氯喹對雄性克羅恩病模型小鼠腸炎的治療作用與機制

朱玉可，徐子龍，何逸凡，周昌旻，沈夢迪，王璐瑤，李 靜，張小鳳,2

(蚌埠醫(yī)學院1.第一附屬醫(yī)院中心實驗室；2.組織與移植安徽省重點實驗室；3.第一附屬醫(yī)院檢驗科，安徽 蚌埠 233004)

克羅恩病(Crohn’s disease，CD)是炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)的一種，近年來在我國的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢[1]。CD的主要病理學改變?yōu)榉翘禺愋?、肉芽腫性炎癥，病變可累及口腔至肛管整個消化道，但主要以回腸和結腸為主。雖然手術可以切除病變腸管但仍無法治愈該病，患者仍然面臨術后復發(fā)的問題。采用藥物誘導緩解和維持緩解仍是CD的主要治療方式。然而遺憾的是，當前針對CD治療的藥物均存在一定程度不足，更為安全、有效的藥物亟待開發(fā)。氯喹(Chloroquine，CQ)是一種經典的抗瘧原蟲藥物，但新近的報道顯示CQ還具有抗炎和免疫調節(jié)作用[2]，且已被證實對多種免疫相關性疾病有治療作用，例如：系統性紅斑狼瘡(SLE)、艾滋病(AIDS)等。CD也是一種免疫相關性疾病，而CQ在CD領域的研究還并不充分。本研究采用IL-10-/-小鼠作為CD動物模型[3]，觀察CQ對CD樣腸炎的作用效果及可能機制，重點探討對小鼠腸黏膜免疫及腸屏障功能的影響，以期為CD的藥物治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料選取15周齡雄性IL-10-/-小鼠及野生型小鼠(wild type，WT)，飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境(組織移植安徽省重點實驗室)，體重為(28～32)g，環(huán)境溫度為(23±2)℃，小鼠自由飲水，常規(guī)飼料喂養(yǎng)。CQ、異硫氰酸(FITC)-葡聚糖購于Sigma Chemicals公司(St. Louis, MO, USA)；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、轉化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)及酶聯免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購于R&D公司(Emeryville，CA，USA)；Claudin、Occludin、p-JAK2、p-STAT3、JAK2、STAT3及β-actin一抗夠買于R&D公司(Emeryville、CA、USA)。

1.2 干預方法15周齡IL-10-/-小鼠隨機分為氯喹治療組(CQ組，n=8)和模型組(Model組，n=8)。CQ組干預方法：單次給藥劑量為100mg/kg體質量，藥物溶于0.2mL生理鹽水中，灌胃給藥，1次/d[4]；Model組每日給予0.2mL生理鹽水灌胃。另取8只WT小鼠作為正常對照，僅用于證實IL-10-/-小鼠自發(fā)性腸炎的存在。干預4周后處死小鼠并進行相關的檢測分析。

1.3 觀察指標及檢測方法

1.3.1 評估CQ干預對IL-10-/-小鼠腸道炎癥的影響 (1)腸炎組織學評分：小鼠結腸組織經HE染色后在光學顯微鏡下觀察并參考Spencer推薦的炎癥評分(inflammatory score)[5]，對兩組小鼠結腸組織的炎癥程度進行評估，每張切片選取三個不同的視野分別評分，評分量為0分～4分，炎癥越重評分越高，最后取平均數作為最終的評分結果。(2)檢測兩組小鼠結腸組織炎癥介質水平：采用ELISA檢測小鼠結腸組織中TNF-α、IL-6以及TGF-β的含量，具體操作參照ELISA試劑盒說明書。

1.3.2 流式細胞檢測實驗 分離小鼠腸系膜淋巴結，置于5mL 1640培養(yǎng)基中，用玻璃勻漿器研磨，PBS洗一遍，200目濾網過濾掉組織，分離出的單個核細胞采用臺盼藍染色計數，取2×106個細胞接種于48孔板中，加細胞刺激劑及BFA孵育6h，收集細胞進行表面染色及細胞內細胞因子染色，檢測Th1(CD3+、CD4+、IFN-γ+)、Th17(CD3+、CD4+、IL-17A+)、Treg(CD4+、CD25+、Foxp3+)細胞比例，并用FlowJo-V10軟件對結果進行分析。

1.3.3 腸通透性檢測實驗 小鼠禁食4h后，用大分子物質FITC-葡聚糖分別對兩組小鼠進行灌胃處理，劑量為600mg/kg，待4h后通過頸椎脫臼的方法處死小鼠并從心臟抽取1mL血液，室溫下放置1h后分離血清分光光度計(490nm)檢測血清中FITC含量。

1.3.4 免疫熒光檢測實驗 組織切片脫蠟水化后，使用檸檬酸鹽抗原修復液進行抗原修復(高壓10min)，置于室溫中冷卻。去離子水室溫條件下孵育20min，除去內源性過氧化物酶。封閉用山羊血清工作液覆蓋于組織面上，37℃溫箱孵育20min后倒去血清，勿洗。滴加一抗工作液(兔單克隆Claudin抗體及兔單克隆Occludin抗體，稀釋濃度1∶200)覆蓋于組織表面，4℃過夜。熒光二抗覆蓋于組織表面(山羊抗兔IgG H&L，稀釋濃度1∶200)，37℃溫箱孵育45min(避光)。在黑暗條件下吸棄二抗 (不再沖洗)，加入DAPI染液(2.5μg/mL)，室溫孵育20min，在黑暗條件下使用抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察實驗結果。

1.3.5 Western blot檢測實驗 提取胞漿及核蛋白，經Bradford定量，煮沸變性后，每孔加入35μg蛋白，經電泳、轉膜、封閉后，再加入Claudin、Occludin、JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3和β-actin一抗稀釋液(1∶1000)，放置在4℃搖床，12h后滴加二抗，洗膜，滴加ECL顯影液，即可對結果進行分析。

1.4 統計學分析用SPSS 23.0軟件對實驗數據進行分析，用“均數±標準差”表示計量資料，組間的比較采用t檢驗。P<0.05表示差異具有顯著性。

2 結果

2.1 CQ干預對IL-10-/-小鼠腸道炎癥的影響如圖1所示，正常WT小鼠結腸黏膜形態(tài)完好，未見明顯炎癥細胞浸潤；Model組小鼠結腸黏膜見大量炎癥細胞浸潤，部分區(qū)域融合成團(圖1A黑色箭頭處)；CQ組小鼠結腸黏膜內可見少量炎癥細胞浸潤。CQ組小鼠結腸組織炎癥評分顯著低于Model組(P<0.05)；促炎因子TNF-α和IL-6水平顯著低于Model組(P<0.05)，抗炎因子TGF-β水平顯著高于Model組(P<0.05)。

圖1 CQ干預對克羅恩病模型小鼠腸道炎癥的影響

注：A為小鼠結腸組織HE染色結果(×200)；B為小鼠結腸炎癥評分的統計學比較；C為小鼠腸系膜淋巴結炎癥介質水平的統計學比較。vs Model組，aP<0.05

2.2 CQ干預對IL-10-/-小鼠腸黏膜免疫反應的影響

如圖2所示：CQ組小鼠的Th1、Th17細胞比例顯著低于Model組(P<0.05)，Treg細胞比例顯著高于Model組(P<0.05)。

圖2 CQ干預對克羅恩病模型小鼠免疫系統的影響

注：A和B為兩組小鼠Th1細胞含量的比較；C和D為兩組小鼠Th17細胞含量的比較；E和F為兩組小鼠Treg細胞含量的比較。vs Model組，aP<0.05

2.3 CQ干預對IL-10-/-小鼠腸屏障功能的影響

如圖3所示：CQ組小鼠腸黏膜對FITC-葡聚糖的通透性較Model組顯著降低(P<0.05)。

圖3 CQ干預對克羅恩病模型小鼠腸黏膜屏障通透性的影響

注： vs Model組，aP<0.05

2.4 CQ干預對IL-10-/-小鼠腸黏屏障結構的影響

如圖4所示：CQ組小鼠腸粘膜細胞緊密連接蛋白Claudin和Occludin的蛋白表達量顯著高于Model組(P<0.05)。

2.5 CQ干預對IL-10-/-小鼠JAK2/STST3信號通路的影響如圖5所示：CQ組小鼠腸黏膜JAK2/STAT3的磷酸化水平顯著低于Model組(P<0.05)。

圖4 CQ干預對克羅恩病模型小鼠腸黏膜屏障結構的影響

注：A和B為兩組小鼠結腸黏膜上皮細胞緊密連接蛋白Claudin和Occludin的表達情況；C為兩組小結腸黏膜緊密連接蛋白Claudin及Occludin的Western blot半定量檢測結果；D為兩組小鼠結腸黏膜緊密連接蛋白Claudin及Occludin表達水平的統計學比較。 vs Model組，aP<0.05

圖5 CQ干預對克羅恩病模型小鼠腸黏膜信號通路的影響

注：A為兩組小鼠的腸黏膜JAK2/STAT3 信號通路蛋白的Western blot半定量檢測結果；B為兩組小鼠的腸黏膜JAK2/STAT3 信號通路蛋白表達水平的統計學比較。vs Model組，aP<0.05

3 討論

既往，CD主要見于歐美高加索人種，但近年來包括我國在內的亞洲地區(qū)發(fā)病率呈現逐年升高的趨勢[6]，而與患者日漸增多形成反差的是相對落后的診療水平。當前，在我國提高CD的治療效果具有迫切的現實意義。雖然CD的發(fā)病機制并不明確，但腸黏膜免疫異常及腸屏障功能受損是最受認可的發(fā)病機制假說之一。圍繞這一靶點進行藥物治療探索，有望為CD治療提供新的選擇。鑒于CQ的抗炎和免疫調節(jié)功能，我們嘗試分析其是否對CD這種免疫性腸炎具有療效，并進一步分析可能的機制。

本研究選用IL-10-/-小鼠作為CD的動物模型。該品系小鼠在SPF級環(huán)境中，飼養(yǎng)至第15周時可形成穩(wěn)定的、持續(xù)性的結腸炎[3]。CQ干預結束后，我們分析發(fā)現CQ可顯著抑制IL-10-/-小鼠結腸炎癥，黏膜中促炎介質IL-6和TNF-α水平顯著降低，而抗炎因子TGF-β水平顯著升高，這一組結果提示CQ對CD樣腸炎具有一定治療效果。CD腸黏膜免疫反應類型以Th1、Th17為主，而Treg在免疫炎癥的發(fā)生過程中起抑制作用[7]。通過FCM檢測我們發(fā)現CQ組小鼠腸系膜淋巴結中Th1和Th17的細胞比例顯著減少，而Treg的細胞比例顯著升高，這提示CQ具有顯著的免疫調節(jié)功能。腸屏障受損是CD疾病發(fā)生的重要環(huán)節(jié)，因此維持良好的腸屏障功能可有效地控制和緩解CD的病情發(fā)展[8-9]。通透性實驗證明CQ干預后小鼠的腸屏障功能得到了顯著的改善；IF及Western blot結果顯示CQ干預后增加了小鼠腸黏膜緊密連接蛋白Claudin及Occludin的表達量，這提示CQ干預后小鼠的腸屏障結構得到了顯著的保護。JAK2/STAT3是調控炎癥的關鍵信號通路，其下游產生的炎癥介質IL-6和TNF-α等具有直接破壞腸黏膜屏障的作用；并可引發(fā)炎癥級聯放大，誘發(fā)急性炎癥和維持慢性炎癥[10-11]，Western blot結果顯示CQ組p-JAK2和p-STAT3的水平顯著低于Model組，這說明CQ干預抑制了JAK2和STAT3的磷酸化激活，這可導致IL-6 和TNF-α等促炎介質釋放減少，從而減輕對腸黏膜緊密連接蛋白的破壞[12]，這提示CQ可能通過抑制JAK2和STAT3的磷酸化激活而發(fā)揮對腸黏膜屏障的保護作用。

我們的研究結果具有潛在的臨床應用價值。目前CD的常規(guī)治療藥物有氨基水楊酸類，糖皮質激素類、免疫調節(jié)劑類及生物制劑類[13]，雖然可選治療藥物種類很多，但仍然存在效果不穩(wěn)定、藥物抵抗以及毒副作用大等問題，臨床上仍要開發(fā)高效、低毒的新藥物以滿足不斷增長的治療需求[14]。

我們的研究存在不足之處：雖然研究選擇的IL-10-/-小鼠為國際公認CD動物模型[3]，但研究設計之初并沒有設置正常對照組以證實所選擇模型具有自發(fā)性腸炎。本研究僅是增補了正常小鼠結腸組織HE染色，這雖然可以確定所選擇的CD模型存在自發(fā)性腸炎，但無法證明CQ干預IL-10-/-小鼠后腸炎改善的程度等情況，我們將在今后的研究中考慮更為全面和深入地評估CQ對腸炎的影響與機制。

綜上，CQ可通過調節(jié)腸黏膜免疫反應及保護腸屏障功能發(fā)揮改善CD樣腸炎的作用，其作用機制可能部分與抑制JAK2/STAT3信號通路有關。