尋常型銀屑病皮損組織中漿細胞樣樹突狀細胞和TLR7/9通路表達的研究

湯怡 周強 韓睿 陸威 陶小華 程浩

銀屑病是一種常見的以紅斑、鱗屑為主要表現(xiàn)的慢性炎癥性皮膚病，其中以尋常型銀屑病最為多見。雖然尋常型銀屑病很少危及生命，但其反復發(fā)作、遷延不愈的病程以及嚴重脫屑的皮損危害患者的身心健康，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[1-2]。目前認為，銀屑病是Th1細胞介導相關的自身免疫性疾病，與遺傳、環(huán)境、病毒感染等相關[3-4]。近年來，臨床越來越關注用天然免疫來解釋環(huán)境觸發(fā)和自身免疫T細胞級聯(lián)相互作用在銀屑病發(fā)病中的作用[5-7]。漿細胞樣樹突狀細胞（plasmacytoid den－dritic cell，pDC）是最近發(fā)現(xiàn)的具有特征性的樹突狀細胞的一個亞類。在機體內(nèi)，pDC能夠產(chǎn)生大量的α干擾素（IFN-α）和白細胞介素 12（IL-12），同時 IFN-α 誘導所有T細胞亞類上調(diào)IL-12受體，進一步與IL-12共同激活Th1反應，活化下游Toll樣受體（toll like receptor，TLR）信號通路TLR7、TLR9，白細胞介素1受體相關激酶 1（interleukin-1 receptor-associated kinase 1，IRAK-1），干擾素調(diào)節(jié)因子 7（interferon regulatory factor 7，IRF7）[8-9]。目前，pDC在尋常型銀屑病皮損組織中的表達情況和具體分布與疾病相關性尚不明確?；诖耍狙芯客ㄟ^免疫組化方法檢測尋常型銀屑病皮損組織中pDC的特異性表面標志分子CD2AP、CD123和TLR7、TLR9及其信號通路中相關蛋白分子IRAK-1、IRF7的表達情況，探討pDC和TLR7/9信號通路在尋常型銀屑病發(fā)病機制中的作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 皮損組織 選取浙江省人民醫(yī)院皮膚科于2017年1至12月收集的19例尋常型銀屑病患者的皮損組織和皮損旁正常組織為研究材料，患者均符合臨床尋常型銀屑病診斷標準。其中男12例，女7例；年齡26～50（39.84±8.00）歲；病程 0.5～18 年，中位 7（3，11）年；主要皮損部位為膝背側(cè)、四肢伸側(cè)。所有患者均排除病毒性肝炎、自身免疫性疾病、結(jié)核及糖尿病等可能影響機體免疫力的疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患者簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 兔抗人CD2AP單抗、鼠抗人CD123單抗均購自美國Abcam公司，兔抗人IRAK-1單抗、兔抗人IRF7單抗、鼠抗人TLR7單抗、兔抗人TLR9單抗均購自美國CST公司。免疫組化用過氧化氫、抗原修復液、HRP偶連二抗、DAB顯色液均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 CD2AP、CD123、IRAK-1、IRF7、TLR7、TLR9 免疫組織化學染色 分別取19例尋常型銀屑病患者的局部皮損組織和對應的皮損旁正常組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定后制成石蠟切片，并進行4 μm的連續(xù)切片。免疫組化流程如下：首先取組織樣于60℃烘箱烘30min使蠟融化，依次放入二甲苯-梯度乙醇-水中脫臘浸水；再加入過氧化氫消除內(nèi)源性的過氧化物酶；隨后利用抗原修復液修復抗原，經(jīng)過透膜、封閉后加入稀釋好的一抗（兔抗人CD2AP單抗1：100稀釋、鼠抗人CD123單抗1：100稀釋、兔抗人IRAK-1單抗1：50稀釋、兔抗人IRF7單抗1：200稀釋、鼠抗人TLR7單抗1：50稀釋、兔抗人TLR9單抗1：100稀釋）孵育過夜。次日取出后洗去一抗，加入HRP二抗室溫孵育。之后利用DAB顯色，蘇木素染核，封片觀察并記錄結(jié)果。

1.3.2 免疫組化染色結(jié)果判定 CD2AP、CD123、TLR7、TLR9、IRF7和IRAK-1染色觀察：光鏡下細胞膜和（或）細胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃或黃褐色顆粒的細胞為陽性細胞，陽性率=含陽性細胞的病例數(shù)/總病例數(shù)×100%。半定量計分：400倍光鏡下觀察拍照，表達的強度采用基于染色強度和陽性細胞百分率的半定量評分法。強度評分（A）：未染色計0分；淡黃色計1分；棕黃色計2分；深棕色計3分。陽性細胞率評分（B）：陽性細胞率＜33%計1分；33%～66%計2分；＞66%計3分。表達強度為A×B。每張切片取5個視野進行觀察評分量化，最終取平均值進行比較。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。非正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，兩組比較采用Mann-Whitney U檢驗。計數(shù)資料以頻數(shù)和構成比表示，兩組比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 尋常型銀屑病皮損組織CD2AP的表達及分布情況 CD2AP主要表達于皮膚組織真皮層的單核細胞，表皮層內(nèi)也有少量表達，以細胞質(zhì)為主，見圖1（插頁）。CD2AP+細胞在皮損組織表皮層中的陽性率明顯高于皮損旁正常組織表皮層（P＜0.05），同時CD2AP的表達強度明顯高于皮損旁正常組織（P＜0.05）；同樣的，CD2AP+細胞在皮損組織真皮層中陽性率明顯高于皮損旁正常組織（P＜0.05），CD2AP的表達強度明顯高于皮損旁正常組織（P＜0.05），見表1。

圖1 CD2AP在尋常型銀屑病皮損組織中的表達及分布情況（DAB染色，×400）

2.2 尋常型銀屑病皮損組織中CD123的表達及分布情況 CD123同樣主要表達于真皮層的單核細胞，表皮層內(nèi)有少量表達，以細胞質(zhì)為主，見圖2（插頁）。CD123+細胞在皮損組織表皮層中的陽性率明顯高于皮損旁正常組織（P＜0.05），CD123的表達強度明顯高于皮損旁正常組織（P＜0.05）；同樣，CD123+細胞在皮損組織真皮層中的陽性率明顯高于皮損旁正常組織（P＜0.05），CD123的表達強度明顯高于皮損旁組織，見表2。

圖2 CD123在尋常型銀屑病皮損組織中的表達及分布情況（DAB染色，×400）

2.3 尋常型銀屑病皮損組織中TLR7的表達及分布情況 TLR7主要表達于皮損組織真皮層中，以細胞質(zhì)為主，見圖3（插頁）。TLR7+細胞在皮損組織表皮層中的陽性率（47.4%）與皮損旁正常組織（21.1%）比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；而在皮損組織真皮層中TLR7+細胞的陽性率（42.1%）高于皮損旁正常組織（0.0%，P＜0.05）。

圖3 TLR7在尋常型銀屑病皮損組織中的表達及分布情況（DAB染色，×400）

表1 CD2AP在尋常型銀屑病皮損組織和皮損旁正常組織中的細胞陽性率和表達強度比較

表2 CD123在尋常型銀屑病皮損組織和皮損旁正常組織中的細胞陽性率和表達強度比較

2.4 尋常型銀屑病皮損組織中TLR9的表達及分布情況 TLR9在尋常型銀屑病真皮層和表皮層中均有表達，以細胞質(zhì)為主，見圖4（插頁）。TLR9+細胞在皮損組織表皮層中的陽性率（89.5%）明顯高于皮損旁正常組織（10.5%，P＜0.05）；而在皮損組織真皮層中TLR9+細胞的陽性率（100.0%）明顯高于皮損旁正常組織（10.5%，P＜0.05）。

圖4 TLR9在尋常型銀屑病皮損組織中的表達及分布情況（DAB染色，×400）

2.5 尋常型銀屑病皮損組織IRAK-1的表達及分布情況 IRAK-1主要表達于皮損組織真皮層中，表皮層可見少量零星表達，以細胞質(zhì)為主，見圖5（插頁）。IRAK-1+細胞在皮損組織表皮層的陽性率（31.6%）高于皮損旁正常組織（0.0%，P＜0.05）；在皮損組織真皮層中IRAK-1+細胞的陽性率（100.0%）明顯高于皮損旁正常組織（26.3%，P＜0.05）。

圖5 IRAK-1在尋常型銀屑病皮損組織中的表達及分布情況（DAB染色，×400）

2.6 尋常型銀屑病皮損組織IRF7的表達及分布情況 IRF7在皮損組織真皮層和表皮層均有表達，主要在細胞質(zhì)分布，見圖6（插頁）。IRF7+細胞在皮損組織表皮層的陽性率（47.4%）明顯高于皮損旁正常組織（0.0%，P＜0.05）；IRF7+細胞在皮損組織真皮層陽性率（73.7%）明顯高于皮損旁正常組織（0.0%，P＜0.05）。

圖6 IRF7在尋常型銀屑病皮損組織中的表達及分布情況（DAB染色，×400）

3 討論

尋常型銀屑病是一種Th1細胞介導相關的自身免疫性疾病，會影響遺傳易感人群的皮膚[10]。近年來，人們越來越關注先天免疫在解釋環(huán)境觸發(fā)因素和導致尋常型銀屑病的自身免疫性T細胞級聯(lián)反應加劇之間的作用[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)，pDC通過產(chǎn)生IFN-α，驅(qū)動尋常型銀屑病皮膚中自身免疫T細胞的活化和擴增，從而導致尋常型銀屑病的發(fā)展?；诖?，本研究通過pDC的經(jīng)典標志物CD2AP和 CD123來標記尋常型銀屑病組織中pDC的數(shù)量，結(jié)果顯示，尋常型銀屑病皮損組織中pDC數(shù)量明顯增加，且大部分存在于真皮組織中。

此外，本研究進一步探究了pDC通過什么信號通路發(fā)揮功能。有報道提示pDC是最有潛力的Ⅰ型IFN（IFN-a/β）分泌細胞，而IFN-α可以誘導T細胞發(fā)生Th1型分化信號的異常激活及活化TLR信號通路[13-14]。因此，本研究檢測了TLR信號通路TLR7/9、IRAK-1、IRF7在尋常型銀屑病皮損組織中的表達，結(jié)果顯示，TLR7/9、IRAK-1、IRF7在尋常型銀屑病皮損組織中均存在異常高表達的情況。這提示抑制pDC的招募以及TLR信號通路在尋常型銀屑病的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要的作用，其中的作用機制需要后續(xù)進一步探究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在尋常型銀屑病皮損組織中pDC數(shù)量明顯增加，同時TLR信號通路（TLR7/9、IRAK-1、IRF7）也有部分活化。這提示pDC的異常增多與TLR信號的異?；罨瘜こＰ豌y屑病的發(fā)生、發(fā)展起一定作用，相關后續(xù)的機制研究將為針對性地治療尋常型銀屑病提供理論依據(jù)和新的方向。