• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    綠原酸對(duì)顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖、凋亡和炎癥因子釋放的影響及作用機(jī)制研究

    2020-04-28 09:25:14陳昕婷林微微陳建治
    浙江醫(yī)學(xué) 2020年6期
    關(guān)鍵詞:綠原下頜骨關(guān)節(jié)炎

    陳昕婷 林微微 陳建治

    顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病是一類臨床癥狀表現(xiàn)為顳下頜關(guān)節(jié)區(qū)疼痛、異常關(guān)節(jié)音或伴有下頜運(yùn)動(dòng)障礙的疾病的總稱,人群中發(fā)病率為20%~40%,是口腔科常見病、多發(fā)病之一[1]。顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎是顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病的一種重要類型,是一類主要累及顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨、滑膜及軟骨下骨的以關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨骨質(zhì)改變?yōu)橹饕卣鞯钠髻|(zhì)性病變[2]。研究顯示,顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與軟骨細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥因子釋放和軟骨基質(zhì)減少密切相關(guān)[3]。綠原酸又名咖啡鞣酸,是由咖啡酸和奎尼酸形成的縮酚酸,為極性有機(jī)酸。綠原酸的生物活性廣泛,隨著研究的深入,許多新的藥效被陸續(xù)挖掘,包括抗感染、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抑菌等[4-5]。綠原酸能夠通過抑制NLRP3炎性復(fù)合體/核因子κB(NF-κB)通路發(fā)揮對(duì)關(guān)節(jié)炎的治療作用[6],但其作用機(jī)制尚不完全明了?;诖?,本研究采用不同濃度綠原酸干預(yù)白細(xì)胞介素1β(IL-1β)誘導(dǎo)的顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞損傷,分析綠原酸對(duì)軟骨細(xì)胞增殖、凋亡和炎癥因子釋放的影響,以探討綠原酸對(duì)顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的保護(hù)作用機(jī)制,現(xiàn)報(bào)道如下。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 細(xì)胞來源 取6周齡雄性SD大鼠購(gòu)自上海斯萊克公司,體重140~160g,由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物研究中心在25℃,空氣濕度65%的環(huán)境中統(tǒng)一喂養(yǎng)。采用胰蛋白酶消化法[7]獲取原代顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞,具體方法為戊巴比妥鈉麻醉下處死SD大鼠,75%乙醇消毒10min,在超凈臺(tái)中切取顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨,剪成小塊并碾磨,在37℃胰蛋白酶溶液中培養(yǎng)2h;倒掉胰蛋白酶消化液,使用磷酸鹽緩沖液沖洗,然后在37℃的0.2%膠原酶溶液中培養(yǎng)過夜;消化后以800r/min離心15min收集原代顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞。

    1.1.2 主要試劑 含量≥98%的綠原酸購(gòu)自杭州諾揚(yáng)生物技術(shù)有限公司;重組人IL-1β購(gòu)自上海生工生物科技有限公司;DMEM/F-12培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;CCK-8試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;磷酸鹽緩沖液和胰蛋白酶購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司;TRIzol購(gòu)自美國(guó)Promega公司;RNA擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司;PCR引物購(gòu)自上海生工生物科技有限公司;蛋白提取試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司;兔抗人Wnt-5A、Ror2和GAPDHL均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司;HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

    1.1.3 主要儀器 PCR擴(kuò)增儀(0900544s型)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司;恒溫振蕩器(THZ-C-1型)購(gòu)自蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;臺(tái)式冷凍離心機(jī)(5804R型)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司;離心濃縮儀(TDZ4-WS型)購(gòu)自長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司;低溫超速離心機(jī)(CT15RE型)購(gòu)自日本Himac公司;低溫儲(chǔ)存箱系列(HYC-360型)購(gòu)自中國(guó)Haier公司;超低溫冰箱(MDF-U54V型)購(gòu)自日本Panasonic公司;光學(xué)顯微鏡(SOIF、XSP-ZCA型)購(gòu)自上海光學(xué)儀器工廠;恒溫培養(yǎng)箱(SPX-250B-Z型)購(gòu)自上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司;蛋白電泳儀(Powerpmac 043BR80551型)購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司;高速離心機(jī)(5424型)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司;流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與干預(yù) 軟骨細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基中于37℃、5%二氧化碳條件下在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將軟骨細(xì)胞分為模型組、實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組。模型組細(xì)胞采用含10ng/ml IL-1β的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞采用含10ng/ml IL-1β和不同濃度綠原酸(10、20、40、80 和 160μmol/L)的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。

    1.2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 采用CCK-8法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的軟骨細(xì)胞,不同組的細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種到96孔培養(yǎng)板中,每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,在37℃、5%二氧化碳條件下分別培養(yǎng)24、48h,每孔加入10μl的CCK-8溶液,在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2h后于酶標(biāo)儀中測(cè)定細(xì)胞在450nm的OD值。

    1.2.3 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 采用流式細(xì)胞術(shù)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的軟骨細(xì)胞,不同組的細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種到12孔板中,胰蛋白酶消化收集培養(yǎng)48 h后細(xì)胞,磷酸鹽緩沖液洗滌后制備成細(xì)胞懸液,然后加入10μl Annexin V-FITC和5μl碘化丙啶染色液,輕輕混勻,室溫避光孵育20 min,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

    1.2.4 腫瘤壞死因子 α(TNF-α)、IL-6、基質(zhì)金屬蛋白酶 3(MMP-3)、MMP-13、Wnt-5A 和 Ror2 mRNA 表達(dá)檢測(cè) 采用qRT-PCR法。不同組細(xì)胞培養(yǎng)48h后,采用TRIzol試劑從細(xì)胞中提取總RNA,通過紫外分光光度儀測(cè)定OD260/OD280值,取用OD260/OD280值在1.8~2.0的樣本。采用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后采用RNA擴(kuò)增試劑盒通過實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增cDNA。以GAPDH為靶基因內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計(jì)算靶基因的相對(duì)表達(dá)水平。

    1.2.5 Wnt-5A和Ror2蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法。不同組細(xì)胞培養(yǎng)48h后,采用蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞中的總蛋白,然后用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。每孔加入50μg的待測(cè)蛋白于SDS-PAGE凝膠,110V電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜,5%脫脂奶粉37℃封閉1h,分別加入兔抗人Wnt-5A、Ror2和GAPDH一抗4℃孵育過夜,TBST洗膜 3×10min,二抗 37℃ 孵育1 h,TBST洗膜3×30min,ECL顯影。運(yùn)用Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值,以GAPDH作內(nèi)參,計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示,多組比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 綠原酸對(duì)細(xì)胞增殖的影響 采用IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷后,模型組、實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在24h和48h的增殖能力均較對(duì)照組明顯減弱,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。在培養(yǎng)24h后,40μmol/L實(shí)驗(yàn)組較模型組細(xì)胞增殖能力增強(qiáng),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖1a。在培養(yǎng)48h后,20、40和80μmol/L實(shí)驗(yàn)組較模型組細(xì)胞增殖能力均增強(qiáng),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見圖1b。因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選用20、40和80μmol/L的綠原酸對(duì)軟骨細(xì)胞干預(yù)48h。

    2.2 綠原酸對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 采用IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷后,模型組、實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組均明顯升高,但實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率低于模型組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),即 20、40和80μmol/L綠原酸均能明顯抑制軟骨細(xì)胞凋亡,見圖2。

    圖1 綠原酸對(duì)細(xì)胞增殖的影響(a:培養(yǎng)24h的增殖能力比較;b:培養(yǎng)48h的增殖能力比較)

    圖2 綠原酸對(duì)細(xì)胞凋亡的影響(a:對(duì)照組細(xì)胞流式圖;b:模型組細(xì)胞流式圖;c:20μmol/L實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞流式圖;d:40μmol/L實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞流式圖;e:80μmol/L實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞流式圖;f:不同組軟骨細(xì)胞凋亡率比較)

    2.3 綠原酸對(duì)細(xì)胞炎癥因子釋放的影響 采用IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷后,模型組、實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞炎癥因子TNF-α和IL-6的mRNA表達(dá)水平均較對(duì)照組明顯升高,MMP-3和MMP-13的mRNA表達(dá)水平亦均較對(duì)照組明顯升高,但實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞TNF-α和IL-6的mRNA表達(dá)水平均低于模型組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。即20、40和80μmol/L綠原酸均能明顯抑制軟骨細(xì)胞TNF-α的mRNA表達(dá)水平,40和80μmol/L綠原酸均能明顯抑制軟骨細(xì)胞IL-6、MMP-3mRNA表達(dá)水平(均P<0.05)。40μmol/L實(shí)驗(yàn)組軟骨細(xì)胞較模型組MMP-13的mRNA表達(dá)水平明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖 3。

    圖3 綠原酸對(duì)細(xì)胞炎癥因子釋放的影響(a:TNF-α mRNA的表達(dá)水平比較;b:IL-6 mRNA的表達(dá)水平比較;c:MMP-3 mRNA的表達(dá)水平比較;d:MMP-13 mRNA的表達(dá)水平比較)

    2.4 綠原酸對(duì)細(xì)胞Wnt-5A/Ror2信號(hào)通路的影響 采用IL-1β誘導(dǎo)顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞損傷后,模型組、實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中Wnt-5A、Ror2的mRNA和蛋白表達(dá)水平均較對(duì)照組明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。20、40和80μmol/L實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞 Wnt-5A、Ror2 mRNA 和蛋白的表達(dá)水平均低于模型組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均 P<0.05),見圖 4。

    3 討論

    顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎是一種以關(guān)節(jié)軟骨損傷為主要特征,伴有滑膜及軟骨下骨組織改變的關(guān)節(jié)退行性疾病,其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增多趨勢(shì),容易復(fù)發(fā),嚴(yán)重影響患者的口腔功能和生活質(zhì)量[8]。目前對(duì)顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的常規(guī)治療效果不理想,治療方法多以保守治療為主,包括服用非甾體類抗生素、局部理療、關(guān)節(jié)腔注射藥物等[9]。目前采用中藥治療顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的研究尚少。

    IL-1是一種重要的炎癥因子,由IL-1α與IL-1β兩種蛋白質(zhì)組成,可與IL-1受體結(jié)合,從而激活下游炎癥通路。其作為炎癥的始動(dòng)因子,在軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡過程中起到關(guān)鍵作用[10]。IL-1β可能通過刺激TNF-α、IL-6、ICAM-1等炎癥因子的分泌和抑制膠原蛋白、組織金屬蛋白酶抑制因子等的合成來干擾關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞代謝,顯著抑制軟骨細(xì)胞合成基質(zhì),使軟骨細(xì)胞變性及細(xì)胞外基質(zhì)降解,引發(fā)關(guān)節(jié)炎癥和破壞,是造成顳下頜關(guān)節(jié)器質(zhì)性損害的一種重要炎癥介質(zhì)[11]。本研究采用IL-1β誘導(dǎo)顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞損傷,結(jié)果顯示IL-1β能夠明顯抑制軟骨細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和炎癥因子的釋放。這提示本研究IL-1β誘導(dǎo)顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞損傷造模成功。

    研究顯示,綠原酸可以降低關(guān)節(jié)液中IL-1β、TNF-α和MMP-3含量以及MMP-3酶活性,對(duì)關(guān)節(jié)軟骨損傷具有一定的保護(hù)作用[12]。綠原酸可以提高內(nèi)皮細(xì)胞線粒體膜電位、上調(diào)Bcl-2和下調(diào)Caspase,降低細(xì)胞凋亡率,對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞起保護(hù)作用[13]。同時(shí)綠原酸能夠抑制軟骨樣細(xì)胞凋亡,降低細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平,穩(wěn)定細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)來保護(hù)線粒體膜電位,促進(jìn)凋亡抑制基因Bcl-2和抑制半胱氨酸蛋白酶表達(dá)有關(guān)[14]。本研究結(jié)果顯示不同濃度綠原酸干預(yù)IL-1β誘導(dǎo)的顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞損傷后,綠原酸能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖,抑制軟骨細(xì)胞凋亡,抑制 TNF-α、IL-6、MMP-3 和 MMP-13 的表達(dá)水平。這提示綠原酸在顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡和炎癥因子釋放的作用。

    圖4 綠原酸對(duì)細(xì)胞Wnt-5A/Ror2信號(hào)通路的影響(a:Wnt-5A mRNA的表達(dá)水平比較;b:Ror2 mRNA的表達(dá)水平比較;c:Wnt-5A蛋白的表達(dá)水平;d:Ror2蛋白的表達(dá)水平;e:Wnt-5A和Ror2蛋白電泳圖)

    基質(zhì)金屬蛋白酶是一組鋅依賴性的對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)分解代謝起催化作用的蛋白水解酶,能降解幾乎所有的軟骨細(xì)胞外基質(zhì),在軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解過程中發(fā)揮重要作用[15]。成纖維細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等多種細(xì)胞可分泌基質(zhì)金屬蛋白酶,基質(zhì)金屬蛋白酶以無活性酶原形式出胞,無活性酶原能被多種炎癥因子激活,從而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解的發(fā)生[16]。本研究結(jié)果顯示,綠原酸能夠明顯抑制MMP-3和MMP-13的表達(dá),這提示綠原酸能夠抑制顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎中軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解。

    Wnt信號(hào)通路與軟骨細(xì)胞的分化發(fā)育密切相關(guān),是較早發(fā)現(xiàn)的與顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生有關(guān)的信號(hào)通路之一[17]。研究發(fā)現(xiàn)Wnt-5A/Ror2信號(hào)通路激活可以上調(diào)軟骨細(xì)胞 MMP-1、MMP-3、MMP-9和 MMP-13的表達(dá),從而參與骨關(guān)節(jié)炎的軟骨破壞過程[18]。Wnt-5A可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨方向分化,通過下調(diào)Runx2、Cxcl12的表達(dá)和Rankl/Opg比例,進(jìn)而抑制細(xì)胞的成骨分化[19]。本研究結(jié)果顯示,不同濃度的綠原酸均能夠降低Wnt-5A、Ror2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平,提示綠原酸能抑制IL-1β誘導(dǎo)的顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中Wnt-5A/Ror2信號(hào)通路的激活,進(jìn)而抑制軟骨細(xì)胞的損傷。

    綜上所述,綠原酸或通過抑制Wnt-5A/Ror2信號(hào)通路調(diào)控IL-1β誘導(dǎo)的顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖、凋亡和炎癥因子釋放。綠原酸或可作為治療顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的藥物。

    猜你喜歡
    綠原下頜骨關(guān)節(jié)炎
    抗抑郁藥帕羅西汀或可用于治療骨關(guān)節(jié)炎
    中老年保健(2021年5期)2021-12-02 15:48:21
    膝骨關(guān)節(jié)炎如何防護(hù)?
    蔓三七葉中分離綠原酸和異綠原酸及其抗氧化活性研究
    綠原酸對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的抑制作用
    中成藥(2018年11期)2018-11-24 02:56:46
    金銀花中綠原酸含量不確定度的評(píng)定
    中成藥(2017年10期)2017-11-16 00:50:42
    CBCT對(duì)下頜磨牙根分叉病變的評(píng)價(jià)
    磨骨術(shù)在下頜角肥大患者整形中的應(yīng)用分析
    原發(fā)性膝骨關(guān)節(jié)炎中醫(yī)治療研究進(jìn)展
    有禮貌
    推拿結(jié)合功能鍛煉治療膝骨關(guān)節(jié)炎24例
    成人鲁丝片一二三区免费| 男女啪啪激烈高潮av片| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产伦理片在线播放av一区| 高清视频免费观看一区二区 | 久久热精品热| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲第一区二区三区不卡| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产精品一区二区在线观看99 | 美女大奶头视频| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| www.色视频.com| 99久久精品热视频| 搡女人真爽免费视频火全软件| 精品久久久久久电影网| 国内揄拍国产精品人妻在线| 亚洲人与动物交配视频| 日韩大片免费观看网站| 亚洲乱码一区二区免费版| 三级经典国产精品| 人妻一区二区av| a级一级毛片免费在线观看| 成人美女网站在线观看视频| 内地一区二区视频在线| 亚洲av在线观看美女高潮| 亚洲人与动物交配视频| 男女国产视频网站| 3wmmmm亚洲av在线观看| 91av网一区二区| 国产黄频视频在线观看| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 日本熟妇午夜| 久久鲁丝午夜福利片| 国产成人午夜福利电影在线观看| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 看黄色毛片网站| 国产欧美日韩精品一区二区| 一级爰片在线观看| 亚洲精品日本国产第一区| 少妇的逼水好多| 日本一本二区三区精品| 日韩欧美国产在线观看| 联通29元200g的流量卡| 日韩在线高清观看一区二区三区| 久久鲁丝午夜福利片| 国产精品一区二区性色av| 国产高潮美女av| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 最近2019中文字幕mv第一页| videossex国产| or卡值多少钱| 97超视频在线观看视频| 久久99蜜桃精品久久| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 亚洲人成网站在线观看播放| 91精品国产九色| 最后的刺客免费高清国语| 国产精品精品国产色婷婷| av又黄又爽大尺度在线免费看| 美女主播在线视频| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 看十八女毛片水多多多| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲性久久影院| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 亚洲人成网站在线观看播放| 久久久久久久久久成人| 国内精品一区二区在线观看| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产成人午夜福利电影在线观看| 久久草成人影院| 国内精品宾馆在线| 大香蕉97超碰在线| 亚洲va在线va天堂va国产| 毛片女人毛片| 精品一区在线观看国产| 搡老乐熟女国产| 一级毛片久久久久久久久女| 国产黄片视频在线免费观看| 能在线免费看毛片的网站| 精品久久久精品久久久| 亚洲精品国产av成人精品| 在线 av 中文字幕| 国产麻豆成人av免费视频| 午夜激情欧美在线| 天天躁日日操中文字幕| 两个人的视频大全免费| 不卡视频在线观看欧美| 又爽又黄a免费视频| 春色校园在线视频观看| 一级a做视频免费观看| 亚洲欧洲国产日韩| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国产有黄有色有爽视频| 精品熟女少妇av免费看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 我的老师免费观看完整版| 久久精品人妻少妇| av播播在线观看一区| 久久久久精品久久久久真实原创| 国产精品av视频在线免费观看| 亚洲精品成人久久久久久| 在线观看av片永久免费下载| 亚洲欧美精品自产自拍| h日本视频在线播放| 久久鲁丝午夜福利片| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 午夜久久久久精精品| 亚洲精品国产av蜜桃| 又爽又黄无遮挡网站| 水蜜桃什么品种好| 禁无遮挡网站| 一级毛片我不卡| 嫩草影院入口| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 亚洲va在线va天堂va国产| 一区二区三区乱码不卡18| 亚洲国产色片| 免费看日本二区| av线在线观看网站| 亚洲人成网站高清观看| 国产激情偷乱视频一区二区| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 精品人妻一区二区三区麻豆| 男女那种视频在线观看| 麻豆成人av视频| 免费看不卡的av| 亚洲性久久影院| 黄色一级大片看看| 日本免费在线观看一区| 国产爱豆传媒在线观看| 大香蕉久久网| 永久网站在线| 男女啪啪激烈高潮av片| 91av网一区二区| 精品国产三级普通话版| 精品不卡国产一区二区三区| 免费观看av网站的网址| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲,欧美,日韩| 欧美+日韩+精品| av在线亚洲专区| 成人午夜精彩视频在线观看| 久久鲁丝午夜福利片| 国产熟女欧美一区二区| 久久精品人妻少妇| 欧美精品一区二区大全| 国产av码专区亚洲av| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 大陆偷拍与自拍| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲精品亚洲一区二区| ponron亚洲| 91av网一区二区| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 丰满人妻一区二区三区视频av| 欧美日韩精品成人综合77777| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 听说在线观看完整版免费高清| 免费观看性生交大片5| 69av精品久久久久久| 久久久色成人| 亚洲久久久久久中文字幕| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 精品久久久久久久久久久久久| 99热这里只有是精品在线观看| 免费在线观看成人毛片| 插阴视频在线观看视频| 久久精品久久精品一区二区三区| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国国产精品蜜臀av免费| 精品久久久久久电影网| 亚州av有码| 嫩草影院新地址| 日本一二三区视频观看| 国产精品一二三区在线看| 天堂影院成人在线观看| kizo精华| av天堂中文字幕网| 日韩人妻高清精品专区| 亚洲精品一二三| 亚洲在线观看片| 国产高清三级在线| 午夜免费激情av| 国产精品熟女久久久久浪| 亚洲精品日本国产第一区| 国产麻豆成人av免费视频| a级毛色黄片| 欧美 日韩 精品 国产| 极品少妇高潮喷水抽搐| 午夜免费观看性视频| 99re6热这里在线精品视频| 国产成人精品久久久久久| 国产极品天堂在线| av免费在线看不卡| 亚洲av一区综合| 好男人在线观看高清免费视频| 国产精品久久久久久久久免| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 亚洲经典国产精华液单| 三级国产精品欧美在线观看| 久久99精品国语久久久| 亚洲av成人av| 欧美性感艳星| 好男人在线观看高清免费视频| 水蜜桃什么品种好| 国产在视频线在精品| 国产午夜精品论理片| 亚洲第一区二区三区不卡| 日韩中字成人| 免费观看a级毛片全部| 91av网一区二区| 亚洲av成人av| 午夜福利在线观看吧| 久久99热6这里只有精品| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产又色又爽无遮挡免| 国产伦精品一区二区三区四那| 午夜免费男女啪啪视频观看| 搞女人的毛片| 久久热精品热| 久久久久精品久久久久真实原创| 亚洲18禁久久av| 久久久精品94久久精品| 插阴视频在线观看视频| 亚洲国产成人一精品久久久| 亚洲无线观看免费| 中文天堂在线官网| 黄片wwwwww| 日本wwww免费看| 久久久精品欧美日韩精品| 午夜福利视频精品| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲天堂国产精品一区在线| 大香蕉久久网| av在线观看视频网站免费| 日日撸夜夜添| av在线播放精品| 久久人人爽人人片av| 中文在线观看免费www的网站| www.av在线官网国产| freevideosex欧美| 国产成人精品婷婷| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产单亲对白刺激| 免费av观看视频| 我的老师免费观看完整版| 搡女人真爽免费视频火全软件| 亚洲成人中文字幕在线播放| 亚洲欧洲国产日韩| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 91精品国产九色| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 免费少妇av软件| 精品一区二区三卡| 三级经典国产精品| 街头女战士在线观看网站| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 好男人在线观看高清免费视频| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 黄色配什么色好看| 中文欧美无线码| 亚洲伊人久久精品综合| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 69av精品久久久久久| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲欧美成人精品一区二区| 男女啪啪激烈高潮av片| 国产精品av视频在线免费观看| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产乱来视频区| 精品久久久噜噜| 麻豆成人av视频| 成人毛片60女人毛片免费| 在线观看一区二区三区| 精品一区在线观看国产| 最近手机中文字幕大全| 国产精品久久久久久久久免| 可以在线观看毛片的网站| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 欧美三级亚洲精品| 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 欧美丝袜亚洲另类| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 精品一区二区三区人妻视频| 日日撸夜夜添| 国产在视频线精品| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 联通29元200g的流量卡| 熟女电影av网| 亚洲av.av天堂| 一级毛片我不卡| 国产成人a区在线观看| 国产爱豆传媒在线观看| 国产精品福利在线免费观看| 免费看美女性在线毛片视频| 成人鲁丝片一二三区免费| 亚洲性久久影院| 国产一区二区三区av在线| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲av免费高清在线观看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 久久久久久国产a免费观看| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 真实男女啪啪啪动态图| 欧美+日韩+精品| 高清午夜精品一区二区三区| 国产三级在线视频| 日韩欧美三级三区| 精品久久久久久久末码| 国产乱人偷精品视频| 九九在线视频观看精品| 婷婷六月久久综合丁香| 一个人观看的视频www高清免费观看| 国产v大片淫在线免费观看| 一个人看视频在线观看www免费| 免费观看在线日韩| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 日日干狠狠操夜夜爽| 久久久久久久国产电影| 白带黄色成豆腐渣| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产视频内射| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 九色成人免费人妻av| 久99久视频精品免费| 内射极品少妇av片p| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | a级毛色黄片| 国内精品一区二区在线观看| 精品国产三级普通话版| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产大屁股一区二区在线视频| 欧美激情国产日韩精品一区| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 欧美日韩在线观看h| 亚洲欧洲日产国产| 六月丁香七月| 欧美极品一区二区三区四区| 联通29元200g的流量卡| 精品一区二区三区人妻视频| av免费观看日本| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 男人爽女人下面视频在线观看| 免费人成在线观看视频色| 日韩人妻高清精品专区| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 午夜福利成人在线免费观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 女人十人毛片免费观看3o分钟| 内地一区二区视频在线| 精品不卡国产一区二区三区| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 欧美zozozo另类| 亚洲美女搞黄在线观看| 内射极品少妇av片p| 最新中文字幕久久久久| 一二三四中文在线观看免费高清| 欧美3d第一页| 色5月婷婷丁香| 街头女战士在线观看网站| 听说在线观看完整版免费高清| 午夜激情福利司机影院| 国产午夜精品一二区理论片| 亚洲精品亚洲一区二区| 国产精品爽爽va在线观看网站| 久久久久性生活片| 亚洲无线观看免费| 亚洲国产精品sss在线观看| 日韩av在线大香蕉| 日本三级黄在线观看| 插逼视频在线观看| xxx大片免费视频| 三级毛片av免费| 久久久欧美国产精品| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 好男人视频免费观看在线| 色尼玛亚洲综合影院| 国产有黄有色有爽视频| 天堂√8在线中文| 成年免费大片在线观看| 91精品一卡2卡3卡4卡| 亚洲av成人精品一二三区| 日韩亚洲欧美综合| 日韩视频在线欧美| 国产精品一区二区在线观看99 | 国产不卡一卡二| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产午夜精品论理片| 在线免费观看的www视频| 亚洲国产精品成人久久小说| 啦啦啦韩国在线观看视频| 黄片无遮挡物在线观看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 午夜久久久久精精品| 男女啪啪激烈高潮av片| 一二三四中文在线观看免费高清| 免费黄频网站在线观看国产| 中文天堂在线官网| av一本久久久久| 亚洲精品456在线播放app| 国产老妇女一区| 色综合站精品国产| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国内精品美女久久久久久| 亚洲av一区综合| 别揉我奶头 嗯啊视频| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 午夜福利在线观看吧| 国产淫语在线视频| av国产免费在线观看| 国产精品熟女久久久久浪| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲精品久久午夜乱码| 久久精品夜色国产| 亚洲无线观看免费| 人人妻人人澡欧美一区二区| 日日摸夜夜添夜夜爱| 成年av动漫网址| 永久网站在线| 亚洲18禁久久av| 晚上一个人看的免费电影| 国产熟女欧美一区二区| 国国产精品蜜臀av免费| 精品久久久久久成人av| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 精品久久久噜噜| 日韩中字成人| av女优亚洲男人天堂| 少妇高潮的动态图| 国产黄a三级三级三级人| 欧美日韩亚洲高清精品| 边亲边吃奶的免费视频| 久久精品久久精品一区二区三区| 国产黄频视频在线观看| 亚洲精品成人久久久久久| 亚洲高清免费不卡视频| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 亚洲精品,欧美精品| 久久午夜福利片| 国产激情偷乱视频一区二区| 亚洲美女视频黄频| 亚洲欧美一区二区三区国产| 亚洲经典国产精华液单| 久久久久久国产a免费观看| 国产精品蜜桃在线观看| av网站免费在线观看视频 | 国产老妇伦熟女老妇高清| 色综合色国产| 一边亲一边摸免费视频| 亚洲精品中文字幕在线视频 | av黄色大香蕉| 中文欧美无线码| 日韩亚洲欧美综合| 黄色一级大片看看| 亚洲精品国产成人久久av| 国产色爽女视频免费观看| 深夜a级毛片| 婷婷色综合www| 在线播放无遮挡| 婷婷六月久久综合丁香| 熟女人妻精品中文字幕| 黄色一级大片看看| 国产黄a三级三级三级人| 亚洲av电影不卡..在线观看| 在线观看av片永久免费下载| 精品久久久久久久末码| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 男女下面进入的视频免费午夜| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲国产精品sss在线观看| 麻豆成人午夜福利视频| 波野结衣二区三区在线| 超碰av人人做人人爽久久| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | or卡值多少钱| 国产日韩欧美在线精品| 久久精品国产自在天天线| 久久久久性生活片| 国内精品一区二区在线观看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产免费视频播放在线视频 | 免费观看a级毛片全部| 国模一区二区三区四区视频| 国产成人一区二区在线| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产黄色视频一区二区在线观看| 国产精品一区二区在线观看99 | 最近手机中文字幕大全| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 最近视频中文字幕2019在线8| 亚洲在线自拍视频| 色综合亚洲欧美另类图片| 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲av国产av综合av卡| 老司机影院成人| 国产av码专区亚洲av| 一个人观看的视频www高清免费观看| 国产亚洲精品av在线| 色哟哟·www| 亚洲美女搞黄在线观看| 久久99蜜桃精品久久| 亚洲欧美一区二区三区国产| .国产精品久久| or卡值多少钱| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 少妇人妻一区二区三区视频| 免费观看的影片在线观看| 亚洲在久久综合| 日韩强制内射视频| 夜夜爽夜夜爽视频| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲精品国产av成人精品| 97超碰精品成人国产| 丰满人妻一区二区三区视频av| 日韩亚洲欧美综合| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产男人的电影天堂91| 日日啪夜夜爽| 看非洲黑人一级黄片| 久久人人爽人人片av| 永久免费av网站大全| 一区二区三区乱码不卡18| 国产毛片a区久久久久| 欧美一区二区亚洲| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 日韩三级伦理在线观看| 国产在线一区二区三区精| 日本午夜av视频| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产精品一区二区性色av| 亚洲综合精品二区| av天堂中文字幕网| 久久韩国三级中文字幕| 大香蕉久久网| 两个人视频免费观看高清| 欧美+日韩+精品| 国产精品女同一区二区软件| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国国产精品蜜臀av免费| 一级毛片aaaaaa免费看小| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲怡红院男人天堂| 午夜精品国产一区二区电影 | 女人十人毛片免费观看3o分钟| 麻豆成人av视频| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 嫩草影院入口| 欧美不卡视频在线免费观看| 久久6这里有精品| 少妇熟女aⅴ在线视频| 最近中文字幕高清免费大全6| 麻豆成人av视频| 一级二级三级毛片免费看| 日韩成人伦理影院| 偷拍熟女少妇极品色| 免费av观看视频| 国产视频首页在线观看| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 精品久久久久久久久av| 国产探花在线观看一区二区| 亚洲内射少妇av| 美女被艹到高潮喷水动态| 国产黄a三级三级三级人| 免费人成在线观看视频色| 亚洲自偷自拍三级| 日本一本二区三区精品| 97超视频在线观看视频| 国产高清三级在线| 亚洲精品色激情综合| 国产日韩欧美在线精品| 亚洲18禁久久av| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 天堂√8在线中文| 国产探花在线观看一区二区| 久久久久久久久大av| 久久久久久久久久久丰满| 26uuu在线亚洲综合色| 久久久久久久国产电影| 日韩伦理黄色片| av线在线观看网站| 亚洲av男天堂| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 我的女老师完整版在线观看| 又黄又爽又刺激的免费视频.| xxx大片免费视频| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 国产高清国产精品国产三级 | 日韩欧美三级三区| 亚洲人成网站高清观看| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 麻豆成人av视频| 久久精品久久精品一区二区三区| 少妇高潮的动态图| 亚洲精品影视一区二区三区av| 99视频精品全部免费 在线| 男插女下体视频免费在线播放| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产成人aa在线观看|