陳昕婷 林微微 陳建治
顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病是一類臨床癥狀表現(xiàn)為顳下頜關(guān)節(jié)區(qū)疼痛、異常關(guān)節(jié)音或伴有下頜運(yùn)動(dòng)障礙的疾病的總稱,人群中發(fā)病率為20%~40%,是口腔科常見病、多發(fā)病之一[1]。顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎是顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病的一種重要類型,是一類主要累及顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨、滑膜及軟骨下骨的以關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨骨質(zhì)改變?yōu)橹饕卣鞯钠髻|(zhì)性病變[2]。研究顯示,顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與軟骨細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥因子釋放和軟骨基質(zhì)減少密切相關(guān)[3]。綠原酸又名咖啡鞣酸,是由咖啡酸和奎尼酸形成的縮酚酸,為極性有機(jī)酸。綠原酸的生物活性廣泛,隨著研究的深入,許多新的藥效被陸續(xù)挖掘,包括抗感染、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抑菌等[4-5]。綠原酸能夠通過抑制NLRP3炎性復(fù)合體/核因子κB(NF-κB)通路發(fā)揮對(duì)關(guān)節(jié)炎的治療作用[6],但其作用機(jī)制尚不完全明了?;诖?,本研究采用不同濃度綠原酸干預(yù)白細(xì)胞介素1β(IL-1β)誘導(dǎo)的顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞損傷,分析綠原酸對(duì)軟骨細(xì)胞增殖、凋亡和炎癥因子釋放的影響,以探討綠原酸對(duì)顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的保護(hù)作用機(jī)制,現(xiàn)報(bào)道如下。
1.1 材料
1.1.1 細(xì)胞來源 取6周齡雄性SD大鼠購(gòu)自上海斯萊克公司,體重140~160g,由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物研究中心在25℃,空氣濕度65%的環(huán)境中統(tǒng)一喂養(yǎng)。采用胰蛋白酶消化法[7]獲取原代顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞,具體方法為戊巴比妥鈉麻醉下處死SD大鼠,75%乙醇消毒10min,在超凈臺(tái)中切取顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨,剪成小塊并碾磨,在37℃胰蛋白酶溶液中培養(yǎng)2h;倒掉胰蛋白酶消化液,使用磷酸鹽緩沖液沖洗,然后在37℃的0.2%膠原酶溶液中培養(yǎng)過夜;消化后以800r/min離心15min收集原代顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞。
1.1.2 主要試劑 含量≥98%的綠原酸購(gòu)自杭州諾揚(yáng)生物技術(shù)有限公司;重組人IL-1β購(gòu)自上海生工生物科技有限公司;DMEM/F-12培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;CCK-8試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;磷酸鹽緩沖液和胰蛋白酶購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司;TRIzol購(gòu)自美國(guó)Promega公司;RNA擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司;PCR引物購(gòu)自上海生工生物科技有限公司;蛋白提取試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司;兔抗人Wnt-5A、Ror2和GAPDHL均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司;HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。
1.1.3 主要儀器 PCR擴(kuò)增儀(0900544s型)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司;恒溫振蕩器(THZ-C-1型)購(gòu)自蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;臺(tái)式冷凍離心機(jī)(5804R型)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司;離心濃縮儀(TDZ4-WS型)購(gòu)自長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司;低溫超速離心機(jī)(CT15RE型)購(gòu)自日本Himac公司;低溫儲(chǔ)存箱系列(HYC-360型)購(gòu)自中國(guó)Haier公司;超低溫冰箱(MDF-U54V型)購(gòu)自日本Panasonic公司;光學(xué)顯微鏡(SOIF、XSP-ZCA型)購(gòu)自上海光學(xué)儀器工廠;恒溫培養(yǎng)箱(SPX-250B-Z型)購(gòu)自上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司;蛋白電泳儀(Powerpmac 043BR80551型)購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司;高速離心機(jī)(5424型)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司;流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司。
1.2 方法
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與干預(yù) 軟骨細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基中于37℃、5%二氧化碳條件下在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將軟骨細(xì)胞分為模型組、實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組。模型組細(xì)胞采用含10ng/ml IL-1β的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞采用含10ng/ml IL-1β和不同濃度綠原酸(10、20、40、80 和 160μmol/L)的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。
1.2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 采用CCK-8法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的軟骨細(xì)胞,不同組的細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種到96孔培養(yǎng)板中,每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,在37℃、5%二氧化碳條件下分別培養(yǎng)24、48h,每孔加入10μl的CCK-8溶液,在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2h后于酶標(biāo)儀中測(cè)定細(xì)胞在450nm的OD值。
1.2.3 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 采用流式細(xì)胞術(shù)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的軟骨細(xì)胞,不同組的細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種到12孔板中,胰蛋白酶消化收集培養(yǎng)48 h后細(xì)胞,磷酸鹽緩沖液洗滌后制備成細(xì)胞懸液,然后加入10μl Annexin V-FITC和5μl碘化丙啶染色液,輕輕混勻,室溫避光孵育20 min,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。
1.2.4 腫瘤壞死因子 α(TNF-α)、IL-6、基質(zhì)金屬蛋白酶 3(MMP-3)、MMP-13、Wnt-5A 和 Ror2 mRNA 表達(dá)檢測(cè) 采用qRT-PCR法。不同組細(xì)胞培養(yǎng)48h后,采用TRIzol試劑從細(xì)胞中提取總RNA,通過紫外分光光度儀測(cè)定OD260/OD280值,取用OD260/OD280值在1.8~2.0的樣本。采用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后采用RNA擴(kuò)增試劑盒通過實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增cDNA。以GAPDH為靶基因內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計(jì)算靶基因的相對(duì)表達(dá)水平。
1.2.5 Wnt-5A和Ror2蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法。不同組細(xì)胞培養(yǎng)48h后,采用蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞中的總蛋白,然后用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。每孔加入50μg的待測(cè)蛋白于SDS-PAGE凝膠,110V電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜,5%脫脂奶粉37℃封閉1h,分別加入兔抗人Wnt-5A、Ror2和GAPDH一抗4℃孵育過夜,TBST洗膜 3×10min,二抗 37℃ 孵育1 h,TBST洗膜3×30min,ECL顯影。運(yùn)用Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值,以GAPDH作內(nèi)參,計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示,多組比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 綠原酸對(duì)細(xì)胞增殖的影響 采用IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷后,模型組、實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在24h和48h的增殖能力均較對(duì)照組明顯減弱,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。在培養(yǎng)24h后,40μmol/L實(shí)驗(yàn)組較模型組細(xì)胞增殖能力增強(qiáng),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖1a。在培養(yǎng)48h后,20、40和80μmol/L實(shí)驗(yàn)組較模型組細(xì)胞增殖能力均增強(qiáng),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見圖1b。因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選用20、40和80μmol/L的綠原酸對(duì)軟骨細(xì)胞干預(yù)48h。
2.2 綠原酸對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 采用IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷后,模型組、實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組均明顯升高,但實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率低于模型組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),即 20、40和80μmol/L綠原酸均能明顯抑制軟骨細(xì)胞凋亡,見圖2。
圖1 綠原酸對(duì)細(xì)胞增殖的影響(a:培養(yǎng)24h的增殖能力比較;b:培養(yǎng)48h的增殖能力比較)
圖2 綠原酸對(duì)細(xì)胞凋亡的影響(a:對(duì)照組細(xì)胞流式圖;b:模型組細(xì)胞流式圖;c:20μmol/L實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞流式圖;d:40μmol/L實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞流式圖;e:80μmol/L實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞流式圖;f:不同組軟骨細(xì)胞凋亡率比較)
2.3 綠原酸對(duì)細(xì)胞炎癥因子釋放的影響 采用IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷后,模型組、實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞炎癥因子TNF-α和IL-6的mRNA表達(dá)水平均較對(duì)照組明顯升高,MMP-3和MMP-13的mRNA表達(dá)水平亦均較對(duì)照組明顯升高,但實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞TNF-α和IL-6的mRNA表達(dá)水平均低于模型組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。即20、40和80μmol/L綠原酸均能明顯抑制軟骨細(xì)胞TNF-α的mRNA表達(dá)水平,40和80μmol/L綠原酸均能明顯抑制軟骨細(xì)胞IL-6、MMP-3mRNA表達(dá)水平(均P<0.05)。40μmol/L實(shí)驗(yàn)組軟骨細(xì)胞較模型組MMP-13的mRNA表達(dá)水平明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖 3。
圖3 綠原酸對(duì)細(xì)胞炎癥因子釋放的影響(a:TNF-α mRNA的表達(dá)水平比較;b:IL-6 mRNA的表達(dá)水平比較;c:MMP-3 mRNA的表達(dá)水平比較;d:MMP-13 mRNA的表達(dá)水平比較)
2.4 綠原酸對(duì)細(xì)胞Wnt-5A/Ror2信號(hào)通路的影響 采用IL-1β誘導(dǎo)顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞損傷后,模型組、實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中Wnt-5A、Ror2的mRNA和蛋白表達(dá)水平均較對(duì)照組明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。20、40和80μmol/L實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞 Wnt-5A、Ror2 mRNA 和蛋白的表達(dá)水平均低于模型組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均 P<0.05),見圖 4。
顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎是一種以關(guān)節(jié)軟骨損傷為主要特征,伴有滑膜及軟骨下骨組織改變的關(guān)節(jié)退行性疾病,其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增多趨勢(shì),容易復(fù)發(fā),嚴(yán)重影響患者的口腔功能和生活質(zhì)量[8]。目前對(duì)顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的常規(guī)治療效果不理想,治療方法多以保守治療為主,包括服用非甾體類抗生素、局部理療、關(guān)節(jié)腔注射藥物等[9]。目前采用中藥治療顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的研究尚少。
IL-1是一種重要的炎癥因子,由IL-1α與IL-1β兩種蛋白質(zhì)組成,可與IL-1受體結(jié)合,從而激活下游炎癥通路。其作為炎癥的始動(dòng)因子,在軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡過程中起到關(guān)鍵作用[10]。IL-1β可能通過刺激TNF-α、IL-6、ICAM-1等炎癥因子的分泌和抑制膠原蛋白、組織金屬蛋白酶抑制因子等的合成來干擾關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞代謝,顯著抑制軟骨細(xì)胞合成基質(zhì),使軟骨細(xì)胞變性及細(xì)胞外基質(zhì)降解,引發(fā)關(guān)節(jié)炎癥和破壞,是造成顳下頜關(guān)節(jié)器質(zhì)性損害的一種重要炎癥介質(zhì)[11]。本研究采用IL-1β誘導(dǎo)顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞損傷,結(jié)果顯示IL-1β能夠明顯抑制軟骨細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和炎癥因子的釋放。這提示本研究IL-1β誘導(dǎo)顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞損傷造模成功。
研究顯示,綠原酸可以降低關(guān)節(jié)液中IL-1β、TNF-α和MMP-3含量以及MMP-3酶活性,對(duì)關(guān)節(jié)軟骨損傷具有一定的保護(hù)作用[12]。綠原酸可以提高內(nèi)皮細(xì)胞線粒體膜電位、上調(diào)Bcl-2和下調(diào)Caspase,降低細(xì)胞凋亡率,對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞起保護(hù)作用[13]。同時(shí)綠原酸能夠抑制軟骨樣細(xì)胞凋亡,降低細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平,穩(wěn)定細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)來保護(hù)線粒體膜電位,促進(jìn)凋亡抑制基因Bcl-2和抑制半胱氨酸蛋白酶表達(dá)有關(guān)[14]。本研究結(jié)果顯示不同濃度綠原酸干預(yù)IL-1β誘導(dǎo)的顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞損傷后,綠原酸能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖,抑制軟骨細(xì)胞凋亡,抑制 TNF-α、IL-6、MMP-3 和 MMP-13 的表達(dá)水平。這提示綠原酸在顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡和炎癥因子釋放的作用。
圖4 綠原酸對(duì)細(xì)胞Wnt-5A/Ror2信號(hào)通路的影響(a:Wnt-5A mRNA的表達(dá)水平比較;b:Ror2 mRNA的表達(dá)水平比較;c:Wnt-5A蛋白的表達(dá)水平;d:Ror2蛋白的表達(dá)水平;e:Wnt-5A和Ror2蛋白電泳圖)
基質(zhì)金屬蛋白酶是一組鋅依賴性的對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)分解代謝起催化作用的蛋白水解酶,能降解幾乎所有的軟骨細(xì)胞外基質(zhì),在軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解過程中發(fā)揮重要作用[15]。成纖維細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等多種細(xì)胞可分泌基質(zhì)金屬蛋白酶,基質(zhì)金屬蛋白酶以無活性酶原形式出胞,無活性酶原能被多種炎癥因子激活,從而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解的發(fā)生[16]。本研究結(jié)果顯示,綠原酸能夠明顯抑制MMP-3和MMP-13的表達(dá),這提示綠原酸能夠抑制顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎中軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解。
Wnt信號(hào)通路與軟骨細(xì)胞的分化發(fā)育密切相關(guān),是較早發(fā)現(xiàn)的與顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生有關(guān)的信號(hào)通路之一[17]。研究發(fā)現(xiàn)Wnt-5A/Ror2信號(hào)通路激活可以上調(diào)軟骨細(xì)胞 MMP-1、MMP-3、MMP-9和 MMP-13的表達(dá),從而參與骨關(guān)節(jié)炎的軟骨破壞過程[18]。Wnt-5A可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨方向分化,通過下調(diào)Runx2、Cxcl12的表達(dá)和Rankl/Opg比例,進(jìn)而抑制細(xì)胞的成骨分化[19]。本研究結(jié)果顯示,不同濃度的綠原酸均能夠降低Wnt-5A、Ror2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平,提示綠原酸能抑制IL-1β誘導(dǎo)的顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中Wnt-5A/Ror2信號(hào)通路的激活,進(jìn)而抑制軟骨細(xì)胞的損傷。
綜上所述,綠原酸或通過抑制Wnt-5A/Ror2信號(hào)通路調(diào)控IL-1β誘導(dǎo)的顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖、凋亡和炎癥因子釋放。綠原酸或可作為治療顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的藥物。