三葉青提取物對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的影響及作用機(jī)制研究

黃慧偉 杜蔚連 鄧茜

宮頸癌作為婦科常見腫瘤之一，近年來發(fā)病率已經(jīng)排在女性惡性腫瘤第2位[1]。由于腫瘤放療、化療帶來的毒副反應(yīng)較強(qiáng)，從天然植物中篩選抗腫瘤藥物已成為熱門研究方向。三葉青主要產(chǎn)于我國(guó)浙江、福建、江蘇等少數(shù)地區(qū)，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)其能有效治療肝炎、緩解風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎癥狀，還可用于腫瘤治療[2]。有研究指出，三葉青具有細(xì)胞毒性，能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而有效抑制肺癌、結(jié)腸癌等多種體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的增殖[3-4]?；诖?，本研究以三葉青提取物作用于體外培養(yǎng)的宮頸癌HeLa細(xì)胞，分析其對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響，并探討其作用機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 三葉青提取物制備 三葉青塊根購自寧波圣旺生物科技有限公司，取1kg采用醇提、酸沉淀的方法[4]得三葉青提取物8g。

1.1.2 主要儀器和試劑 細(xì)胞培養(yǎng)箱（中國(guó)香港Hecnforce公司）；高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)BECKMAN公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；酶標(biāo)儀、電泳儀、蛋白成像系統(tǒng)（美國(guó)BIO-RAD公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）。MTT溶液、0.25%胰蛋白酶、Annexin V-FITC、PI（北京Solarbio公司）。

1.1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 取冷凍保存的人宮頸癌HeLa細(xì)胞株于37℃水浴中快速解凍，細(xì)胞培養(yǎng)液采用10%胎牛血清加RPMI 1640培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)條件：37℃、5%二氧化碳恒溫、恒濕細(xì)胞培養(yǎng)箱，48h換取新鮮培養(yǎng)液，顯微鏡下觀察細(xì)胞鋪滿瓶底80%時(shí)進(jìn)行傳代。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 采用MTT法檢測(cè)三葉青提取物對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞，以5×104/ml的濃度接種于96孔板，每孔0.1ml；待細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為5組，分別加入三葉青提取物，使其終濃度分別為 0（對(duì)照組）、1、2、4、8mg/ml，培養(yǎng) 24 或48h后，每孔加入20μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，最后每孔加入100μl DMSO溶液，15min后于570nm波長(zhǎng)下測(cè)OD值，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞抑制率（%）=（1-藥物組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 以0.25%胰蛋白酶將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞消化后接種于6孔板，每孔5×106個(gè)細(xì)胞。待細(xì)胞貼壁后，細(xì)胞分組及三葉青提取物干預(yù)方式同上。48h后于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.2.3 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞以每孔5×106個(gè)加入6孔板中，細(xì)胞分組及三葉青提取物干預(yù)方式同上。48h后，離心收集細(xì)胞，PBS緩沖液清洗細(xì)胞3次，收集的細(xì)胞以500μl結(jié)合PBS緩沖液重懸，最后用5μl Annexin V-FITC和10μl PI進(jìn)行染色，常溫下避光反應(yīng)15min后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4 細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法檢測(cè)HeLa細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9，細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白p53、Bax的表達(dá)情況。細(xì)胞分組及三葉青提取物干預(yù)方式同上。細(xì)胞分組處理48h后收集細(xì)胞，細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，收集總蛋白并采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。以SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜、以5%脫脂奶粉封閉1h、加入一抗（4℃搖床孵育過夜）；PBST洗滌后，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，最后加入顯影液，上機(jī)拍照，并進(jìn)行灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三葉青提取物對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響 與對(duì)照組相比，隨著三葉青提取物濃度的增加，HeLa細(xì)胞OD值呈逐漸下降趨勢(shì)。三葉青提取物處理24h后，除1mg/ml組與對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外（OD值比較P＞0.05），其余各組均對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖表現(xiàn)出抑制效應(yīng)（各組OD值比較均P＜0.05），且隨著濃度的增加，抑制效應(yīng)逐漸增強(qiáng)；而三葉青提取物處理48h后，各組OD值均出現(xiàn)下降（均P＜0.05），且具有濃度依賴效應(yīng)，見表1。

2.2 三葉青提取物對(duì)HeLa細(xì)胞形態(tài)的影響 顯微鏡下顯示，三葉青提取物處理48h后的HeLa細(xì)胞形態(tài)逐漸由長(zhǎng)梭形或紡錘形變?yōu)闄E圓形，細(xì)胞偽足變短，細(xì)胞間隙增寬；且隨著三葉青提取物濃度的增加，鏡下凋亡細(xì)胞開始增多，細(xì)胞碎片增加，見圖1。

2.3 三葉青提取物對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響 V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)顯示，與對(duì)照組相比，除1mg/ml組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）外，其余各組凋亡細(xì)胞數(shù)均明顯增加（均P＜0.05），且呈現(xiàn)濃度依賴性，見圖2。

2.4 三葉青提取物對(duì)HeLa細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，其余各組HeLa細(xì)胞MMP-2及MMP-9蛋白表達(dá)水平均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（均P＜0.05），且MMP-2表達(dá)水平與三葉青提取物呈濃度依賴性；而p53與Bax蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比均明顯升高（均P＜0.05），且隨著三葉青提取物濃度增加，p53與Bax蛋白表達(dá)水平逐漸上升，當(dāng)三葉青提取物濃度達(dá)到8mg/ml時(shí)，由于細(xì)胞凋亡數(shù)量過多，導(dǎo)致該兩類蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)下降。見圖3。

表1 三葉青提取物對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響

圖1 HeLa細(xì)胞不同濃度三葉青提取物處理48h后的形態(tài)（×400）

圖2 HeLa細(xì)胞不同濃度三葉青提取物處理48h后流式細(xì)胞圖及凋亡率

3 討論

目前關(guān)于三葉青在抗呼吸系統(tǒng)[5]、消化系統(tǒng)[6]等腫瘤作用方面的研究已展開較多，但對(duì)抗宮頸癌的作用及其作用機(jī)制的研究卻鮮有報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，三葉青提取物對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞表現(xiàn)出一定的增殖抑制作用：與三葉青提取物共培養(yǎng)24h后，2mg/ml組即表現(xiàn)出細(xì)胞增殖抑制作用（12.7%）；共培養(yǎng)48h后，1mg/ml組也表現(xiàn)出細(xì)胞增殖抑制作用（5.7%），且最高劑量8mg/ml組細(xì)胞抑制率達(dá)到47.2%。由此可見三葉青提取物對(duì)HeLa細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。而細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果也顯示，隨著三葉青提取物濃度的增加，HeLa細(xì)胞隨即出現(xiàn)明顯的凋亡特征：細(xì)胞質(zhì)濃縮，變小、細(xì)胞核固縮、細(xì)胞裂片形成，當(dāng)藥物濃度達(dá)到8mg/ml時(shí)，細(xì)胞凋亡率達(dá)37%，可見三葉青提取物可明顯促進(jìn)HeLa細(xì)胞凋亡進(jìn)程。

圖3 HeLa細(xì)胞不同濃度三葉青提取物處理48h后相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖和水平比較

細(xì)胞凋亡屬于程序化進(jìn)程，影響細(xì)胞凋亡的因子很多。人體p53基因具有抑制腫瘤發(fā)生的作用[7]，p53基因在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激、DNA損傷修復(fù)、營(yíng)養(yǎng)缺乏和其他癌基因被激活等情況下可被激活[8]。p53蛋白可通過正向調(diào)節(jié)Bax等凋亡相關(guān)蛋白的合成，引起細(xì)胞凋亡[9-10]。鄭倩等[11]以β-氧化石竹烯作用于HeLa細(xì)胞，結(jié)果顯示β-氧化石竹烯能促進(jìn)細(xì)胞p53蛋白上調(diào)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，三葉青提取物可促進(jìn)HeLa細(xì)胞p53蛋白上調(diào)，并進(jìn)一步上調(diào)凋亡蛋白Bax的合成，提示三葉青提取物通過該信號(hào)通路促進(jìn)HeLa細(xì)胞凋亡。

癌細(xì)胞浸潤(rùn)是癌癥擴(kuò)散的病理生理基礎(chǔ)，而癌細(xì)胞突破細(xì)胞外基質(zhì)是浸潤(rùn)的重要過程?；|(zhì)金屬蛋白酶作為一類離子通道依賴型細(xì)胞外基質(zhì)降解酶，可以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解，協(xié)助癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[12]。MMP-2與MMP-9高表達(dá)與癌細(xì)胞遷移能力成正相關(guān)[13-14]。姚昭等[15]發(fā)現(xiàn)，有機(jī)硒作用后的大腸癌Lovo細(xì)胞MMP-2與MMP-9表達(dá)水平明顯下降，且細(xì)胞遷移能力減弱。本研究結(jié)果也顯示，三葉青提取物能有效降低HeLa細(xì)胞中MMP-2、MMP-9表達(dá)水平，且具有藥物濃度依賴性。這提示三葉青提取物可能通過該途徑抑制HeLa細(xì)胞侵襲和遷移。

綜上所述，三葉青提取物對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖起抑制作用。其或通過上調(diào)p53及Bax蛋白表達(dá)誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡，且具有濃度依賴性；通過下調(diào)MMP-2及MMP-9表達(dá)影響HeLa細(xì)胞侵襲和遷移。