186例耳聾患者線粒體DNA 12S rRNA基因篩查及家系分析

戴顯寧 陳茜 王倩 王海堅(jiān) 童郁 許鍇

耳聾是造成兒童言語(yǔ)交流障礙的最常見(jiàn)原因之一。據(jù)全國(guó)第二次殘疾人抽樣調(diào)查顯示，我國(guó)現(xiàn)有的聽(tīng)力障礙患者約2 000余萬(wàn)，其中0～6歲聽(tīng)力障礙兒童超80萬(wàn)。50%以上的聽(tīng)力障礙兒童是遺傳性易感體質(zhì)，且90%以上的聾兒出生于聽(tīng)力正常、沒(méi)有耳聾家族史的家庭[1]。由于耳毒性藥物使用不當(dāng)導(dǎo)致的聽(tīng)力障礙兒童約占30%～40%[2-4]，其中20%～30%的藥物性耳聾患者存在線粒體DNA（mtDNA）突變[5-6]。研究報(bào)道位于mtDNA 12S rRNA基因上的1494C＞T及1555A＞G位點(diǎn)突變可使部分?jǐn)y帶者對(duì)氨基糖甙類(lèi)抗生素超敏感，從而出現(xiàn)臨床上常見(jiàn)的“一針致聾”現(xiàn)象[7-10]。因此，本研究通過(guò)對(duì)溫州市特殊教育學(xué)校186例耳聾患者進(jìn)行mtDNA 12S rRNA基因篩查及家系分析，明確部分藥物性耳聾患者的發(fā)病原因，提高患者用藥安全性，通過(guò)遺傳咨詢?yōu)橄乱淮烂@治聾提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 2016至2018年期間溫州市人民醫(yī)院共對(duì)溫州特殊教育學(xué)校192例耳聾患者進(jìn)行耳聾基因篩查，排除3例Warrdenburg綜合征、2例Pendred綜合征以及1例耳聾伴骨骼發(fā)育異?；颊?，最終本研究共納入186例非綜合征耳聾患者作為研究對(duì)象。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）明確有外耳或中耳先天性畸形患者；（2）綜合征性耳聾患者；（3）伴有其它先天性疾病患者（如：先天性心臟病、染色體異常等）。其中男104例，女82例；年齡6～16（11.4±2.9）歲；37例有使用氨基糖甙類(lèi)藥物史，占19.9%。臨床資料以書(shū)面問(wèn)卷調(diào)查形式開(kāi)展，包括患者的發(fā)病誘因、發(fā)病年齡、聽(tīng)力損失嚴(yán)重程度、抗生素用藥史、家族遺傳史等。本研究經(jīng)溫州市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員批準(zhǔn)，檢查前告知患者監(jiān)護(hù)人基因篩查可能存在的風(fēng)險(xiǎn)并簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 聽(tīng)力檢測(cè) 由溫州市人民醫(yī)院的耳鼻喉科醫(yī)師在溫州特殊教育學(xué)校使用AD266純音聽(tīng)閾測(cè)試儀對(duì)患者進(jìn)行聽(tīng)力檢測(cè)，聽(tīng)力損失嚴(yán)重程度按世界衛(wèi)生組織耳聾分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分類(lèi)[11]，見(jiàn)表1。

表1 聽(tīng)力損失分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

1.2.2 mtDNA 12S rRNA基因篩查 患者均抽取靜脈血3～5ml，EDTA-K2抗凝。采用蘇州天隆生物科技有限公司試劑盒（批號(hào)：E0819050121）提取全血基因組DNA，提取過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。用德國(guó)恒通SMA-4000型紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度和純度，待測(cè)DNA于-20℃保存。mtDNA 12S rRNA目的片段引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[12]，并由杭州擎科生物工程技術(shù)有限公司合成，Mit-1F：5′-CTCCTCAAAGCAATACACTG-3′；Mit-1R：5′-TGCTAAATCCACCTTCGACC-3′;Mit-2F：5′-CGATCAACCTCACCACCTCT-3′;Mit-2R：5′-TGGACA ACCAGCTATACCA-3′。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性 30 s，58℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物送至杭州擎科生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行Sanger測(cè)序。

1.2.3 結(jié)果分析 測(cè)序結(jié)果采用DNAstar2.0生物學(xué)軟件進(jìn)行分析。采用Clustal X 2.0生物學(xué)軟件將人類(lèi)mtDNA 12S rRNA基因序列與12種靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物相應(yīng)序列進(jìn)行種間并對(duì)，計(jì)算保守指數(shù)（conservation index，CI）。CI≥75%時(shí)提示該位點(diǎn)較保守[13]。

2 結(jié)果

2.1 患者mtDNA 12S rRNA基因篩查結(jié)果 186例患者mtDNA 12S rRNA基因共篩查出變異類(lèi)型16種（均已有報(bào)道）。與氨基糖甙類(lèi)明確相關(guān)的1555A＞G位點(diǎn)突變10例，占5.4%，其中男7例，女3例，聽(tīng)力損失程度從輕度至極重度不等。計(jì)算變異位點(diǎn)保守性發(fā)現(xiàn)CI＞75%的變異位點(diǎn)包括 827A＞G、1095T＞C、1107T＞C、1382A＞C、1431G＞A、1541T＞C、1555A＞G，見(jiàn)表 2。

表2 186例患者mtDNA 12S rRNA基因篩查變異位點(diǎn)

2.2 攜帶mtDNA 12S rRNA基因1555A＞G位點(diǎn)突變患者家系分析 該10例患者的家系評(píng)估、遺傳學(xué)特征分析顯示家系平均耳聾外顯率（母系成員耳聾患者/所有母系成員）約為26.8%。聽(tīng)力損失程度和發(fā)病年齡也表現(xiàn)出一定程度差異（表3），母系成員多表現(xiàn)為聽(tīng)力正常，呈散發(fā)性。其中WZ-152家系存在1555A＞G和1095T＞C雙位點(diǎn)突變，WZ163家系存在1555A＞G和961insC雙位點(diǎn)突變。7個(gè)家系的先證者（家系中第1個(gè)被本研究確診為耳聾的人，即本研究耳聾基因檢測(cè)患者，家系圖中箭頭所示）有氨基糖甙類(lèi)藥物史，耳聾外顯率分別為 33.3%、20.0%、28.6%、50.0%、20.0%、42.9%、25.0%，平均外顯率為31.4%。3個(gè)非藥物耳聾家系的外顯率分別為16.7%、25.0%、25.0%；平均外顯率為22.2%，見(jiàn)圖1。

表3 10例攜帶mtDNA 12S rRNA基因1555A＞G位點(diǎn)突變患者相關(guān)臨床資料

圖1 10例攜帶mtDNA 12S rRNA基因1555A＞G位點(diǎn)突變患者家系圖（箭頭所指為先證者）

3 討論

耳聾是嚴(yán)重影響人們正常生活的常見(jiàn)健康問(wèn)題之一，其中藥物性耳聾是新生兒先天性或后天性聾及成人后天性耳聾的主要原因，約20%～30%的藥物性耳聾患者因存在mtDNA突變，對(duì)氨基糖甙類(lèi)藥物極其敏感。氨基糖甙類(lèi)抗生素致聾可分為兩類(lèi)，一類(lèi)因使用耳毒性藥物而致聾；另一類(lèi)有遺傳背景或易感體質(zhì)，即攜帶mtDNA 12S rRNA的1494C＞T及1555A＞G突變位點(diǎn)。這類(lèi)人群接觸一次或低劑量氨基糖甙類(lèi)藥物即可能致聽(tīng)力損失。耳聾患者多在用藥數(shù)天后出現(xiàn)聽(tīng)力下降，逐步加重。且臨床表現(xiàn)上主要以耳聾、耳鳴為主，多雙側(cè)對(duì)稱(chēng)及高頻聽(tīng)力缺失，可逐漸向低頻聽(tīng)力缺失發(fā)展，少數(shù)患者甚至繼續(xù)惡化，至全聾。

本研究通過(guò)對(duì)溫州特殊教育學(xué)校186例耳聾患者mtDNA 12S rRNA檢測(cè)，篩選出變異類(lèi)型16種，其中與藥物性耳聾相關(guān)的1555A＞G位點(diǎn)突變10例，突變率為5.4%，低于李守霞等[14]報(bào)道的邢臺(tái)市特教學(xué)校耳聾患者1555A＞G位點(diǎn)突變的7.5%，高于彭光華等[15]報(bào)道的浙江省7所聾校456例患者1555A＞G位點(diǎn)突變的4.4%?？赡茉?yàn)闃颖救脒x數(shù)量、地區(qū)性差異，環(huán)境因素及遺傳背景等在疾病的發(fā)生發(fā)展與表現(xiàn)上有著不同程度的影響。龔莎莎等[15]研究報(bào)道稱(chēng)僅在中國(guó)患者和西班牙患者家系中發(fā)現(xiàn)了1494C＞T位點(diǎn)突變，但本研究結(jié)果未見(jiàn)1494C＞T位點(diǎn)突變。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)其他一些可能與耳聾相關(guān)的突變位點(diǎn)，如彭光華等[16]報(bào)道的1095T＞C位點(diǎn)，CI高達(dá)92.9%，該位點(diǎn)在對(duì)照組和一些藥物性耳聾患者中均有出現(xiàn)，可能造成結(jié)構(gòu)上一定程度的改變，具有功能意義，但本身不足以造成耳聾表型。同樣也有研究表明961 insC位點(diǎn)可能也與非綜合征聾有關(guān)[17]。1999年，Casano等[18]報(bào)道了1例氨基糖甙類(lèi)藥物致聾家系同時(shí)存在A1555G和961insC雙位點(diǎn)突變，該研究表明961位點(diǎn)C插入可能導(dǎo)致mtDNA 12S rRNA的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響氨基糖甙類(lèi)藥物的結(jié)合。但目前尚無(wú)關(guān)于961insC位點(diǎn)突變單獨(dú)導(dǎo)致耳聾發(fā)生的情況報(bào)道，因此提示961insC可能協(xié)同A1555G突變?cè)黾蛹蚁抵卸@外顯率及表現(xiàn)度，導(dǎo)致A1555G突變患者對(duì)氨基糖甙類(lèi)藥物產(chǎn)生超敏性。此外，其余變異位點(diǎn)在對(duì)照組和患者中攜帶比率都較高或者CI較低，可能是線粒體單體型特異位點(diǎn)[19]。

本研究186例非綜合征耳聾患者中明確有氨基糖甙類(lèi)藥物史占19.9%，但與藥物性耳聾相關(guān)的1555A＞G位點(diǎn)突變率僅為5.4%，可能是由于本研究?jī)H篩查了mtDNA 12S rRNA相關(guān)熱點(diǎn)區(qū)域，導(dǎo)致了由于mtDNA上其他繼發(fā)位點(diǎn)突變?cè)斐傻乃幬镄远@患者的漏篩。因此，需進(jìn)一步完善本研究mtDNA上其他位點(diǎn)的篩查。從10例攜帶1555A＞G位點(diǎn)突變的耳聾家系圖中可以看出，只有小部分母系成員表現(xiàn)耳聾，而絕大多數(shù)成員都表現(xiàn)為聽(tīng)力正常，平均外顯率僅26.8%，聽(tīng)力損失程度和發(fā)病年齡也表現(xiàn)一定程度差異性，且同一家系母系成員或不同家系成員之間在聽(tīng)力損失嚴(yán)重程度、抗生素使用情況及耳聾外顯率等方面均存在明顯差異，提示1555A＞G基因突變本身可能不是造成耳聾的唯一原因，可能原因是區(qū)別于核基因突變，mtDNA突變存在閾值效應(yīng)，當(dāng)突變的mtDNA達(dá)到一定的比例時(shí)，才有受損的表型出現(xiàn)，即同質(zhì)突變和異質(zhì)突變。但不同個(gè)體細(xì)胞內(nèi)突變mtDNA閾值又受核基因、環(huán)境等影響而呈現(xiàn)個(gè)體差異性。從而導(dǎo)致部分?jǐn)y帶者用藥后仍表現(xiàn)聽(tīng)力正?；蜉p度下降。因此其他修飾因子如繼發(fā)突變、線粒體單倍型和核修飾基因等可能參與調(diào)節(jié)耳聾的外顯率及表型表達(dá)[20]。

由此可見(jiàn)，mtDNA 12S rRNA突變是部分氨基糖甙類(lèi)藥物致聾患者的分子基礎(chǔ)，但突變并不是造成耳聾的唯一因素，其他修飾因子如繼發(fā)突變、線粒體單體型和核基因調(diào)控等均有可能影響耳聾的外顯率及表型表達(dá)。但對(duì)于基因攜帶者可以通過(guò)評(píng)估家族成員藥物敏感史和mtDNA基因篩查提高耳聾患者使用氨基糖甙類(lèi)抗生素治療的安全性，同時(shí)對(duì)于耳聾患者婚配及生育指導(dǎo)有著重要的社會(huì)意義，可為下一代防聾治聾提供依據(jù)。