐵調(diào)素持續(xù)低水平為導(dǎo)致CHB患者肝內(nèi)鐵超載的重要原因之一。對(duì)于CHB相關(guān)鐵超載適當(dāng)?shù)娜ヨF治療至關(guān)重要。目前，靜脈切開術(shù)和去鐵胺輸注已用于臨床治療鐵超載。然而，這兩種方案存在諸多不良反應(yīng)。我們的研究結(jié)果提示提高血清鐵調(diào)素水平可以用于HBV感染相關(guān)鐵超載的去鐵治療。但人工合成鐵調(diào)素不僅價(jià)格昂貴且具有一定的藥理學(xué)性質(zhì)成分不宜藥用，近期研究發(fā)現(xiàn)使用合成的minihepcidins已經(jīng)避免了這些問(wèn)題[16-19]。此外，還可以通過(guò)增強(qiáng)內(nèi)源性鐵調(diào)素的產(chǎn)生來(lái)提高血清鐵調(diào)素水平。目前，已報(bào)道的內(nèi)源性激活鐵調(diào)素表達(dá)的治療策略有TMPRSS6失活劑[13]和BMP6激動(dòng)劑[14]兩種?？傊?，我們不僅可以通過(guò)檢測(cè)鐵調(diào)素及其鐵代謝相關(guān)指標(biāo)幫助評(píng)估慢性乙型肝炎患者病情進(jìn)展，而且適當(dāng)予以鐵調(diào)素或者其相應(yīng)內(nèi)源性激活劑可針對(duì)性地治療CHB患者相關(guān)鐵超載問(wèn)題，從而延緩病情進(jìn)展。