VEGF、MMP-9及TIMP-1在Rb患兒中的臨床檢測價值

周苗苗

(皖西衛(wèi)生職業(yè)學院，安徽 六安 237005)

Rb主要來源于光感受器前體細胞，屬于眼內(nèi)惡性腫瘤之一，好發(fā)于3歲以下的嬰幼兒，可單眼、雙眼先后或者雙眼同時罹患[1-3]。Rb患者的臨床癥狀較為復雜，主要表現(xiàn)為水腫、結(jié)膜內(nèi)充血、虹膜新生血管、角膜水腫、眼壓升高、斜視及玻璃體混濁等[4]。Rb易出現(xiàn)遠處或顱內(nèi)轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，嚴重危及了患兒的身體健康及生命安全，故及早診治Rb患兒可有效降低死亡率并改善其預后，提高治愈率[5-6]。MMP-9與多種惡性腫瘤的發(fā)生及病情進展關(guān)系密切，但在我國Rb組織中的表達水平的相關(guān)報道不多[7]。TIMP-1與MMP-9在神經(jīng)母細胞瘤癌細胞侵襲及轉(zhuǎn)移期間具有突出的拮抗作用，故聯(lián)合檢測TIMP-1與MMP-9可準確地顯示出腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移方向，并為此類患者的針對性治療方案的制定提供可靠的理論參考[8]。VEGF與腫瘤的血管形成相關(guān)，其在人體正常組織內(nèi)及各種動物、腫瘤細胞株內(nèi)均有表達，對腫瘤心血管的形成、生長及轉(zhuǎn)移均具有一定的促進作用[9]。本研究旨在通過觀察分析VEGF、MMP-9及TIMP-1在Rb患兒中的表達水平，以期探析上述三種指標在Rb患兒中的檢測價值，給Rb患兒的臨床診治提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象分析2007年4月至2018年4月間在我院接受診斷治療并手術(shù)切除的47例Rb標本。入選標準：(1)年齡4個月～5歲，臨床資料完整者；(2)經(jīng)臨床檢查確診為Rb者，標本經(jīng)福爾馬林固定并包埋于石蠟中；(3)術(shù)前均未接受任何放化療治療。排除標準：(1)唐氏綜合征患兒；(2)存在先天性心臟病合并癥的患兒。根據(jù)菊形團排列情況，將入選者分為分化型(18例)和未分化型(29例)兩組。本研究經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會批準，患者及其家屬知情同意此次研究并簽署相關(guān)知情同意書。

1.2 研究方法(1)主要試劑：廣州深達生物制品技術(shù)有限公司生產(chǎn)的兔抗人VEGF多克隆抗體(產(chǎn)品編號SP0810)、美國SantaCruz公司生產(chǎn)的抗人MMP-9多克隆抗體(產(chǎn)品編號SC.6840)、武漢博士德公司生產(chǎn)的抗人TIMP-1多克隆抗體(產(chǎn)品編號BA1368)、上海博谷生物科技有限公司生產(chǎn)的蘇木素、北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)的DAB顯色劑。(2)VEGF、MMP-9及TIMP-1檢測方法及結(jié)果判定標準：免疫組化PV6000二步法。采用PBS代替一抗作陰性對照，將已知陽性乳癌組織切片作本次研究的陽性對照。以細胞質(zhì)或細胞膜內(nèi)有明顯棕黃色或黃色顆粒視作MMP-9和TIMP-1陽性著色，根據(jù)Shimizu評分標準對結(jié)果實施半定量積分評判：①0分：無陽性細胞數(shù)；②1分，陽性細胞數(shù)<1/3；③2分，陽性細胞數(shù)1/3～2/3；④3分，陽性細胞數(shù)>2/3。每張切片的陽性細胞著色情況判定標準為：①0分：無著色；②1分，黃色；③2分，棕黃色；④3分，棕褐色。陽性細胞數(shù)與陽性細胞著色情況的積分和可視作MMP-9和TIMP-1結(jié)果評判標準：0～2分，陰性(-)；3分，弱陽性(+)；4～5分，強陽性(++)[10]。以細胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒狀染色作為VEGF染色陽性標準，每張切片的陽性細胞染色強度評分標準：0分，陰性(-)；1分，弱陽性(+)；2分，中等陽性(++)；3分，強陽性(+++)，陽性細胞百分數(shù)評判標準：無陽性細胞，0分；≤25%陽性細胞，1分；26%～50%陽性細胞，2分；>50%陽性細胞，3分。陽性細胞染色強度與百分率的積分之和可視作VEGF陰陽性表達標準：0～2分，陰性(-)；3～4分，弱陽性(+)；5～6分，強陽性(++)[11]。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0軟件處理與分析數(shù)據(jù)。定性變量以[n(%)]形式表示，組間比較采用卡方檢驗；定量變量以“均數(shù)±標準差”形式表示，組間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Rb患兒的組織學表現(xiàn)患兒眼部腫瘤細胞內(nèi)存在大面積致密的核深染，且胞漿稀少，主要由較多呈核分裂相的小圓細胞組成，表現(xiàn)為巢狀及梁狀結(jié)構(gòu)，有些區(qū)域可見花瓣狀結(jié)構(gòu)(真菊形團)和F-W菊形團。清晰可見廣泛鈣化及壞死的腫瘤細胞。見圖1。

圖1 RB組織形態(tài)學表現(xiàn)(HE×200)

圖2 MMP-9、TIMP-1、VEGF在RB中的表達

2.2 VEGF、MMP-9及TIMP-1的陽性表達在Rb患兒中VEGF、MMP-9及TIMP-1的陽性表達主要出現(xiàn)于腫瘤細胞質(zhì)內(nèi)，且呈棕黃色顆粒狀。其中TIMP-1在成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞上也呈陽性表達。檢測結(jié)果顯示，Rb患兒中VEGF的陽性表達率為68.1%(32/47)；MMP-9的陽性表達率為55.3%(26/47)；TIMP-1的陽性表達率為19.1%(9/47)，提示Rb患兒TIMP-1的陽性表達率明顯低于VEGF、MMP-9(P<0.05)。見圖2。

2.3 VEGF、MMP-9及TIMP-1的陽性表達與Rb組織分化程度的關(guān)系分化型Rb組織內(nèi)VEGF、MMP-9的陽性表達率明顯低于未分化型(P<0.05)；分化型與未分化型Rb組織內(nèi)的TIMP-1陽性表達率無明顯統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表1。

表1 VEGF、MMP-9及TIMP-1的陽性表達與Rb組織分化程度的關(guān)系

2.4 VEGF、MMP-9及TIMP-1陽性表達與Rb組織視神經(jīng)浸潤的關(guān)系存在視神經(jīng)浸潤者的VEGF及MMP-9陽性率明顯較無視神經(jīng)浸潤者高(P<0.05)；視神經(jīng)浸潤者與無視神經(jīng)浸潤者的TIMP-1陽性率無明顯統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表2。

表2 VEGF、MMP-9及TIMP-1陽性表達與Rb組織視神經(jīng)浸潤的關(guān)系

2.5 Rb組織內(nèi)VEGF、MMP-9及TIMP-1的關(guān)系相關(guān)性分析結(jié)果顯示，Rb組織內(nèi)TIMP-1與VEGF、MMP-9表達無顯著相關(guān)性(r=0.234，0.147；P>0.05)；VEGF與MMP-9存在顯著正相關(guān)性(r=0.561；P<0.05)。見表3。

表3 Rb組織內(nèi)VEGF、MMP-9及TIMP-1的關(guān)系

3 討論

目前我國Rb患兒發(fā)生率呈顯著上升趨勢，嚴重影響了我國嬰幼兒的身體健康及生命安全[12-13]。VEGF在所有血管生成促進因子中表現(xiàn)得最為突出，對血管內(nèi)皮細胞生長及血管滲透性增強均具有促進作用，很多惡性腫瘤患者體內(nèi)均存在VEGF表達，VEGF在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及其浸潤轉(zhuǎn)移過程中均具有極其重要的促進作用[14]。Rb的侵襲轉(zhuǎn)移過程較為復雜，癌細胞及其原發(fā)病灶脫落后必須突破細胞外基質(zhì)(ECM)屏障，方可進入淋巴系統(tǒng)及血循環(huán)體系內(nèi)向遠處轉(zhuǎn)移或向周圍組織浸潤[15]。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)為內(nèi)源性蛋白水解酶，可降解ECM內(nèi)各類蛋白成分，對腫瘤周圍突破ECM屏障具有顯著地促進作用，與腫瘤組織的轉(zhuǎn)移及浸潤關(guān)系密切[16]。金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMPs)為MMPs特異性抑制物，可有效阻礙MMPs降解ECM過程，對腫瘤組織的轉(zhuǎn)移及侵襲具有明顯地抑制作用。在ECM代謝過程中MMPs與TIMPs的相互作用在腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移及侵襲過程中扮演了重要角色[17]。

據(jù)報道，翼狀胬肉組織內(nèi)TIMP-1與MMP-2、MMP-9呈明顯高表達狀，特別是直接與Bowman層相鄰的上皮細胞，其免疫染色能力更強[18]。另有學者發(fā)現(xiàn)，MMPs參與了糖尿病角膜的病變過程[19]。相關(guān)研究結(jié)果顯示，Rb腫瘤組織內(nèi)TIMPs表達下調(diào)、MMPs表達上調(diào)，所有細胞的TIMP-1與TIMP-2染色基本均呈陰性，大量腫瘤細胞內(nèi)MMP-2、MMP-7、MMP-9染色均為陽性[20]。本研究結(jié)果顯示，分化型Rb組織內(nèi)MMP-9的陽性表達率明顯低于未分化型(P<0.05)；分化型與未分化型Rb組織內(nèi)的TIMP-1陽性表達率無明顯統(tǒng)計學差異(P>0.05)，考慮原因可能是MMP-9可降解細胞外基質(zhì)中的Ⅳ及Ⅴ型膠原等成分，打破基底膜，并清除細胞瘤浸潤及轉(zhuǎn)移中的首要障礙，且視網(wǎng)膜母細胞瘤侵襲及轉(zhuǎn)移過程中MMP-9與TIMP-1具有拮抗作用。此外，存在視神經(jīng)浸潤者的MMP-9陽性率明顯較無視神經(jīng)浸潤者高(P<0.05)；視神經(jīng)浸潤者與無視神經(jīng)浸潤者的TIMP-1陽性率無明顯統(tǒng)計學差異(P>0.05)，Rb組織內(nèi)TIMP-1與VEGF、MMP-9表達無顯著相關(guān)性(P>0.05)，說明Rb腫瘤細胞內(nèi)TIMP-1與MMP-9表達失衡，在Rb組織的分化及腫瘤浸潤過程中高表達的MMP-9具有重要的促進作用，Rb組織內(nèi)的新生血管的生成與TIMP-1無關(guān)。此外，分化型Rb組織內(nèi)VEGF的陽性表達率明顯低于未分化型(P<0.05)，存在視神經(jīng)浸潤者的VEGF陽性率明顯較無視神經(jīng)浸潤者高(P<0.05)，Rb組織內(nèi)VEGF與MMP-9存在顯著正相關(guān)性(P<0.05)，說明MMP-9可以上調(diào)VEGF陽性表達，VEGF對腫瘤新血管的形成具有明顯地促進作用，有助于Rb組織內(nèi)形成新生血管，在細胞瘤的生長轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重要作用。

總之，高表達狀的VEGF與MMP-9在Rb患兒腫瘤細胞的分化及其視神經(jīng)浸潤過程中發(fā)揮了重要作用，且對其新生血管的形成起一定的促進作用，為臨床Rb患兒的診治提供了一定的理論依據(jù)。