黃葵素對(duì)1型糖尿病大鼠血清肌酐、尿素及尿微量白蛋白的影響

任 夢(mèng)，連 續(xù)，王佳鑫，成 羽

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157011)

糖尿病腎臟病(DKD)是糖尿病患者常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，也是發(fā)達(dá)國(guó)家和發(fā)展中國(guó)家終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)的主要病因[1]。其病理生理學(xué)復(fù)雜，尚未完全闡明，DKD的一個(gè)典型特征是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)蛋白在腎小球和腎小管間質(zhì)中過(guò)度沉積，最終導(dǎo)致腎小球硬化和間質(zhì)纖維化[2]。黃葵素為黃蜀葵花的主要成分[3]，古籍記載其具有清熱利濕、消腫解毒的功效，現(xiàn)代相關(guān)文獻(xiàn)也表明其具有對(duì)抗腎臟纖維化的作用[4]。相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明其具有延緩DKD進(jìn)展的作用[5]，臨床試驗(yàn)也進(jìn)一步印證了其有效延緩腎病進(jìn)展的作用[6]。本實(shí)驗(yàn)采用T1DM大鼠作為模型，觀察黃葵素對(duì)大鼠腎臟相關(guān)指標(biāo)的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物SPF級(jí)SD大鼠，體重(205±10)g，購(gòu)置于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(遼)2015-0001。

1.2 藥品與試劑黃葵素，江蘇蘇中藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司贈(zèng)送；鏈脲佐菌素，規(guī)格：每瓶1g，美國(guó)sigma公司生產(chǎn)。

1.3 主要儀器血糖儀，羅氏公司生產(chǎn)；電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司生產(chǎn)；切片機(jī)，德國(guó)leica公司生產(chǎn)；顯微鏡，美國(guó)leica生產(chǎn)；生化分析儀，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司生產(chǎn)。

1.4 T1DM大鼠模型的建立將30只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為3組：空白組(n=10)、模型組(n=10)、實(shí)驗(yàn)組(n=10)。參考相關(guān)文獻(xiàn)造模方法[7-8]，將鏈脲佐菌素完全溶解于檸檬酸緩沖液中并過(guò)濾，在禁食不禁水12h的前提下，給予模型組及實(shí)驗(yàn)組大鼠鏈脲佐菌素腹腔注射，劑量為50mg/kg。分別在注射后72h、96h、120h時(shí)，對(duì)造模大鼠進(jìn)行血糖檢測(cè)，若血糖值均大于16.7mmol/L視為造模成功。

1.5 給藥方式以灌胃的方式給藥。將黃葵素溶于適量蒸餾水中，根據(jù)相關(guān)臨床試驗(yàn)[9]，取黃葵素最佳有效劑量，再根據(jù)人和動(dòng)物間按體表面積折算的等效劑量比值換算方法[10]，每天給予實(shí)驗(yàn)組大鼠0.7g/kg體質(zhì)量的黃葵素灌胃，空白組和模型組大鼠每天給予等容量的蒸餾水灌胃，連續(xù)4周。

1.6 樣本的采集每周對(duì)各組大鼠進(jìn)行血糖檢測(cè)(禁食不禁水12h)，并對(duì)各組大鼠進(jìn)行尿液采集，檢測(cè)尿微量白蛋白的水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)各組大鼠進(jìn)行摘眼球取血，離心后取上層血清，保存至-80℃冰箱中，待測(cè)大鼠的相關(guān)生化指標(biāo)；分離各組大鼠腎臟組織，放入4%甲醛中，石蠟包埋，制作切片供形態(tài)觀察。

1.7 生物化學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)應(yīng)用生化分析儀對(duì)各組大鼠進(jìn)行血清Cr、UN、CysC以及UMALB等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。

1.8 蘇木精-伊紅染色(HE染色)嚴(yán)格按照HE染色步驟，對(duì)各組大鼠腎臟組織切片進(jìn)行HE染色，顯微鏡下對(duì)比觀察腎臟組織病理改變情況。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 25.0版本對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠狀態(tài)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，除空白組大鼠一般狀態(tài)較實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)無(wú)明顯變化外，其余組大鼠的一般狀態(tài)出現(xiàn)了明顯的不同，且隨實(shí)驗(yàn)進(jìn)程的推進(jìn)，差異越發(fā)明顯。其中，模型組及實(shí)驗(yàn)組大鼠均出現(xiàn)了明顯消瘦，毛發(fā)暗淡無(wú)光澤，并出現(xiàn)了多飲、多食、多尿，精神萎靡，行動(dòng)遲緩，反應(yīng)遲鈍，以模型組較為嚴(yán)重。

2.2 各組大鼠血清Cr、UN及CysC的水平經(jīng)過(guò)4周的黃葵素干預(yù)，與空白組相比，模型組大鼠的血清Cr、UN、CysC水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠血清的Cr、UN、CysC水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清Cr、UN及CysC的比較

注：與空白組相比，*P<0.01;與模型組相比，**P<0.01

2.3 各組大鼠UMALB的檢測(cè)結(jié)果實(shí)驗(yàn)中對(duì)實(shí)驗(yàn)組大鼠進(jìn)行黃葵素灌胃干預(yù)，每周對(duì)各組大鼠進(jìn)行尿液采集，檢測(cè)UMALB水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)各組大鼠4次的UMALB平均值進(jìn)行了對(duì)比，空白組、模型組和實(shí)驗(yàn)組大鼠的UMALB檢測(cè)結(jié)果列于表2中。與空白組相比，模型組大鼠UMALB水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠UMALB水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，詳見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠UMALB水平的比較

注：與空白組相比，*P<0.01;與模型組相比，**P<0.01

2.4 黃葵素對(duì)T1DM大鼠腎組織病理形態(tài)的影響HE染色結(jié)果可見(jiàn)，光鏡下空白組大鼠腎臟組織整體結(jié)構(gòu)規(guī)整，腎小球形態(tài)、比例正常，未見(jiàn)異常結(jié)構(gòu)及細(xì)胞；模型組大鼠腎臟組織形態(tài)明顯不同，整體結(jié)構(gòu)較混亂，細(xì)胞排列不規(guī)則，腎小球變形且有萎縮現(xiàn)象，腎小球囊腔間隙變大；實(shí)驗(yàn)組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)較規(guī)則，腎小球形態(tài)、比例基本正常，與空白組觀察結(jié)果接近。具體如圖1所示。

3 討論

我國(guó)為糖尿病大國(guó)，DKD在糖尿病并發(fā)癥中所占比例極高，對(duì)糖尿病患者的生命造成了極大的威脅[11]。DKD的最終病理改變?yōu)槟I臟組織纖維化，直至腎功完全喪失，結(jié)局為終身人工腎替代治療或腎臟移植，患者承受著巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神壓力。DKD在發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中可通過(guò)相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)來(lái)評(píng)估病情，血液生化指標(biāo)Cr、UN、CysC可提示腎功狀態(tài)，UMALB為腎臟損傷早期較靈敏的指標(biāo)之一[12]，本實(shí)驗(yàn)即通過(guò)檢測(cè)大鼠以上指標(biāo)證明了黃葵素對(duì)于腎功的保護(hù)作用。

有關(guān)于黃葵素的實(shí)驗(yàn)研究已有多年，相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究[13-14]已證明了黃葵膠囊對(duì)慢性腎功能衰竭大鼠腎小管間質(zhì)纖維化的保護(hù)作用及其對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)組大鼠血清Cr、UN、CysC明顯低于模型組，這些腎功相關(guān)指標(biāo)結(jié)果也表明了黃葵對(duì)腎臟的保護(hù)作用。黃葵的主要成分為黃酮類化合物單體，而槲皮素作為黃酮類成分之一，有著重要的藥用價(jià)值[15-16]，已有研究[17]表明，槲皮素有阻止腎小球肥大的作用，對(duì)減少蛋白尿的排泄有益，從而保護(hù)了腎功，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)黃葵素在T1DM大鼠上的應(yīng)用可知，黃葵素可明顯改善T1DM大鼠的腎功，并降低尿微量白蛋白，同時(shí)HE染色結(jié)果也可看出，黃葵素具有延緩T1DM大鼠腎臟病變的作用，延緩DKD的發(fā)生發(fā)展。

黃葵素治療DKD的相關(guān)實(shí)驗(yàn)及其在臨床上的應(yīng)用已有多年，但諸多情況都與其他治療手段同時(shí)進(jìn)行，本實(shí)驗(yàn)排除降糖治療，未對(duì)T1DM大鼠采取任何降糖措施，也未同時(shí)應(yīng)用其他藥物，證明了黃葵素獨(dú)立于其他治療外的保護(hù)腎功的作用。從另一方面來(lái)說(shuō)，黃葵在臨床上的應(yīng)用大多始于糖尿病患者出現(xiàn)臨床癥狀或相關(guān)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)明顯異常時(shí)，但到目前為止還沒(méi)有診斷工具可以預(yù)測(cè)哪些糖尿病患者在出現(xiàn)任何損傷之前會(huì)發(fā)展為DKD，病理性腎損傷僅憑臨床和實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)也是很難預(yù)測(cè)的[18]，故本實(shí)驗(yàn)從糖尿病大鼠成模即開(kāi)始應(yīng)用黃葵素進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果證明其有很好的預(yù)防、延緩DKD的效果，但其相關(guān)作用機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。