環(huán)磷酰胺對乳腺癌增殖、遷移和凋亡的影響及其機制

張臘梅，李 竹，李子濤，袁 琳，劉建廷，李彩娟

(1.牡丹江醫(yī)學院；2.牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157011)

乳腺癌是一個日益嚴重的公共衛(wèi)生問題，雖然早期治療能夠有效降低乳腺癌死亡率，但轉移仍是癌癥相關死亡的重要原因[1-2]。乳腺癌轉移是由多重化學變化引起的，如組織固有性降低、細胞外基質和基底膜結構下降，蛋白水解增加等[3]。MMP9的表達與乳腺癌的侵襲和轉移相關[4]。本研究分析CTX對乳腺癌MCF-7細胞的增殖、遷移及細胞凋亡的影響，并進一步研究CTX對MMP9表達的影響，為深入研究乳腺癌治療的分子機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料CTX購自于Sigma公司(C0768MSDS)；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶-EDTA消化液、購自于美國hyclone公司；胎牛血清購自于杭州四季青公司；Trizol ReagenT購自于Invitrogen公司；MMP9、β-actin引物由南京abm公司合成；反轉錄試劑盒、2×Taq PCR MasterMix、瓊脂糖購自于北京陽光思特生物科技有限公司；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術有限公司。

1.2 數(shù)據(jù)庫資料MMP9基因的表達數(shù)據(jù)來自GEPIA數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫中的腫瘤和正常樣品來自于癌癥基因組圖譜(TCGA)和基因型組織表達(GTEx)項目，包含9736種腫瘤樣本和33種癌癥類型。通過GEPIA數(shù)據(jù)庫分析MMP9在癌中的表達差異；Kaplan-Merier數(shù)據(jù)庫分析MMP9與乳腺癌總生存率相關性。

1.3 細胞培養(yǎng)及藥物處理人乳腺癌細胞MCF-7受贈于哈爾濱醫(yī)科大學(細胞源于美國ATCC細胞庫)，培養(yǎng)于含體積分數(shù)10%FBS(胎牛血清)的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于濕度95%、5%CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞融合度達80%～90%，且狀態(tài)良好，即可進行傳代培養(yǎng)。根據(jù)CTX濃度設為1個對照組(0mmol/L)，3個實驗組(5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L)。

1.4 MTT檢測MCF-7細胞增值活性將MCF-7細胞按5×103個細胞/mL接種于96孔板，每孔100L，設5個重復孔。細胞鋪滿后，棄去舊培養(yǎng)基，實驗孔加入不同濃度CTX(5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L)的細胞培養(yǎng)液100μL，同時設置調零孔、對照組，分別培養(yǎng)24h、36h、48h后每孔分別加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。每孔分別加入150μL DMSO，震蕩器震蕩10min。在酶標儀上選擇490nm波長測定光密度(OD)值。

1.5 細胞劃痕修復實驗MCF-7細胞接種于6孔板，待細胞密度達到80%～90%后，在6孔板內垂直劃痕，PBS沖洗細胞表面3次，分別加入含不同濃度CTX的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h。對照組給予同等不含藥物的完全培養(yǎng)基。分別在劃痕后0h、24h于顯微鏡下觀察劃痕區(qū)的變化，標記并拍照。計算劃痕愈合率%=[劃痕寬度(初始時間)-劃痕寬度(檢測時間)]/劃痕寬度(初始時間)×100%。

1.6 RT-PCR檢測MMP9基因表達情況收集4組MCF-7細胞后，Trizol試劑盒提取細胞總RNA，檢測細胞濃度和純度后，按照反轉錄試劑盒說明書合成cDNA。MMP9上游引物5’-TGTACCGCTATGGTTACACTCG-3’,長度22bp；下游引物5’-GGCAGGGACAGTTGCTTCT-3’，長度19bp；β-actin內參上游引物5’-GATTCCTATGTGGGCGAC-3’，長度18bp；內參下游引物5’-TTGTAGAAGGTGTGGTGCC-3’，長度19bp。擴增反應條件：94℃預變性3min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環(huán)；最后72℃終延伸10min。取5μL PCR終產物行1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測基因相對表達量。

1.7 TUNEL法檢測細胞凋亡率MCF-7細胞長滿到90%，胰酶消化細胞，收集于15 mL離心管，離心5min，加入培養(yǎng)基使細胞被吹打成細胞懸液，每孔1mL，接種于鋪有爬片的6孔板內，放5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。貼壁細胞融合度達到80%～90%時，給予不同濃度CTX，繼續(xù)孵育24h。參照Tunel試劑盒進行固定、漂洗、Tunel反應液及染色。用激光共聚焦顯微鏡進行拍照。每張切片隨機選取5個視野(×100)，計數(shù)凋亡細胞和總細胞，計算細胞凋亡率(%)=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.8 統(tǒng)計學方法實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗符合正態(tài)分布，以“均數(shù)±標準差”表示，采用t檢驗，組間比較用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MMP9基因表達規(guī)律及預后分析MMP9基因在乳腺癌(BRCA)中高表達，見圖1A。Kaplan-Meier分析表明，MMP9基因高表達組患者的總體生存率低于MMP9低表達組，見圖1B。

圖1 MMP9基因表達和預后情況

注:圖1A:MMP9在乳腺癌中的表達情況；圖1B:MMP9高表達的乳腺癌患者總體生存率低于MMP9低表達患者

圖2 MTT檢測CTX對MCF-7細胞增殖活性的影響

2.2 MTT法篩選出藥物濃度及其對細胞增殖的影響MTT結果顯示，與對照組(0mmol/L)相比，CTX(5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L)處理MCF-7細胞24h、36h、48h后均能顯著抑制細胞的增殖水平,且隨著時間的增加而呈劑量依賴性，見圖2。

2.3 CTX對MCF-7細胞遷移能力的影響CTX作用于MCF-7細胞0h、24h后，在倒置顯微鏡下觀察細胞的遷移情況。顯微鏡下結果顯示，與對照組相比，實驗組(5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L)的遷移能力隨著藥物劑量的增加而降低，見圖3。

圖3 劃痕實驗檢測CTX對MCF-7細胞遷移的影響(×100)

2.4 CTX對MCF-7增殖和凋亡的影響激光共聚焦顯微鏡結果顯示，細胞凋亡率對藥物劑量增加而增加，見圖4。

圖4 TUNEL實驗檢測CTX對MCF-7細胞增殖凋亡的影響(×100)

2.5 CTX對MMP9mRNA表達的影響RT-PCR結果顯示，MMP9的表達水平隨著CTX劑量的增加而降低，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖5。

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤。盡管積極的治療策略和早期發(fā)現(xiàn)方法取得了進步，但腫瘤復發(fā)[5]仍然是乳腺癌患者與癌癥相關的死亡的主要原因。通常復發(fā)的腫瘤通常更具侵襲性，具有高轉移潛力，并且會對其治療產生耐受性，最終導致不良的預后。因此有效識別與這些現(xiàn)象相關的生物學事件和分子靶標將有助于改善治療和預后[6]。

圖5 RT-PCR檢測CTX對MCF-7細胞的影響

MMP9常在不同的惡性腫瘤中表達。許多研究已經(jīng)探索了MMP9作為不同類型癌癥的生物標志物。MMP9主要通過細胞外基質(ECM)的降解(例如，I型、II型和IV型膠原)、上皮細胞向間充質細胞的轉化和侵襲而導致多種腫瘤類型的細胞過程[7]。MMP9表達的增加與侵襲性表型和乳腺癌[8]、卵巢癌[9]、鼻咽癌[10]和胃癌[11]預后不良有關。MMP9在腫瘤細胞中的高表達與較高的淋巴結轉移率[12-13]和遠處轉移率[14]以及較差的無復發(fā)生存率[15-16]有關。這表明，MMP9的表達具有腫瘤和組織特異性，可在不同的腫瘤類型中發(fā)揮不同的功能?；贕EPIA數(shù)據(jù)庫結果提示，乳腺癌中MMP9的表達明顯高于正常組織中的表達。與乳腺癌癌旁組織相比，MMP9高表達的乳腺癌患者預后有著較短的生存率，這與前面一些學者的研究結果相一致。為進一步闡述CTX在乳腺癌治療中的作用機制，用不同濃度CTX處理MCF-7細胞后，采用MTT法、TUNEL法分別檢測MCF-7細胞生長活性、凋亡。結果表明，CTX能夠抑制MCF-7細胞生長并促進細胞凋亡，且隨著藥物劑量的增大，抑制效果加強。這說明CTX在乳腺癌細胞生長進程中，和促進細胞凋亡方面發(fā)揮著抑制作用。

致癌的幾個重要過程，包括侵襲、轉移和血管生成與細胞外微環(huán)境有關，MMP9降解細胞外基質蛋白、改變細胞間與細胞外基質的連接、裂解細胞表面蛋白和細胞外環(huán)境，促進乳腺癌侵襲和轉移[17-20]，本研究探索了CTX在乳腺癌遷移中的作用，用劃痕實驗檢測MCF-7細胞遷移情況，結果顯示，實驗組的MCF-7遷移細胞量低于對照組的細胞量，提示CTX能夠抑制乳腺癌的遷移。通過PCR檢測MMP9mRNA的表達變化，結果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，實驗組的MMP9mRNA的表達低于對照組，提示CTX可以下調MMP9的表達水平。因此，我們推測CTX可能通過下調MMP9，發(fā)揮抑制MCF-7細胞的遷移的作用。

綜上所述，CTX能夠抑制MCF-7細胞增殖、遷移，促進細胞凋亡，并且抑制MMP9基因在乳腺癌中的表達，改善患者的預后。但CTX具有一定的毒副作用，在乳腺癌治療中的具體分子機制有待進一步的深入研究。